способ получения средства, обладающего противоатеросклеротическим, антилитогенным, кардиотоническим, антиаллергическим и иммуномодулирующим действием
Классы МПК: | |
Автор(ы): | Оганесян Эдуард Тоникович, Симонян Ашот Вагаршакович |
Патентообладатель(и): | Оганесян Эдуард Тоникович, Симонян Ашот Вагаршакович |
Приоритеты: |
подача заявки:
1992-09-11 публикация патента:
09.06.1995 |
Использование: изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической активности и касается способа получения фитосредства, обладающего одновременно пятью активностями: а именно противосклеротическим, антимитогенным, кардиотоническим, антиаллергическим и иммуномодулирующим действием. Сущность способа заключается в экстракции отходов производства экстракта чабреца, шрота после экстракции травы 30% этиловым спиртом, 96% этанолом методом реперколяции в батарее из четырех перколяторов с последующим осаждением целевого продукта водой, отделении осадка и его высушивании. Технический результат заключается в разработке комплексного препарата, обладающего одновременно пятью активностями на уровне современных химико-терапевтических препаратов. 11 табл.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11
Формула изобретения
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВОАТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКИМ, АНТИЛИТОГЕННЫМ, КАРДИОТОНИЧЕСКИМ, АНТИАЛЛЕРГИЧЕСКИМ И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ, путем экстракции шрота чабреца, полученного после экстракции травы чабреца 30%-ным этиловым спиртом, 96%-ным этиловым спиртом методом реперколяции в батарее из четырех перколяторов с последующим осаждением целевого продукта водой, отделением осадка и его высушиванием.Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к производству лекарственных препаратов из растительного сырья. Технический результат изобретения заключается в разработке препарата, обладающего одновременно пятью активностями. Цель достигается экстракцией шрота чабреца (после получения экстракта чабреца) методом реперколяции в батарее из четырех перколяторов, разбавлении спиртового экстракта водой, отделении выделившегося осадка. П р и м е р. В батарее из четырех перколяторов, загруженных по 25 кг шрота чабреца каждый, после экстракции травы чабреца 30% этанолом, проводят экстракцию этиловым спиртом в соотношении сырье-экстрагент 1:5 методом реперколяции. Спиртовое извлечение из четвертого перколятора (125 кг) разбавляют водой (250 кг) до содержания этилового спирта 30% Выделившийся осадок отделяют, сушат и измельчают. Выход целевого продукта составляет 1250 г (5%). Предлагаемый способ позволяет существенно повысить выход, расширить спектр фармакологического действия, а также значительно упростить технологическую схему получения целевого продукта. По предлагаемому способу освобожденный от целевого продукта раствор 30% этилового спирта без дополнительной обработки используется далее для производства жидкого экстракта чабреца, применяемого в фармацевтической промышленности для получения лекарственного препарата Пектуссин. Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить выход (на 25%), расширить спектр фармакологического действия, упростить технологическую схему получения целевого продукта, а также создать единый замкнутый цикл по комплексной и безотходной переработке растительного сырья травы чабреца. Биологические исследования средства проводились в лабораториях Пятигорского фармацевтического института и аллергоиммунологическом центре г. Пятигорска. Однократное введение средства способно отразиться на уровне сахара крови и содержании гликогена в мышцах, причем эти изменения зависят от дозы вводимого средства и различны в различных типах мышц. Повышение сахара в крови отмечалось лишь при введении 100 мг/кг средства (на 25,4% р < 0,001). Наряду с этим увеличение содержания гликогена в мышцах матки имело место при введении как 100 мг/кг средства (на 120,6% р<0,001), так и 10 мг/кг средства (на 45,7% р<0,001) в мышцах сердца наиболее отчетливо