способ диагностики аутоиммунных расстройств

Формула изобретения

1. СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АУТОИММУННЫХ РАССТРОЙСТВ, включающий определение антител к органонеспецифическим антигенам путем сорбции нативной ДНК, внесения разведений сывороток, добавления конъюгата, субстратной смеси и оценки результата анализа, отличающийся тем, что в лунках одного планшета дополнительно сорбируют препарат денатурированной ДНК, а также препараты коллагена и эластина, сорбцию проводят в карбонат-бикарбонатном буфере, в лунки пластины вносят неинактивированные сыворотки в разведении 1 100 и результат анализа оценивают по разности оптической плотности между анализируемым образцом и стандартным контролем пулом сывороток 100 здоровых доноров и при ее величине больше или равной 0,2 результат считают положительным.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и касается способа диагностики аутоиммунных расстройств у больных различного профиля с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) на основе органонеспецифических антигенов.

Существующие способы выявления аутоантител к таким органонеспецифическим антигенам (АГ), как нативная (н-) и денатурированная (д-) ДНК, коллаген, эластин, основаны на использовании препаратов различной степени очистки, выделенных из разнообразных источников, недостаточно охарактеризованных по химическому составу и специфической активности.

Для определения аутоантител (ААТ) к названным антигенам используют различные по чувствительности и специфичности методы, зачастую трудоемкие и не поддающиеся автоматизации, при этом в основе оценки результатов лежит разнообразные критерии. Все это делает несопоставимыми результаты анализа, не позволяет одномоментно проводить исследование сывороток крови для выявления аутосенсибилизации тем или иным АГ, определять активность процесса, не обеспечивает возможность массового исследования сывороток и снижает надежность их тестирования.

Наиболее близким к изобретению является способ определения аутоантител к ДНК.

На полистирольных планшетах (пластинах) Ленинградского завода медполимеров сорбировали коммерческий высокополимерный препарат ДНК из эритроцитов цыплят ("Reanal", Венгрия), разведенный фосфатно-солевым буфером (ФСБ) до соотношения 1:10, и инкубировали 18 ч при 18-20^оС. После этого лунки отмывали и вносили инактивированные, разведенные до соотношения 1:50 в мясопептонном бульоне с твином положительный и отрицательный контроли и сыворотки больных. После инкубации с сыворотками в течение 1 ч при 37^оС лунки отмывали и вносили коммерческий препарат конъюгата (КГ). Пластину выдерживали в течение 30 мин при 37^оС, отмывали и вносили субстратную смесь. Результаты оценивали визуально по интенсивности окраски индикатора субстратной смеси, сравнивали с положительным и отрицательным контролями и выражали в крестах: 4+, 3+, 2+ свидетельствовали о положительном результате, 1+ и свидетельствовали об отрицательном результате.

Недостатками прототипа являются следующие: во-первых, способ предусматривает определение аутоантител только к нативному препарату ДНК и рекомендуется для анализа сывороток больных красной волчанкой; во-вторых, для анализа используют инактивированные, т.е. прогретые при 56^оС в течение 30 мин сыворотки в разведении 1:50. Проведенные исследования позволили установить, что инактивировать сыворотки не обязательно, так как комплемент не мешает проявлению способности ААТ связываться с антигеном в ИФА, а оптимальным разведением сывороток для анализа является 1:100. При этом разведении наблюдаются максимальные различия между сыворотками крови больных аутоиммунными заболеваниями и здоровых людей; в-третьих, в качестве контролей использованы нестандартизованные по активности сыворотки здоровых и больного с активным процессом системной красной волчанки (СКВ). Нестандартность контролей и визуальная оценка результатов способствует снижению точности реакции и надежности проводимого исследования.

Цель изобретения расширение спектра диагностируемых аутоиммунных расстройств, повышение точности способа диагностики за счет возможности определения аутоантител к комплексу основных органонеспецифических антигенов.

