мутантная глюкозоизомераза с измененной субстратной специфичностью и способ ее получения

Классы МПК:C12N9/92 глюкозная изомераза
C12N15/61 изомеразы (5)
C12N15/00 Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев
Автор(ы):, , ,
Патентообладатель(и):Гист-Брокейдс Н.В. (NL),
Плант Дженетик системз Н.В. (BE)
Приоритеты:
подача заявки:
1991-01-03
публикация патента:

Использование: биотехнология, пищевая промышленность. Сущность изобретения: на основании данных кристаллографического анализа комплексов глюкозоизомеразы с субстратом или аналогом субстрата - ингибитором в соответствии с разработанными критериями выявляют амино-кислотные остатки, замена которых в молекуле белка обеспечивает изменение субстратной специфичности фермента, после чего в последовательности гена глюкозоизомеразы, в частности выделенного из Actinoplanes missouriensis, получают с помощью сайт-направленного мутагенеза мутации, которые обеспечивают нужные аминокислотные замены, мутированный ген экспрессируют в составе рекомбинантного вектора в бактериальных клетках с получением запланированных мутеинов фермента. Экспрессированные мутантные формы глюкозоизомеразы обладают измененными (по отношению к исходной природной форме) кинетическими константами (Vмах и Kм). 2 с. и 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 8 табл.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8

Формула изобретения

1. Мутантная глюкозоизомераза с измененной субстратной специфичностью, полученная путем экспрессии в бактериальном штамме рекомбинантной плазмидной ДНК с геном глюкозоизомеразы из Actinoplanes missouriensis, содержащим по крайней мере одну мутацию, обеспечивающую аминокислотную замену в соответствующем положении аминокислотной последовательности фермента, выбранном из группы:

15 Leu, 17 Thr, 20 Trp, 25 Ala, 27 Gly, 52 Thr, 53 Phe, 55 Asp, 57 Asp, 87 Pro, 88 Met, 89 Val, 90 Thr, 91 Thr, 92 Asn, 93 Leu, 95 Thr, 133 Thr, 134 Leu, 135 Val, 136 Leu, 138 Gly, 140 Arg, 179 Ala, 180 Ile, 182 Pro, 186 Glu, 215 Asn, 216 Pro, 218 Thr, 219 Gly, 243 His, 244 Ile, 246 Leu, 254 Phe, 256 Gln, 257 Asp, 258 Leu, 290 His, 291 Phe, 293 Tyr, 294 Lys, 295 Pro, приводящую к перемещению молекулы воды в сфере радиусом мутантная глюкозоизомераза с измененной субстратной   специфичностью и способ ее получения, патент № 2096457 вокруг атома кислорода в центре связывания сахарного субстрата, имеющая в интервале температур 20 - 85oС Vmax для глюкозы, и/или ксилозы выше и/или Km для глюкозы, и/или ксилозы ниже, а отношение Vmax для глюкозы к Vmax для ксилозы и/или отношение Km для ксилозы к Km для глюкозы выше, чем те же показатели для исходного фермента дикого типа.

2. Глюкозоизомераза по п.1, отличающаяся тем, что в аминокислотной последовательности глюкозоизомеразы Actinoplanes missouriensis либо 25 Ala заменен на Lys, либо 243 His заменен на Asp, либо 290 His заменен на Asp, либо 290 His заменен на Asp и одновременно 253 Lys заменен на Asp, либо 253 Lys заменен на Arg, либо 88 Met заменен на Ser, либо 98 Met заменен на Ser и одновременно 243 His заменен на Asp, либо 88 Met заменен на Ser и одновременно 290 His заменен на Asp, либо 90 Tyr заменен на Ser и одновременно 135 Val заменен на Gly, либо 90 Tyr заменен на Ser и одновременно 135 Val заменен на Gly, а 215 Asp заменен на Ser, либо 135 Val заменен на Tyr, либо 135 Val заменен на Gly.

