питательная среда для выращивания культуры ткани раувольфии змеиной - продуцента алкалоидов
Классы МПК: | A01H4/00 Разведение растений из тканевых культур C12N5/00 Недифференцированные клетки человека, животных или растений, например, клеточные линии; ткани; культивирование или сохранение их; питательные среды для них C12N5/02 размножение одиночных клеток или клеток в суспензии; сохранение их; питательные среды для них |
Автор(ы): | Воллосович А.Г., Васильев Ю.Д., Голынкин В.А., Амбросов В.А., Богданова Т.В. |
Патентообладатель(и): | Санкт-Петербургский химико-фармацевтический институт, Малое предприятие "Биоком" |
Приоритеты: |
подача заявки:
1994-07-12 публикация патента:
20.06.1997 |
Использование: биотехнология, в частности при культивировании растительной ткани культуры раувольфии змеиной - продуцента алкалоидов. Питательная среда содержит микро- и макроэлементы, витамины и другие добавки при указанном соотношении компонентов. 1 табл.
Рисунок 1
Формула изобретения
Питательная среда для выращивания культуры ткани раувольфии змеиной - продуцента алкалоидов, содержащая Ca(NO3)2 4H2O, MgSO4 7H2O, NH4NO3,(NH4)2SO4, FeSO4 7H2O, Na ЭДТА, H3BO3, MnSO4 5H2O, ZnSO4 4H2O, Na2MoO4 2H2O, CuSO4 5H2O, CoCl2 6H2O, KJ, тиамин, агар-агар, сахарозу и воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит KH2PO4 и K2HPO4 3H2O при следующем соотношении компонентов, мг/л:
Ca(NO3)2 4H2O 900 1500
MgSO4 7H2O 1100 1300
NH4NO3 3000 3800
(NH4)2SO4 800 1000
FeSO4 7H2O 80
Na ЭДТА 100
H3BO3 10,5
MnSO4 5H2O 16,5
ZnSO4 4H2O 10,0
Na2MoO4 2H2O 0,25
CuSO4 5H2O 0,02
CoCl2 6H2O 0,125
KJ 0,83
KH2PO4 370 400
K2HPO4 3H2O 240 320
Тиамин 1,0
Агар-агар 6500
Сахароза 120000 130000
Вода Остальноел
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к биотехнологии растительных клеток и касается питательной среды для выращивания культуры ткани с целью получения лекарственных препаратов. Известна питательная среда [1] для выращивания культуры ткани раувольфии продуцента алкалоидов, имеющая следующий состав, в мг/л: KNO3-1500-2000; NH4NO3-1300-1800; MgSO47H2O-300-400; CaCl2-320-450; KH2PO4-120-200; NaEDTA-90-100; FeSO47H2O-25-35; H3BO3-5,5-8,0; KJ-0,5-0,9; MnSO45H2O-20,0-25,0;ZnSO44H2O-10,0-17,0; Na2MoO42H2O-0,2-0,3; CuSO45H2O-0,01-0,03; CoCl26H2O-0,01-0,03; инозит - 60-80; тиамин-1,0-1,5; сахароза-50000; агар-агар-65000. Среда не обеспечивает достаточно высокого выхода биомассы и содержания в ней алкалоидов. Наиболее близкой к заявленной среде является питательная среда [2] для выращивания культуры ткани раувольфии продуцента алкалоидов, имеющая следующий состав, в мг/л: Ca(NO3)24H2O-800-1050; MgSO47H2O-1100-1300; KNO3-200-400; NH4NO3-2400-2500; (NH4)2SO4-200-500; NH4Cl-100-150; (NH4)2 HPO4-250-300; NH4H2PO4 -150-200; FeSO47H2O-27-34; NaEDTA-37-100; H3BO3 9,3-12,4; MnSO45H2O-22-23; ZnSO44H2O 1,7-8,6; Na2MoO42H2O 0,2-0,3; CuSO45H2O-0,015-0,025; CoCl26H2O 0,075-0,125; KJ 0,83-0,90; инозит 