противовирусное средство

Формула изобретения

Долихилфосфат формулы



обладающий противовирусным действием.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, в частности к противовирусным средствам, и может быть использовано для лечения СПИДа, вирусного гепатита и клещевого энцефалита.

В настоящее время наиболее тяжелыми заболеваниями вирусной этиологии являются СПИД, вирусный гепатит и клещевой энцефалит.

Основным лекарственным средством, применяемым в клинике для лечения СПИДа, служит азидотимидин (зидовудин).

Однако азидотимидин (АЗТ) является высокотоксичным средством, от него в первую очередь страдает кроветворная система.

Предлагается органическое соединение долихилфосфат (ДФ) общей формулы:



в качестве противовирусного средства.

Известны производные долихилфосфата, используемые в качестве средства для лечения анемии. Предлагаются новые производные с ценными биологическими свойствами.

Биологическая характеристика ДФ.

П р и м е р 1. Активность ДФ в отношении вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1). В опытах используют пермиссивную для репродукции ВИЧ-1 линию человеческих клеток МТ4 и ВИЧ-1.

Клетки выращивают в 24-луночных микропластинах в среде РРМ1 1640 с добавлением 10% -ной эмбриональной телячьей сыворотки 20 мкг/мл L-глютамина и 50 мкг/мл гентамицина. Инкубацию осуществляют в СО₂-инкубаторе при 37^оС, 5% СО₂ и 100% влажности.

Условия заражения: клетки суспендируют в ВИЧ-1, содержащей жидкости в концентрации 500 тыс/кг и инкубируют 2 ч. После этого в дуплицированные культуральные лунки вносят клетки с ВИЧ-1, добавляют ДФ в концентрациях 10-200 мкг/мл и инкубируют при 37^оС в течение 5-7 дней. В качестве эталонного препарата сравнения используют коммерческий препарат АЗТ (Servа, ФРГ).

Тестирование проводят в трехкортных экспериментах методом непрямой иммунофлюоресценции (ингибиция ВИЧ) с использованием пула ВИЧ-позитивных сывороток от больных СПИДом и серопозитивных носителей ВИЧ-инфекции. Результаты оценивают по числу антигенпозитивных клеток (в) в опытных и контрольных культурах.

Установлено (табл. 1), что ДФ обладает выраженным дозозависимым ингибирующим воздействием в отношении ВИЧ-1. В дозах 10 и 200 мкг/мл наблюдается 100%-ная ингибиция ВИЧ-1.

П р и м е р 2. Активность ДФ в отношении вируса гепатита А (ВГА). Монослойную культуру клеток FRhK-4 (среда роста: среда Игла-МЕМ с удвоенным содержанием аминокислот и витаминов с 10% эмбриональной телячьей сыворотки) заражают суспензией, содержащей ВГА, и инкубируют в течение 24 суток при 37^оС еженедельной сменой среды поддержания (среда Игла-МЕМ с 1% фетальной сыворотки). Содержание антигена ВГА определяют в клеточных лизатах на 7-е и 24-е сутки после инфицирования иммуноферментным методом. Инфицирование культур ВГА проводят при одновременном внесении с ДФ, либо через час после внесения в культуру ДФ.

Параллельно ставят контроль на репродукцию ВГА и на цитотоксичность ДФ в тех же дозах.

Данные опытов представлены в табл.2.

Установлено, что ДФ обладает выраженным ингибирующим действием в отношении ВГА в интервале доз 20-200 мкг/мл.

П р и м е р 3. Активность ДФ в отношении вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). Сирийских хомяков заражают подкожно ВКЭ (штамм В-383) по 0,25 мл вирусной суспензии, содержащей ВКЭ в дозе 1000 LD в 1 мл.

На 6-7-е сутки после заражения, на фоне развившегося клинического заболевания, животным вводят внутримышечно однократно ДФ в дозе 0,5 мг.

Установлено, что если в контрольной группе хомяков, зараженных ВКЭ, на 7-8-е сутки после заражения погибло 100% животных (что соответствует нормальному течению острой инфекции), то хомячки, получившие ДФ, погибли на 10-е сутки после заражения, что свидетельствует о наличии у препарата ДФ высокой терапевтической активности в отношении ВКЭ.

П р и м е р 4. Токсичность ДФ в отношении кроветворной системы. Известно, что АЗТ обладает чрезвычайно высокой токсичностью в отношении кроветворной системы, вызывая панцитопению, снижение численности стволовых кроветворных клеток и кроветворных клеток предшественников, что резко ограничивает возможность его использования в клинике для терапии СПИДа.

В опытах по изучению токсичности ДФ в отношении кроветворной системы используют мышей (СВА х С57ВL/6), СВА и С57BL/6.

Препарат вводят подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно или внутривенно в дозах 50-50000 мкг/кг. Через 5 ч, 1 сутки, 7 суток и 21 сутки у мышей извлекают костный мозг из бедренных костей и определяют общую численность кариоцитов, а также число жизнеспособных клеток по окрашиванию тропановым синим. С помощью метода экзоколонизации селезенки сингенных летально облученных реципиентов определяют численность стволовых кроветворных клеток, образующих колонии в селезенке. Численность кроветворных клеток предшественников определяют по образованию гранулоцитов макрофагальных колоний в агаровых культурах в присутствии гранулоцитов макрофагального колониестимулирующего фактора. Установлено, что под влиянием ДФ в интервале доз в течение 21 суток после введения ДФ любыми способами не наблюдается снижения общей численности кариоцитов костного мозга или численности стволовых кроветворных клеток и клеток-предшественников, а также на наблюдается гибель клеток.

Это позволяет заключить, что ДФ не обладает токсичностью в отношении кроветворной системы, тогда как АЗТ в дозах 3,5 мг/кг и выше обладает высокой токсичностью, вызывая анемию и панцитопению.

Таким образом, ДФ обладает выраженным ингибирующим действием в отношении ВИЧ-1, ВГА и ВКЭ, при этом в отличие от АЗТ не обладает токсическим действием на кроветворение, что особенно важно, поскольку 100%-ое ингибирующее действие ДФ на ВИЧ-1 в культуре проявляется в более высоких концентрациях, чем у АЗТ, начиная со 100 мкг/мл.

Все это позволяет сделать вывод о том, что ДФ является перспективным средством для борьбы с вирусными инфекциями, в частности вызванными ВИЧ-1, ВГА и ВКЭ.