3. Способ получения мутантной глюкозоизомеразы с измененной субстратной специфичностью, включающий выделение нативного гена глюкозоизомеразы, получение мутаций в заранее избранных позициях полинуклеотидной последовательности, включение мутированной последовательности в вектор экспрессии, трансформацию бактериальной клетки-хозяина указанным вектором, культивирование трансформированных клеток и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что выбор позиций для сайтспецифического мутагенеза и получение мутаций осуществляют следующим образом: а) на основании данных кристаллографического анализа комплексов глюкозоизомеразы с субстратом или субстратным аналогом-ингибитором выявляют аминокислотные остатки и молекулы воды, имеющие по меньшей мере один атом внутри сферы, окружающей субстрат или субстратный аналого-ингибитор, радиусом мутантная глюкозоизомераза с измененной субстратной   специфичностью и способ ее получения, патент № 2096457 а также аминокислотные остатки, связанные с указанными остатками и молекулами воды взаимодействиями Ван-дер-Ваальса; б) исключают из определенных на этапе а) аминокислотных остатков и молекул воды те, которые заняты в катализе, связывании кофактора и поддержании структуры белковой молекулы; в) по крайней мере один из отобранных на этапе б) аминокислотных остатков путем введения соответствующей мутации в ген глюкозоизомеразы дикого типа замещают другим, обеспечивающим устранение стерического препятствия и/или изменение гидрофобности/полярности субстратного окружения, и/или изменение степени сольватации субстратного окружения, и/или изменение гибкости белковой молекулы или ее отдельных участков.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к применению технологии белковой инженерии для улучшения свойств энзимов. В частности, настоящее изобретение раскрывает способ определения аминокислот, замещение которых вызывает изменение субстратной специфичности. Этот способ применяется к глюкозоизомеразам. В другом аспекте изобретение относится к глюкозоизомеразам с измененной субстратной специфичностью. Эти новые глюкозоизомеразы могут быть использованы преимущественно в промышленных технологиях, например, при производстве кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы /HFCS/.

Предпосылки изобретения.

Глюкозоизомеразы катализируют обратимую изомеризацию глюкозы во фруктозу. В настоящее время фруктоза обычно применяется в качестве заменителя сахара из-за ее более высокой по сравнению, например, с сахаром и глюкозой сладости.

Известны многие микроорганизмы для производства глюкозоизомеразы, см. например, обзорные статьи Вен Пин Ченя в "Pross Biochemistry", 15 июнь/июль, 1980, с. 30 41, и август/сентябрь, 1980, с. 36 41, в которых перечислено большое количество микроорганизмов, способных продуцировать глюкозоизомеразу.

Некоторые микроорганизмы могут быть использованы для промышленного производства глюкозоизомеразы, наиболее известные из них Streptomyces, Ampulariella и Acitnoplanes. В упомянутой статье Вен Пин Ченя описаны условия культивирования этих микроорганизмов, а также способы выделения и очистки полученных глюкозоизомераз.

Как правило, природные глюкозоизомеразы показывают также высокое сродство к другим, нежели глюкоза, сахарам. В этом отношении D-ксилоза, D-рибоза, L-арабиноза, D-аллоза и 6-дезоксиглюкоза являются, как было обнаружено, также объектом действия этого энзима. Значения Кm D-глюкозы, D-ксилозы и D-рибозы изменяются, как было показано, от микроорганизма к микроорганизму и, как сообщалось, находятся в пределах от 0,086 0,920, 0,005 0,093 и 0,35 - 0,65 М соответственно.

Значения Km для ксилозы значительно ниже, чем для глюкозы, что подразумевает, что правильное название для этого энзима ксилозоизомераза. Кроме того, Vmax обычно используемых глюкозоизомераз выше по ксилозе, чем по глюкозе, что также предполагает, что лучшее название - ксилозоизомераза.

Поскольку глюкозоизомераза активна по отношению к разным субстратам, то может быть выгодным изменение субстратной специфичности в зависимости от желаемого продукта реакции, конкретного процесса, в котором она используется, или от желания избежать появления нежелательных побочных продуктов.

Для применения глюкозоизомеразы при получении HFCS более высокое Vmax и более низкое Km по глюкозе было бы полезным свойством, поскольку снизилось бы время реакции и расходы на энзим.