при введении 10 мг/кг средства (на 21,4% р<0,05), тогда как в мышцах бедра лишь при введении 100 мг/кг средства (на 42,9% р<0,01) (табл.1). Более однородные результаты выявились при курсовом введении средства в дозе 10 мг/кг, характеризовавшемся повышением сахара крови (на 28,7% р<0,001), увеличением содержания гликогена в мышцах матки на 53,3% р<0,001), увеличением содержания гликогена в мышцах сердца на 34,2% (р<0,001), и в мышцах бедра на 32,1% (р< 0,001). Как при однократном, так и при курсовом введении средства бросается в глаза особенно выраженное повышение содержания гликогена в гладких мышцах матки, затем в мышцах сердца и (в наименьшей степени) в поперечно-полосатых мышцах бедра. Накопление гликогена в мышцах матки, сердца и соматических мышцах следует расценивать как биохимическую основу увеличения энергетических резервов этих органов. Об увеличении энергетических резервов под влиянием приема средства указывает также характер сдвигов в содержании АТФ и активности АТФ-азы в исследуемых органах (табл.2). Обращает на себя внимание отсутствие существенных сдвигов в содержании АТФ в поперечно-полосатых мышцах бедра и отчетливое его увеличение в гладких мышцах матки и особенно в мышцах сердца, происходящее в последних даже при однократной даче средства. В мышцах сердца под влиянием однократного введения срества в дозе 10 мг/кг содержание АТФ возросло на 82,3% (р<0,01), а при введении в дозе 100 мг/кг на 123,3 (р < <0,001). Курсовое введение средства в дозе 10 мг/кг обусловило увеличение содержания АТФ на 81,1% (р<0,001). В мышцах матки повышение содержания АТФ происходило лишь при курсовом применении средства (на 192,3% р<0,001). Таким образом, характерной особенностью действия средства является повышение энергетических ресурсов, причем в первую очередь в мышцах сердца и матки, наступающее почти сразу после введения даже при однократном приеме препарата и свидетельствует о его кардиотоническом действии. Влияние средства на показатели углеводного обмена проводилось также у крыс с экспериментальной гиперхолестеринемией на трех группах животных (по 13-19 крыс в группе) обоего пола массой 200-250 г. Первая группа интактные крысы, вторая контрольные крысы с экспериментальной гиперхолестеринемией, которая вызывалась дачей с кормом в течение 130 дней холестерина в дозе 0,2 г/кг, веса, холевой кислоты 10 мг/кг, мерказолила 25 мг/кг, подсолнечного масла 0,5 мл (так называемая атерогенная диета), третья группа опытные крысы, получавшие с такой же атерогенной диетой средство в дозе 10 мг/кг. В этих опытах у крыс, получавших на фоне холестериновой диеты средство, показано увеличение сахара в сердце на 31,1% в сравнении с контрольными крысами (25322,5 мг% против 19314,7 мг% Р <0,05) и увеличение на 40,6% в сравнении с интактными крысами (25322,5 мг% против 18018 мг% р <0,02). При проведении исследований в сыворотке крови определяли холестерин (по Мрскоса и Товарека, 1963), -липопротеиды (по А.Н.Климову с соавт. 1966), фосфолипиды (по фосфору, определяемому по Фиске-Суббароу), вычисляли коэффициент холестерин/фосфолипиды, в ткани аорты определяли холестерин и -липопротеиды (по Т.Н.Ловягиной и Э.Б.Баньковской, 1965), в тканях печени и сердца холестерин. Результаты полученных определений обрабатывали методом вариационной статистики. Изучение действия исследуемого средства на показатели холестеринового обмена у здоровых животных было выполнено на 50 белых крысах. Средство вводили ежедневно в течение 9 дней через зонд в желудок в дозе 10 мг/кг в 0,5 подсолнечного масла. Контролем служили крысы, которым вводили подсолнечное масло, и интактные. Проведенное курсовое введение средства привело к достоверному уменьшению холестерина печени на 13%/330,68,3 мг. против 382,210,5 мг/, р <0,001, и не вызывало существенных изменений других определяемых показателей крови и органов. Изучение гипохолестеринемического и противоатеросклеротического действия средства проводили в опытах на 47 кроликах. Препарат скармливали в дозе 10 мг/кг ежедневно в течение 2 