Цель достигается тем, что на одном полистирольном планшете сорбируют при одинаковых условиях стандартные, химически чистые коммерческие препараты ДНК, коллагена и эластина. С помощью ИФА на этом планшете анализируют в стандартном разведении сыворотки крови людей, в качестве контроля используют пул сывороток крови 100 здоровых доноров. Результаты ИФА оценивают путем расчета разности оптической плотности ( ОП) между анализируемыми образцами и контролем и при ОП 0,2 результат считают положительным.

Способ осуществляют следующим образом.

На полистирольном планшете для ИФА, на котором коэффициент вариации результатов не превышает 5 сорбируют растворенные в карбонат-бикарбонатном буфере (КББ) с рН-9,6 препараты н- и д-ДНК (выделена из селезенки крупного рогатого скота, выпускается в г.Олайне), эластин (выделен из сухожилий быка, выпускается фирмой "Serva", Германия), коллаген (выделен из шейной связки быка, выпускается фирмой "Serva", Германия) в концентрации 10-20 мкг/мл. Каждым препаратом заполняют лунки трех вертикальных рядов, сорбцию проводят в течение 16-20 ч при 4-10^оС или 1 ч при 37^оС. Затем лунки освобождают от раствора антигенов вытряхиванием, отмывают ФСБ (рН 7,0-7,4) с 0,05-ным твином 20 от избытка антигенов и вносят в дублях растворы контрольной и анализируемых сывороток, разведенных тем же буферным раствором до соотношения 1: 100. С каждым антигеном на одном планшете одномоментно может быть проанализировано 11 образцов. Дальнейшее проведение ИФА является общепринятым. Пластину с сыв оротками помещают на 1 ч в термостат при 37^оС, после этого вытряхивают содержимое и отмывают лунки. Затем вносят конъюгат антитела диагностические против иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой. Пластину вновь термостатируют в течение 1 ч при 37^оС, затем вытряхивают содержимое лунок и отмывают от избытка КГ. Вслед за этим в лунки вносят субстратную смесь, 0,05 перекись водорода и 0,08 5-аминосалициловую кислоту (рН 5,8-6,0) в соотношении 1:10. Через 45-60 мин после выдерживания пластины при 18-20^оС результаты реакции фиксируют на спектрофотометре типа "Multiskan" при длине волны 450 нм. Для каждого образца расчитывают ОП, считая положительным результат при ОП 0,2. По значению величин ОП проводят выявление аутоиммунного процесса, осуществляют одномоментную оценку распространенности, активности и преимущественной направленности аутоиммунизации.

Диагностическая эффективность предлагаемого способа выявления аутоантител к органонеспецифическим антигенам представлена в таблице и на примерах.

Результаты анализа большого количества сывороток (таблица) свидетельствуют о том, что с помощью предлагаемого способа возможно проводить скрининг сывороток здоровых и больных различными заболеваниями людей для выявления аутоиммунного расстройства. Среди сывороток здоровых, больных аллергическими и эндокринными заболеваниями людей частота положительных реакций с органонеспецифическими антигенами незначительна. Наиболее часто повышенная активность антител к ДНК (н- и д-) и коллагену выявляется у больных коллагенозами (группа 2), в меньшем проценте случаев, но также достаточно часто у больных с заболеваниями печени. Наибольшая активность аутоантител к эластину встречается у больных с заболеваниями легких.

П р и м е р 1. Больная А. 28 лет, поступила в стационар с диагнозом: СКВ, хроническое течение, III степень активности. Больна в течение 5 лет. При поступлении наблюдались эритематозные высыпания на лице, жалобы на боли в суставах, слабость, повышение температуры до 38,5^оС. При лабораторном исследовании: СОЭ 45 мм/ч, LE-клетки 5/1000 лейкоцитов. При исследовании сыворотки крови с помощью предлагаемого способа ОП н-ДНК 0,45

д-ДНК 0,27

Коллаген 0,18

Эластин 0,05

Таким образом, анализ сыворотки с целью определения ААТ к органонеспецифическим АГ показал наличие у больной аутоиммунного процесса, высокую активность ААТ к н-ДНК, более низкую к д-ДНК и отсутствие диагностически значимого уровня ААТ к коллагену и эластину, что свидетельствует о нераспространенности аутоиммунного заболевания в отношении элементов соединительной ткани.