Другое применение глюкозоизомеразы это превращение глюкозы в этанол Jebbries T.W. Trends Biotechnol 3/1985/ 208. Для такого применения было бы выгодным наличие более высокой активности /Vmax/ по ксилозе и/или лучшего сродства к ксилозе.

Перевариваемость и вкус пищи для животных с однокамерным желудком могут быть улучшены, если глюкозу преобразуют ферментативно во фруктозу. На практике применению глюкозоизомеразы препятствует активность изомеризации ксилозы, которая вызывает нежелательное образование ксилулозы в пище. Глюкозоизомераза без специфичности или с пониженной специфичностью /Vmax или Km/ по ксилозе заслуживает предпочтения при применении для предварительной обработки пищи.

Понятно, что существует потребность в изменении субстратной специфичности глюкозоизомеразы, которое бы в то же время расширило и область применения этого энзима.

Недавно была описана модификация специфической активности энзимов с помощью технологии белковой инженерии Wells и др. /Proc. Natl Acad. Sci. USA 84, 1987, с. 5167/ на примере субтилизина. Сериновые протеазы Bacillus licheniformis и B. amyloliquefaciens отличаются на 31% /86 аминокислотных остатков/ по белковой последовательности и на 60% и от их каталитической эффективности в отношении определенных субстратов. Путем замещения 3 и 86 аминокислотных остатков из последовательности B. amyloliquefaciens соответствующими остатками B. licheniformis каталитическая активность мутантного энзима улучшается почти 60-кратно.

В другим источнике описывается, как лактат-дегидрогеназа была изменена в малат-дегидрогеназу путем мутирования глютамина 102 в аргинин 102 /Wilks и др. Science 242, 1988, с. 1541/.

В обоих случаях, ссылаясь на вышеуказанные серин-протеазу и лактат-дегидрогеназу, предложение модифицируемых остатков было основано на сравнении модифицируемой молекулы и встречающихся в природе энзимов, которые проявляют желаемую субстратную специфичность. Таким же путем специфичность цитохрома p45015a была изменена в специфичность цитохрома p450coh путем замещения Leu 209 на Phe 209 /Lindberg, Negish, Nature 339, 1989, с. 632/.

Для глюкозоизомеразы не известен природный энзим, который показал бы лучшую специфичность по глюкозе, чем по ксилозе. Поэтому вышеупомянутый способ, основанный на сравнении активных сайтов гомологичных энзимов, имеющих разную субстратную специфичность, не может быть применен к глюкозоизомеразе.

WO 89/01520 /Cetus/ перечисляет множество мутантов ксилозоизомеразы, которые могут быть получены искусственно. Предложенный способ основан на критерии, отличающемся от того, который использован в настоящем изобретении. Перечислено более 300 мутантов, но не дано никаких данных в отношении их характеристик и молекулярных изменений мутантных энзимов.

Цель изобретения заключается в раскрытии способа выбора аминокислот, замена которых приводит к изменению субстратной специфичности конкретного фермента. Этот способ, будучи широко применимым, используется для изменения субстратной специфичности глюкозоизомеразы.

Таким образом, изобретение также обеспечивает глюкозоизомеразы с измененной субстратной специфичностью. Эта измененная субстратная специфичность выражается терминами "измененная способность к связыванию субстрата" и "каталитическая активность по глюкозе и ксилозе в качестве субстратов".

Кроме того, обеспечиваются мутантные глюкозоизомеразы, которые обладают такими параметрами, как повышенная стабильность /выражаемая термином "константа разложения"/ и измененная субстратная специфичность, которые могут сочетаться в одной молекуле путем добавления соответствующих мутаций, ответственных за эти эффекты. Мутантные глюкозоизомеразы получают путем экспрессии гена, кодирующего указанный энзим /глюкозоизомеразу/, имеющий аминокислотную последовательность, которая отличается по меньше мере на одну аминокислоту от энзима глюкозоизомеразы дикого типа.