100-80; тиамин 1-1,5; агар-агар 65000; сахароза 90-100000. Соотношение и количество ионов, обеспечивающих рост культуры на этой среде составляет, в мг/л: K++-78-156; Ca++-130-170; PO4----300-382; Mg++-110-130; SO4---570-870; NO3--2270-2681; NH+-686-833. Среда не обеспечивает достаточно высокого выхода биомассы и содержания в ней алкалоидов. Задача изобретения состоит в увеличении выхода биомассы, содержания в ней алкалоидов и ускорения их биосинтеза. Задача достигается тем, что культивирование ткани производится на среде следующего состава (мг/л): KH2PO4-300-500; K2HPO43H2O-300-500; (NH4)2SO4-800-1000; NH4NO3 2500-3800; MgSO47H2O 1000-1500; Ca(NO3)24H2O - 1000-2000; NH4Cl 100-200; FeSO44H2O 60-80; NaEDTA - 100-200; H3BO3 10-12; KJ 700-1000; CoCl26H2O - 800-1000; NaMoO42H2O 0,2-0,3; MnSO45H2O - 0,22-0,23; CuSO45H2O 0,015-0,025; ZnSO44H2O - 1,7-8,6; тиамин 1-1,5; агар-агар 65000; сахароза 120000-130000. Отличительным признаком предложенной среды является новое содержание ионов, а именно: K+ -160-250; Ca++-180-200; PO4----370-480; Mg++ -110-130; SO4---1000-1250; NO3--2870-3450; NH4+ 1150-1320 и повышенное содержание сахарозы в среде 120000-130000. Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Готовят питательную среду следующего состава (мг/л): Ca(NO3)24H2O 900; MgSO47H2O 1100; NH4NO3-3000; (NH4)2SO4- 800; KH2PO4- 350; K2HPO43H2O -240; FeSO47H2O 80; NaEDTA 100; H3 BO3- 10,5; MnSO45H2O 16; ZnSO44H2O 10; Na2MoO42H2O 0,25; CuSO45H2O 0,02; CoCl26H2 O 0,125; KJ 0,83; тиамин 1,0; агар-агар 65000; сахароза 120000. Соотношение ионов и их количество, обеспечивающие рост культуры на этой среде, составляет, в мг/л: K+ 160; Ca++-180; PO4----370; Mg++-110; SO4---1000; NO3--2870; NH4+- 1150. Высаживают биомассу в возрасте 28-32 суток в культуральные емкости на 250 мл, содержащие 125 мл питательной среды. Биомассу высушивают на 60-е сутки. Выход воздушно-сухой биомассы на среде-прототипе составил, в г/л: 40,02,1, а на новой среде - 47,02.0; выход алкалоидов группы индолина в на среде-прототипе 1,80,12, на новой среде 2,00,11. Выход алкалоидов группы индолина в мг на л среды составил: на среде-прототипе-720; на новой среде-1220. Пример 2. Готовят питательную среду следующего состава (мг/л): Ca(NO3)24H2O 1200; MgSO47H2O 1200; NH4NO3- 3400;(NH4)2SO4- 900; KH2PO4- 375; K2HPO43H2O 280; FeSO47H2O 80; NaEDTA 100; H3BO3 10,5; MnSO45H2O 16; ZnSO44H2O 10; Na2MoO42H2O 0,25; CuSO45H2O 0,02; CoCl26H2O 0,125; KJ 0,83; тиамин 1,0; агар-агар 65000; сахароза 125000. Соотношение ионов и их количество, обеспечивающее рост культуры на этой среде, составляет, в мг/л: K+-200; Ca++-210; PO4--- 430; Mg++-120; SO4---1120; NO3- 3150; NH4+-1280. Высаживают биомассу в возрасте 28-32 суток в культуральные емкости на 250 мл, содержащие 125 мл питательной среды. Биомассу высушивают на 60 сутки. Выход воздушно-сухой биомассы на среде-прототипе составил в мг/л 40,02,1, на новой среде - 55,12,0. Содержание алкалоидов группы индолина при выращивании на среде-прототипе составило в 1,80,12, а на новой среде 3,20,18. Выход алкалоидов группы индолина в мг/л среды составил на среде-прототипе 720, а на новой среде 1532. Пример 3. Готовят питательную среду следующего состава, в мг/л: Ca(NO3)24H2O 1500; MgSO47H2O 1300; NH4NO3-3800; (NH4)2SO4 1000; KH2PO4