мес на фоне даси холестерина (200 мг/кг) или в течение 1 мес после окончания предварительного двухмесячного скармливания холестерина. При одновременном скармливании кроликам средства и холестерина происходило более медленное, чем в контроле (при скармливании кроликам только холестерина) развитие гиперхолестеринемии и гипербета-липопротеидемии (табл. 4). Содержание в крови холестерина к концу опыта отличалось от контроля на 57,96% (49041:5 мг% в контроле и 206,215,5 мг% в опыте), р < < 0,001, содержание беталипопротеидов снизилось на 39,85% (65244,6 мг% против 1084142 мг% ), р <0,02, величина холестерин/фосфолипиды на 40,86% (1,100,08 против 1,860,084) р<0,001. Таким образом, введение средства значительно задерживало нарушение липидного обмена и развитие экспериментального атеросклероза. Сходная картина наблюдалась и в опытах на крысах (табл.5). Экспериментальная гиперхолестеренемия у крыс вызывалась путем содержания животных в течение 130 дней на атерогенной диете, содержащей холестерин, мерказолил и холевую кислоту (из расчета соответственно 200 мг, 5 мг и 2 мг на одну крысу в день). Эти животные составляли контрольную группу. Крысы опытной группы на фоне описанной диеты получали исследуемый препарат в дозе 10 мг/кг. В качестве второй контрольной группы использовались также интактные крысы. Как показали эти опыты при введении крысам с пищей холестерина, мерказолила и холиевой кислоты наблюдалось статистически достоверное возрастание холестерина и беталипопротеидов сыворотки крови, холестерина аорты, печени и сердца по сравнению с этими показателями у интактных животных. Добавление к атерогенному корму средства уменьшало содержание холестерина и беталипопротеидов в сыворотке крови и холестерина в органах. Количество холестерина в сыворотке крови в опытной группе уменьшилось на 32,18% (49,14,2 мг% против 72,43,9 мг%) р <0,001, количество бета-липопротеидов уменьшилось на 26,85% (92,23,8 мг% против 127,86,9 мг% р<0,001). Содержание холестерина в аорте у опытных животных было на 28,52% ниже, чем у контрольных (219,69,5 мг% против 307,318,6 мг% р <0,001), а холестерина печени на 22,5% ниже (320,210,8 мг% против 413,331 мг% р < 0,001). Значения всех определяемых показателей липидного обмена крыс опытной группы приблизились к их значениях у интактных животных, т.е. статистически достоверно от них не отличались. Последнее позволяет заключить, что как и у кроликов у белых крыс в условиях экспериментальной гиперхолестеринемии исследуемое средство способно задерживать развитие нарушений со стороны липидного обмена. Заслуживающие внимания результаты были получены также при применении средства в условиях обратного развития атеросклероза. Скармливание в течение 30 дней средства (в дозе 10 мг/кг) кроликам с экспериментальным атеросклерозом после прекращения 60-дневной дачи холестерина (в дозе 200 мг/кг) приводило к более быстрой, чем в контроле (при самопроизвольном обратном развитии атеросклероза) нормализации содержания в крови холестерина, беталипопротеидов и коэффициента холестерин/фосфолипиды (табл.6). Содержание холестерина в группе опытных кроликов снизилось за время введения средства на 70,773,8% тогда как в контрольной группе на 55,143,8, р <0,02. Содержание бета-липопротеидов уменьшилось в опыте на 65,595,14% а в контроле на 42,107,3% различие существенно, р < 0,02. Коэффициент холестерин/фосфолипиды в опытной группе был ниже, чем в контроле на 39,8% (1,530,22 против 0,920,1, р <0,05). Исследование аорты и печени также выявило отчетливое влияние средства на нормализацию холестерина и бета-липопротеидов (табл.7). В аорте кроликов опытной группы содержание холестерина было на 42,33, ниже, чем в контроле (512,6679 мг% против 889,03%54,2 мг% р < 0,01) и существенно не отличалось от его содержания у интактных кроликов (409,3136,1 мг% р <0,05).68,4 мг% р<0,02) и приближалось к уровню у интактных животных (717,5228,4 мг% р <0,05).
71 мг% против 973,484 мг% p< 0,01). Однако не вернулось к уровню интактных кроликов (310,5 19,1 мг% р <0,01).