На фиг. 1 схематически представлен активный сайт глюкозоизомеразы от Actinoplanes missouriensis, полученный из трехмерной структуры комплекса глюкозоизомеразы с ксилотолом. Ингибитор показан во всех деталях в центре этой фигуры. Для аминокислотных остатков изображены только те атомы, которые вовлечены в связывание водорода. Названия остатков даны в рамках сплошной линией, молекулы растворителя в рамках пунктирной линией. Сайты, связывающие атомы металла, представлены овалами с номерами 395 и 580. Пунктирные линии показывают электростатические взаимодействия, тонкие пунктирные линии - предполагаемое связывание металлов. Строго консервированные остатки помечены звездочкой. Для изменяемых остатков показаны замещения, обнаруженные в природе.

Фиг. 2, 3 показывают порядок аминокислотных последовательностей глюкозоизомераз, полученных от разных микроорганизмов. Полная последовательность дана для глюкозоизомеразы Actinoplanes missouriensis. Аминокислотная последовательность глюкозоизомеразы Ampullariella отличается от опубликованных последовательностей /Saari. J.Bacteriol. 169, /1987/ 612/ на один остаток: Пролин 177 в опубликованной последовательности заменяет аргинин.

Последовательность Streptomyces thermovulgaris была установлена только до аминокислоты 346. Неопределенные остатки оставлены пустыми. Точка означает отсутствие аминокислотного остатка в этой позиции по сравнению с любой из других последовательностей. Различные виды показаны следующими символами:

Ami: Atinoplanes missouriensis DSM 4643

Amp: Ampullariella species ATCC 31351

Svi: Streptomyces violaceoruber LMG 7183

Smu: Streptomyces murinus

Sth: Streptomyces thermovulgaris DSM 40444

Art: Arthrobacter species

Bsu: Bacillus subtilis

Eco: Escherichia coli

Lxy: Lactobacillus xylosis

Отмечены элементы вторичной структуры Actinoplanes missouriensis. мутантная глюкозоизомераза с измененной субстратной   специфичностью и способ ее получения, патент № 2096457-спирали заключены в сплошные линии. Заштрихованные прямоугольники показывают b-нити.

Фиг. 4 показывает сравнение мутанта Н209 N /жирно/ со структурой сорбитол-Mg дикого типа.

Настоящее изобретение раскрывает способ выбора аминокислот в энзиме, замещение которых приводит к изменению субстратной специфичности. Для получения такого мутантного энзима последовательность ДНК, кодирующая этот энзим, изменяется таким образом, что закодированный энзим имеет одно или более выбранных аминокислотных замещений. Эту измененную ДНК экспрессируют в желаемой системе хозяин/вектор.

Чтобы выбрать подходящие /точечные/ мутации, используют расчетную методику, основанную на хорошо скоординированном использовании белковой кристаллографии, молекулярного моделировании и компьютерных методов, ферментологии и кинетики, молекулярной биологии и технологии белковой инженерии. Стратегии идентификации мишенных аминокислотных сайтов являются нововведением в том смысле, что считают, что точечные мутации резко вызывают "местные возмущения", но воздействуют при этом на различные свойства белковой структуры, вызывая изменения различных свойств. Поэтому, хотя описанные стратегии используют хорошо установленные структурно-функциональные взаимосвязи, они также обеспечивают рациональный путь, позволяющий избегать или исправлять нежелательные изменения кинетических и структурных свойств.

А. Изменение субстратной специфичности путем замены соответствующих аминокислот.

Для модулирования субстратного связывания к активному сайту энзима могут быть применены следующие общие правила в последовательном порядке, при условии, что имеются в наличии данные касательно 3Д /трехмерной/ структуры для комплексов энзим-субстрат или энзим-субстрат-аналог/ингибитор:

a/ выбрать все остатки и кристаллографически определенные молекулы воды, которые имеют по меньшей мере один атом в сфере размером 4 мутантная глюкозоизомераза с измененной субстратной   специфичностью и способ ее получения, патент № 2096457, окружающей атомы субстрата или связи аналога субстрата/ингибитора в активном сайте;

b/ выбрать все остатки, которые связаны силами Ван-дер-Ваальса с остатками и молекулами воды, полученными при применении a/