400; K2HPO43H2O -320; FeSO47H2O 80; NaEDTA 100; H3BO3 10,5; MnSO45H2O 16; ZnSO44H2 O 10; Na2MoO42H2O 0,25; CuSO45H2O 0,02; CoCl26H2O 0,125; KJ 0,83; тиамин 1,0; агар-агар 65000; сахароза 130000. Состав ионов и их количество, обеспечивающее рост культуры на этой среде, составляет, в мг/л: K+-250; Ca++-240; PO4----480; Mg++-130; SO4---1250; NO3--3450; NH4+-1320. Биомассу высаживают в возрасте 28-32 суток в культуральные емкости на 250 мл, содержащие 125 мл питательной среды. Биомассу высушивают на 60 сутки. Выход воздушно-сухой биомассы в г/л среды на среде-прототипе составил 40,02,1, а на новой среде 55,12,0. Выход алкалоидов группы индолина в на среде-прототипе составил 1,80,12, а на новой среде 55,12,0. Выход алкалоидов группы индолина в мг/л на среде прототипе составил 720, а на новой среде -1320. Пример 4. Готовят питательную среду следующего состава, в мг/л: Ca(NO3)24H2O 1200; MgSO47H2O 1300; NH4NO3- 3400; (NH4 2SO4- 1000; KH2PO4- 370; K2HPO43H2O 320; FeSO47H2O 80; NaEDTA 100; H3BO3- 10,5; MnSO45H2O 16; ZnSO44H2O 10; Na2MoO42H2O 0,25; CuSO45H2O 0,02; CoCl26H2O 0,125; KJ 0,83; тиамин 1,0; агар-агар 65000; сахароза 125000. Соотношение ионов и их количество, обеспечивающее рост культуры на этой среде, составляет, в мг/л: K+-200; Ca++-200; PO4----430; Mg++-130; SO4---11220; NO3- -1280. Высаживают биомассу в возрасте 28-32 суток в культуральные емкости на 250 мл, содержащие 125 мл среды. Снимают динамику роста и накопление алкалоидов группы индолина на новой среде в сравнении со средой прототипом. Данные приведены в таблице N 1. Как видно из данных таблицы, оптимальный выход алкалоидов группы индолина и прирост биомассы на новой среде отмечался на 60-65 сутки роста, а на среде прототипе не ранее 70 суток. Таким образом, новая среда позволяет увеличить выход биомассы на 20% содержание в ней алкалоидов группы индолина на 59% по отношению к сухой биомассе и на 85% из расчета в мг/л среды. Период роста на новой среде сокращается на 10 суток по сравнению со средой-прототипом. Источники информации
1. Murachige T. Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. plant, 1962 Vol.15, N 3, P.473-475. 2. Авторское свидетельство СССР N 1167895, М. кл C 12 N 5/02. 1985.
Класс A01H4/00 Разведение растений из тканевых культур
Класс C12N5/00 Недифференцированные клетки человека, животных или растений, например, клеточные линии; ткани; культивирование или сохранение их; питательные среды для них
Класс C12N5/02 размножение одиночных клеток или клеток в суспензии; сохранение их; питательные среды для них