Изучение противоаллергического действия средства проводили на модели реакции пассивной кожной анафилаксии у крыс (РПКА), опосредованной антителами класса IgЕ, которая является одним из наиболее часто используемых методов для оценки антиаллергической активности соединений. Средство вводили животным в желудок специальным зондом в виде суспензии (с добавлением 1-2 капель твина-80) в дозе 10 мг/кг в течение 24 дней. В качестве объекта сравнения использовали противоаллергический препарат диазолин, который вводили тем же способом в дозе 10 мг/кг. Контрольным крысам в желудок вводили по 1 мл растворителя (дист. вода) с добавлением 1-2 капель твина-80. Процент ингибирования реакции вычисляли по формуле: А(100 C100)/В, где А процент ингибирования РПКА, С мкг синего Эванса в участках кожи крыс, получавших средство, В мкг синего Эванса в участках кожи контрольных крыс. Результаты опытов статистически обработаны и приведены в табл.1. Таким образом, в эксперименте установлено выраженное противоаллергическое действие средства при его курсовом введении в дозе 10 мг/кг, проявляющееся в угнетении реакции гиперчувствительности немедленного типа у животных. Активность средства на данной патологической модели превышает таковую противоаллергического препарата диазолина почти в 2 раза. Учитывая имеющееся разрешение фармакологического комитета Минздрава СССР на апробацию средства на соответствующей категории больных в клинических условиях (протокол N 12 МЗ СССР от 24.6.88) и с учетом вновь выявленных противоаллергических свойств средства в экспериментальных условиях, сочли необходимым проведение дальнейших исследований средства у больных с иммуно- патологическими синдромами. Все больные были разделены на 3 группы: 1 группа состояла из 36 человек, получавших средство; 2 группа (контрольная) состояла из 18 человек, получавших известный апробированный иммуномодулятор нуклеиновокислый натрий (10); 3 группа (контрольная) состояла из 18 человек, получавших плацебо. В первую группу входили: 12 больных хроническим обструктивным бронхитом, 12 больных атопическим дерматитом. Во вторую группу входили: 6 больных хроническим обструктивным бронхитом, 6 больных псориазом, 6 больных атопическим дерматитом. Средство (0,25 г) и нуклеинат натрия (0,3 г) больные принимали по 1 таблетке 3 раза в день в течение 20 дней. Таблетки плацебо больные контрольной группы получали по такой же схеме. Иммунологическое обследование больных всех групп проводили до и после соответствующего курса лечения. Для оценки иммунного статуса применяли тесты I и II уровней иммунологического скрининга. Выделение лимфоцитов (мононуклеарных клеток) проводилось путем центрифугирования крови в градиенте плотности фиколла верографина (d 1,077). Определяли: число лейкоцитов (тыс/мкл), абсолютное число лимфоцитов и процент по отношению к числу лейкоцитов, абсолютное и относительное количество Е- и Ем-розеткообразующих лимфоцитов по методу Tondol, в модификации Р.В.Петрова, содержание теофилинрезистентных и теофиллинчувствительных клеток, содержание сывороточных иммуноглобулинов классов А, М, G методом радиальной иммунодиффузии в агаровом геле, а также уровень общего lgE иммуноферментным методом в тест-системах, концентрацию циркулирующих иммунных комплексов методом преципитации с 3,5% раствором полиэтиленгликоля, поглотительную способность нейтрофилов, их миелопероксидазную активность. Статистическая обработка результатов включала определение средних величин со средней ошибкой и достоверности различий по критерию Стъюдента. Кроме того, использован метод характеристических интервалов, с помощью которых установлены границы нормы для изучаемых показателей. Результаты исследования средства и нуклеината натрия у больных хроническим обструктивным бронхитом представлены в табл.2. Сравнение средних величин иммунологических показателей до и после лечения при использовании исследуемых препаратов показало, что после лечения с применением средства наблюдалось повышение исходно сниженных показателей относительного и абсолютного количества Т-лимфоцитов соответственно, с 45,33,7% до 58,1 3,1% (р < 0,01 и с 0,76 0,18109/л до 1,4 0,2110 9/л (р <0,05). Характерно также снижение уровня IgM c 1,3 0,15 г/л до 0,97 0,12 г/л (р<0,05 и нарастание содержания IgG в сыворотке крови с 8,0 0,83 г/л до 15,0 1,95 г/л (р<0,01).1,4% до 11,2 2,2% (р <0,01) и с 0,11 0,01109/л до 0,160,012109/л (р<0,05), а также на фагоцитарную активность нейтрофилов, которая повысилась с 20,60,9% до 24,41,4% (р < 0,05). У больных контрольной группы, получавших плацебо, достоверных изменений средних величин иммунологических параметров не установлено.