c/ исключить из списка остатков и молекул воды те, которые заняты в катализе, связывании кофактора /например, иона металла и нуклеотида/ и образовании важных междусубъединичных взаимодействий/ в случае олигомерных энзимов;

d/ исключить далее те остатки и молекулы воды, которые играют структурную роль. Для идентифицирования важной структурной роли может быть использовано построение модели, а также анализ консервативной природы "мишенных" остатков:

e/ чтобы смодулировать сродство к субстрату, один или более из выше выбранных остатков могут быть замещены путем изменения генетического кода для изменения одного или более следующих взаимодействия и свойств:

e1 стерическое препятствие посредством изменения размера остатка;

e2 гидрофобность /полярность субстратного окружения/;

e3 растворение субстратного окружения либо путем введения боковых цепей, которые сольватируют посредством образования водородных связей к группам внутри субстрата, либо путем замещений, которые изменяют распределение воды в субстратном окружении;

e4 гибкость индивидуальных остатков, сегментов или общей белковой структуры путем замещений, которые разрушают сеть водородных связей, снижая плотность местной упаковки в окружении субстрата или вводя полости.

Вышеприведенные общие положения можно применять в принципе ко всем энзимам при условии, что имеется достаточно данных о структуре. Чтобы продемонстрировать возможность выполнения этого комплекса правил, ниже обсуждается частный пример.

Б. Применение общих правил для модулирования субстратной специфичности глюкозоизомеразы.

Хотя выбор остатков путем применения критериев от a- до e-, которые приведены выше, демонстрируется здесь на частном примере, глюкозоизомеразы Actinoplanes missouriensis ясно, что благодаря экстенсивной гомологии подобные сайты замещения могут быть выбраны у глюкозоизомеразы, полученной из других видов. Упомянутая гомология последовательностей показана на фиг. 2, 3, которые дают построение глюкозоизомеразы, полученной из Actinoplanes missouriensis вида Ampullaria, Streptomyces violaceoruber, Streptomyces murinus, Streptomyces thermovulgaris вида Arthrobacter, Bacillus subtilis, Escherichia coli и Lactobacillus xylosus. Вышеописанный подход должен также вызывать после замещения аминокислот на соответствующих позициях изменение субстратной специфичности других глюкозоизомераз.

В общем можно предположить, что когда общая гомология более 65% предпочтительно более чем 74% [это минимальная гомология между Actinoplanes missouriensis и Streptomyces изомеразами, согласно Amore и Hollenberh, Nucl. Acids Res. 17, 7515/1989/] и особо предпочтительно, более чем 85% а также, когда сходна трехмерная структура, то замещения аминокислот приведут к похожим изменениям субстратной специфичности. Под "похожими" изменениями в субстратной специфичности подразумевают направление, в котором изменяются кинетические параметры, а не величина. В частности, ожидается, что глюкозоизомераза видов, принадлежащих к актиномицетам, обладает такой высокой степенью подобия, что изменение субстратных специфичностей благодаря аминокислотным замещениям на выбранных сайтах является похожим. Actinoplanes missouriensis является предпочтительным источником глюкозоизомеразы для мутирования.

Изменения в субстратной специфичности согласно настоящему изобретению включают все сочетания уменьшения и повышения Vmax и Km как для глюкозы, так и для ксилозы. Специалист поймет, что это также охватывает изменения в других кинетических параметрах. Кроме того, специфичности для других субстратов будут также соответствующим образом изменяться. Предлагаемые правила для изменения субстратной специфичности не ограничиваются упомянутым субстратами, они могут быть применены и к другим субстратам. Среди них - D-рибоза, L-арабиноза, D-аллоза и 6-дезогсиглюкоза.

Таким образом отдельно от обеспечения общего способа изменения субстратной специфичности настоящее изобретение прилагает этот способ к глюкозоизомеразе.