П р и м е р 2. Больная У. 42 г. Диагноз: ревматоидный артрит, суставно-висцеральная форма. Жалобы на резкие боли и скованность движений в суставах, температуру 38^оС, озноб, потливость, сухой кашель, одышку при физической нагрузке. При осмотре обнаружено: состояние тяжелое, суставы рук деформированы, кожные покровы влажные. В легких мелкопузырчатые хрипы, больше слева. При лабораторном исследовании: лейкоцитоз 14 10⁹ /л; СОЭ 40 мм/ч; реакция Ваалера-Розе положительная. При исследовании сыворотки крови с помощью предлагаемого способа ОП н-ДНК 0,15

д-ДНК 0,20

Коллаген 0,20

Эластин 0,53

Таким образом, анализ сыворотки крови с целью определения ААТ к органонеспецифическим АГ показал наличие у больной аутоиммунного процесса, направленного в основном на выработку аутоантител к эластину основному элементу соединительной ткани альвеол легкого.

П р и м е р 3. Больной В. 35 лет. Поступил по поводу обострения хронического активного гепатита. По данным лабораторного исследования: гиперпротеинемия, гипергаммаглобулинемия, повышена активность аланиламинотрансферазы и аспартатаминотрансферазы. При исследовании сыворотки крови с помощью предлагаемого способа ОП н-ДНК0,13

д-ДНК 0,32

Коллаген 0,38

Эластин 0,19

Таким образом, анализ сыворотки крови показал наличие у больного аутоиммунного процесса, который распространился на д-ДНК и коллаген. Аутоиммунного процесса в отношении н-ДНК и эластина не выявлено.

П р и м е р 4. Больной К. 44 г. Диагноз: хронический гломерулонефрит, нефротический синдром. При осмотре обнаружены множественные отеки, кожные покровы бледные, влажные. Давление 180/110 мм рт.ст. при физикальном методе исследования в легких застойные явления. При лабораторном исследовании: моча макрогематурия; белок 8 г/сут, лейкоциты до 40 в п/зр. плотность 1020; кровь белок 45 г/л; мочевина 15,7 ммоль/л; холестерин 1,78 ммоль/л; остаточный азот 0,9 г/л. При исследовании сыворотки крови с помощью предлагаемого способа ОП н-ДНК0,10

д-ДНК 0,18

Коллаген 0,13

Эластин 0,11

Таким образом, у больного не обнаружено выраженного аутоиммунного расстройства в отношении органонеспецифических антигенов.

Описание способа диагностики аутоиммунных расстройств (заболеваний) с помощью определения антител к органонеспецифическим антигенам, а также представленные примеры свидетельствуют о существенных преимуществах предлагаемого нами способа по сравнению с прототипом. Эти преимущества заключаются в определении ААТ не только к н-ДНК, но и к д-ДНК, а также к коллагену и эластину, т.е. комплексу основных органонеспецифических антигенов, что дает возможность не только выявлять наличие аутоиммунного процесса, но определять его распространенность и преимущественную направленность при одномоментном исследовании сыворотки одного больного. Предлагаемый способ расширяет спектр диагностируемых аутоиммунных расстройств. Для стандартизации и повышения точности определения ААТ используются химически чистые коммерческие препараты органонеспецифических антигенов, оптимальные разведения сывороток для анализа 1:100, единый контроль пул сывороток 100 здоровых доноров, который в зависимости от сорбционной способности полистирольных пластин имеет ОП от 0,1 до 0,3 ед. ОП, проводится более точная инструментальная оценка результатов. Проведенные исследования позволили установить, что ОП между анализируемой сывороткой и отрицательным контролем в ИФА является объективным показателем наличия и активности аутоиммунного процесса. В качестве диагностического принят критерий ОП 0,2 ед. ОП, так как при анализе сывороток здоровых доноров величина ОП 0,2 встречается не более, чем в 5 случаев, т.е. диагностическая эффективность этого критерия превышает 95

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет с большой точностью и эффективностью выявлять наличие, распространенность, активность и преимущественную направленность аутоиммунного процесса.