Анализ результатов с учетом уровня исходных показателей (сниженные, повышенные, нормальные) выявил выраженное иммунолодулирующее действие средства и нуклеината натрия. В то же время, отмечено более выраженное влияние средства на клеточный иммунитет, а также более отчетливое переключение синтеза иммуноглобулинов с М на G, что свидетельствует о нормализации кооперации между иммунокомпетентными клетками. Результаты исследования средства и нуклеината натрия у больных псориазом представлены в табл.10. При оценке иммунного статуса у больных псориазом отмечено преимущественное поражение клеточного звена иммунитета, которое заключалось в уменьшении общего количества Т-лимфоцитов, дисбалансе субпопуляций Т-клеток. Сравнение средних величин иммунологчесих показателей до и после лечения в трех группах показало, что после лечения средством наблюдалось повышение исходно сниженного содержания Т-лимфоцитов, как относительного с 44,63,1% до 59,35,2% (Р<0,05), так и абсолютного с 0,810,09109/л до 1,320,1109/л, (р<0,05), а также снижение исходного повышенного уровня IgG в сыворотке крови с 21,43,2 г/л до 13,92,1 г/л (р <0,05). Использование методов характеристических интервалов позволило установить высокую эффективность средства и нуклеината натрия, оказывающих иммуномодулирующее действие и нормализующих многих нарушенные звенья иммунитета путем повышения сниженных и снижения повышенных показателей. В то же время следует отметить некоторые различия в действии двух препаратов. Так, средство оказывает более выраженное действие на Т-звено иммунитета, которое заключается в нормализации общего количества Т-лимфоцитов, а также их субпопуляций. Следует отметить снижение исходно повышенных уровня I и содержания циркулирующих иммунных комплексов. Результаты исследования средства и нуклеината натрия у больных атопическим дерматитом представлены в табл.II. При оценке иммунного статуса у больных атопическим дерматитом установлено достоверное повышение уровней общего IgE и IgM на фоне снижения уровня сывороточного IgА и поглотительной способности нейтрофилов. Анализ средних показателей у больных, получавших средство, выявил достоверное снижение уровня общего IgE с 388,9 89,2 МЕ/мл до 124,3 44,6 МЕ/мл (р <0,01), повышение фагоцитарной активности нейтрофилов с 17,4 1,03% до 22,8 0,87 (р <0,01) и фагоцитарного числа с 1,68 0,08 до 1,92 0,07 (р <0,01). Использование метода характеристических интервалов дало возможность установить характер действия изучаемого средства на иммунологические показатели в зависимости от уровня исходных показателей и в сопоставлении с группами больных, получавших нуклеиновокислый натрий и плацебо. Из таблицы 11 видно, что нуклеиновоислый натрий оказывает более выраженное влияние на исходно сниженные показатели поглотительной способности нейтрофилов, повышая фагоцитарную активность на 39,6% а фагоцитарное число на 34,1% У больных, получавших средство, эти показатели повысились соответственно на 18,2% и 32,9% В то же время у средства выявлено отчетливое противоаллергическое действие, что подтверждается выраженным снижением уровня общего IgE у 82% больных. При лечении нуклеанатом натрия данный эффект отсутствовал. У всех больных, получавших иммунокоррегирующую терапию, нормализация иммунного статуса сопровождалась позитивным клиническим эффектом. Так, у больных с хроническим обструктивным бронхитом, получавших средство, положительный эффект зарегистрирован у 83,3% больных (у 6 хороший, у 4 удовлетворительный, у 2 неудовлетворительный), получавших нуклеиновокислый натрий 66,7% ) у 2 хороший, у 2 удовлетворительный, у 2 неудовлетворительный), получавших плацебо у 16,6% (у 1 удовлетворительный, у 5 неудовлетворительный). У больных псориазом под влиянием средства положительный эффект наблюдался у 75% больных (у 3 хороший, у 6 удовлетворительный, у 3 неудовлетворительный), под влиянием нуклеиновокислого натрия у 66,7%), у 2 хороший, у 2 удовлетворительный, у 2 неудовлетворительный), под влиянием плацебо у всех больных клинический эффект отсутствовал. У больных атопическим дерматитом лечение средством дало положительные результаты у 91,7% больных (у 6 хорошие, у 5 удовлетворительные, у 1 неудовлетворительные), нуклеинатом натрия у 50% больных (у I хорошие, у 2 удовлетворительные, у 3 неудовлетворительные), плацебо у всех больных клинический эффект отсутствовал. Таким образом, проведенные исследования и сравнительный анализ действия средства с известным иммуномодулирующим препаратом нуклеинатом натрия позволяют сделать вывод о более выраженном нормализующем влиянии средства на многие нарушенные звенья иммунной системы, что проявляется в регуляции Т-системы, активации фагоцитарного звена, снижении высокого уровня общего IgЕ. Средство одновременно обладает иммуномодулирующими и противоаллергическими свойствами, повышая сниженные и снижая повышенные показатели иммунитета у больных хроническим обструктивным бронхитом, псориазом, атопическим дерматитом. Способность средства при курсовом введении у больных значительно снижать уровень общего IgE позволяет рекомендовать его для патогенетической терапии аллергических заболеваний. Нормализация иммунного статуса под влиянием средства проявляется в виде выраженного клинического эффекта, что позволяет рекомендовать его в комплексной терапии заболеваний, сопровождающихся иммунопатологическими синдромами (аутоиммунным, аллергическим, иммунодефицитным). Таким образом, полученное по заявляемому способу средство обладает выраженным противоатеросклеротическим, антиметогенным, кардиотоническим, антиаллергическим и иммуномодулирующим действием.