Выбранные аминокислотные замещения могут быть введены в ДНК, кодирующую глюкозоизомеразу, методами, хорошо известными специалисту /например, сайт- направленным мутагенезом/. ДНК, кодирующая глюкозоизомеразу или ее мутанты, может быть клонирована на векторе экспрессии, и эта конструкция может быть трансформирована в хозяина, в котором экспрессируется ген, транслируется мРНК и предпочтительно секретируется из клетки зрелый белок или предшественник. Затем белок может быть очищен. Стандартные процедуры можно найти у Маниатиса /Cold Spring Harbor, первое и второе изд. /1982/ и /1989/ соответственно/.

Применение этих методов приводит к получению мутантных энзимов глюкозоизомераз, имеющих аминокислотную последовательность, которая отличается по меньшей мере на одну аминокислоту от глюкозоизомеразы дикого типа, а сам мутантный энзим характеризуется тем, что он проявляет измененную субстратную специфичность. Вместо одиночных мутантов могут быть также получены двойные мутанты. Некоторые из двойных мутантов, созданных для сочетания желаемых свойств, показывают, что эти свойства являются по меньшей мере частично кумулятивными.

В настоящей заявке приводятся примеры на мутанты как с повышенной специфичностью по глюкозе, так и с повышенной стабильностью.

Субстратная специфичность новых энзимов может быть испытана на субстрате, который необходим для желаемого применения. Здесь особое внимание следует уделить кинетическим параметрам, касающимся глюкозы и ксилозы в качестве субстрата, а также относительным изменениям в этих примерах.

Фиг. 1 показывает схематическую карту остатков вокруг активного сайта A. missouriensis. Далее описываются методы конструирования мутантов, которые имеют более высокую относительную специфичность по глюкозе в сравнении с энзимом дикого типа.

Применяя данные выше правила к глюкозоизомеразе от Actinoplanes missouriensis и используя координаты структуры сорбитол-Cl-CO+2, получаем следующий список остатков.

Остатки и вода, выбранные по критерию /a/: 16 Trp, 54 His, 88 Met, 90 Thr, 94 Phe, 135 Val, 137 Trp, 181 Glu, 183 Lys, 217 Glu, 220 His, 24 Asp, 255 Asp, 294 Lys, 26 Phe и 4 молекулы воды, которые произвольно обозначены 491, 492, 690 и 887.

Дополнительные остатки были выбраны по критерию /б/. В этом случае берут все остатки внутри сферы размером 2 мутантная глюкозоизомераза с измененной субстратной   специфичностью и способ ее получения, патент № 2096457 вокруг вышеупомянутых остатков /по критерию а/.

Они дают следующие аминокислоты:

151 Leu, 17 Thr, 20 Trp, 25 Ala, 27 Gly, 52 Thr, 53 Phe, 55 Asp, 57 Asp, 87 Pro, 89 Val, 91 Thr, 92 Asn, 93 Leu, 95 The, 133 Thr, 134 Leu, 136 Leu, 138 Gly, 140 Arg, 179 Ala, 180 Jle, 182 Pro, 184 Pro, 186 Glu, 243 His, 244 Jle, 246 Leu, 254 Phe, 256 Gln, 257 Asp, 290 His, 291 Phe, 293 Tyr и 295 Pro.

Каталитические остатки: 54 His, 183 Lys, 220 His, катионные лиганды: 181 Glu, 217 Glu, 221 Glu, 245 Asp, 255 Asp, 292 Asp, вода 690 и промежуточный остаток /интерфейс/ 26 Phe исключены в результате применения критерия c/.

Остатки 16 Trp, 94 Phe и 137 Trp образуют консервативный гидрофобный кластер, определяющий общую форму участка /"кармана"/, связывающего субстрат, и они поэтому исключаются применением критерия d/. Кроме того, остаток 184 Pro "выбрасывается" по критерию /d/.

Предпочтительные для замещения остатки, получающиеся после применения вышеупомянутых критериев, показаны в табл. 1.

Единственные замещения у этих сайтов и/или сочетания замещений у различных сайтов могут привести к улучшению активности либо посредством освобождения от стерического препятствия, либо путем модуляции полярности сахарного окружения. Различные свойства, такие как изменение аффинности /сродства/ и/или каталитическая эффективность для различных субстратов могут быть изменены таким образом.

В особом случае повышения специфичности по глюкозе относительно ксилозы важно заметить, что субстратная специфичность для глюкозоизомеразы дикого типа снижается в направлении ксилола _мутантная глюкозоизомераза с измененной субстратной   специфичностью и способ ее получения, патент № 2096457 6 деоксиглюкоза -L глюкоза. Константа ингибирования для сорбитола больше, чем для ксилитола. Это наблюдение предполагает, что стерическое препятствие при связывании большего субстрата или ингибитора оказывает влияние на понижение специфичности. В кристаллической структуре комплекса энзим-сорбитолкобальт от A.missouriensis в пределах 4 мутантная глюкозоизомераза с измененной субстратной   специфичностью и способ ее получения, патент № 2096457 от гидроксильной группы, присоединенной к C6 сорбитола, обнаружены следующие остатки: 16 Trp, 88 Met, 135 Val, 90 Thr и молекула воды, обозначенная 491. Гидрофобные боковые цепи 16 Trp, 88 Met, 135 Val неспособны растворить гидроксильную группу. Гидроксильная группа боковой цепи 90 Thr осуществляет ротацию, открывая свою метил-группу для ингибитора. Молекула воды связывается мостиками 06 и 04 сорбитола. В структуре комплекса "энзим-кобальт", определенной в отсутствие субстрата или ингибитора, активный сайт содержит несколько молекул воды, присоединенных в позициях, грубо соответствующих позициям 01, 02, 03, 04 и 05 ингибитора в комплексе энзим-сорбитол-кобальт. Однако окружение, соответствующее позиции 06, неспособно присоединить молекулу воды. Это обеспечивает дополнительное доказательство, что гидроксильная группа на C6 не является должным образом сольватированной.

Замещения, которые были осуществлены в списке "мишенных" остатков /путем применения критериев a-e/, имели целью увеличить полярность окружения гидроксильных групп субстрата, в частности 06, и повысить "гибкость" активного сайта для присоединения большего субстрата.

Среди прочих были сделаны следующие единственные и комбинированные точечные мутации, ведущие к желаемым изменениям в специфичности по глюкозе.

25 Ala Lys: введение положительно заряженного остатка на расстоянии 6 - 8 мутантная глюкозоизомераза с измененной субстратной   специфичностью и способ ее получения, патент № 2096457 01, 02 и 03 субстрата. Разрушение водной структуры в интерфейсе. Замещение 26 Phe, который формирует гидрофобный "карман", присоединяющий G1 алифатические водороды субстрата.

243 His-Asn: повышенная гибкость благодаря изменениям в сети белково-водных водородных связей внутри "цилиндра".

290 His-Asn: повышенная гибкость благодаря изменениям в сети белково-водных водородных связей внутри "цилиндра", замещение воды.

290 His-Asn в соединении с 253 Lys-Asn: Мутация 253 Lys-Arg вводится для повышения стабильности или предотвращения гликанации /ЕР 0351029/, которая ведет к необратимой инактивации.

88 Met-Ser: повышение полярности связывающего кармана 06, повышение гибкости локальным изменением укладки белка.

88 Met-Ser в сочетании с 243 His-Asn: повышение полярности связывающего кармана 06, повышение гибкости локальным изменением укладки белка.

88 Met-Ser в сочетании 290 His-Asn: повышение гибкости благодаря изменениям в сети белково-водных водородных связей внутри цилиндра, замещение воды, повышение полярности связывающего кармана 06.

90 Thr-Ser: измененная гибкость боковой цепи, повышение гибкости локальным изменением укладки белка, изменение окружения связываемой с субстратом молекулы воды /492/.

90 Thr-Ser в сочетании с 135 Val-Gln: измененная гибкость боковой цепи в позиции 90, повышенная гибкость локальным изменением укладки белка, изменение окружения связываемой с субстратом молекулы воды /492/, замещение гидрофобного окружения полярным остатком, возможность прямой водородной связи между глютамином и гидироксильной группой C6.

90 Thr Ser в сочетании с 135 Val- Gln и 215 Asn Ser: измененная гибкость, замещение гидрофобного окружения полярными остатками, возможность удалить молекулу воды, возможность прямой водородной связи между 90 Ser и гидроксильной группой C6.

135 Val Thr: замещение гидрофобного окружения полярным остатком, 135 Val Gln: замещение гидрофобного окружения полярным остатком, возможность прямой водородной связи между глютамином и гидроксильной группой C6.

Эти предложенные мутации следует понимать как пример расчета, который может быть применен для создания новых глюкозоизомераз с желаемыми специфичностями. Однако специалисту будет ясно, что желаемые мутанты могут быть получены путем изменения "мишенных" остатков в аминокислоты, отличающиеся от упомянутых аминокислот подобным же образом.

В. Замена, удаление, перемещение связывающих молекул воды в активном сайте.

При сравнении структуры сорбитола со структурой ксилитола обнаруживается, что отдельные молекулы воды могут вмешиваться в соответствующее связывание глюкозы. Замещение этой воды подходящей аминокислотной боковой цепью или перемещение позиции воды путем введения более короткой боковой цепи в соответствующей позиции могут вызвать повышение эффективности.

Глюкозоизомераза-мутант H-290N, который имеет повышенную специфичность по глюкозе /K 250 мМ, Vmax 41 моль/мин/мг/ может служить в качестве примера. Удаление или перемещение связывающих молекул воды в активном сайте мутанта 6290N коррелирует с соблюдаемым увеличением активности по глюкозе. Похожие эффекты могут быть получены перемещением других связывающих молекул воды. Молекулы воды, находящиеся в пределах сферы 4 мутантная глюкозоизомераза с измененной субстратной   специфичностью и способ ее получения, патент № 2096457 вокруг атомов 03, 04, 05 и 06 субстрата являются кандидатами на удаление или перемещение мутантными соседними аминокислотами.

В следующих примерах для введения точечных мутаций в ген, клонированный из Actinoplanes missouriensis, применяется технология рекомбинантной ДНК. Этот белок сверхсинтезируется в E.coli, очищается и характеризуется "ин витро" и в условиях его применения, как описано в других источниках /Ван Тилбург, 1983. Тезис: Engineering aspects of biocatalysts in industrial conversion Дельфтский университет/.

Экспериментальная часть

А. Клонирование и экспрессия гена D-глюкозоизомеразы в E.coli

D-глюкозоизомераза /ГИ/ этот синоним, используемый для D-ксилозоизомеразы /D-ксилоза/ кетол-изомеразы /ЕС 5.3.1.5/, фермента, который преобразует D-ксилозу в D-ксилулозу. D-глюкозоизомераза от Actinoplanes missouriensis, продуцируемая от искусственного штамма E.coli, обозначается как EcoAm /DSM/ G1. чтобы различать ген Actinoplanes missouriensis, кодирующий ГИ, от аналогичного гена E.coli xyIA, первый далее обозначается G1.

Методы манипулирования молекулами ДНК описаны Маниатисом и др. /1982, Cold Spring Harbor Laboratory/ и Аусубелем /Ausubel и др. 1987, Current Protocols in Molecular. Biology/.

Общую ДНК из Actinoplanes missouriensis DSM 43046 частично переваривали Sau3A. Продукты переваривания фракционировали в градиенте плотности сахарозы, после чего фрагменты длиной от 2 до 7 кислооснований связывали с уникальным сайтом Bgl II плазмиды pEcoR 251 /ДСМ 4711/. Дефицитный по ксилозоизомеразе штамм E.coli AB 1186, описанный Howard-Handers et al /Genetics 53, 1966/, 1119/ и получаемый из штамма E.coli AB 1157 /DSM 1563/, подвергли трансформации в лигационной смеси, после чего культивировали в чашках с минимальной агаровой средой, содержащей 100 мг/л ампициллина и 0,2% /в/о/ ксилозы /MMX/, как описано Miller (Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, Ny/. Было получено 37 клонов, обозначенных как pAMI 1-37, которые культивировали в среде, содержащей 100 мг/л ампициллина. Рекомбинантную плазмидную ДНК выделяли и анализировали методом рестрикционного переваривания. Выявлены две группы плазмид. В одной из них плазмиды содержали вставку длиной 2,8 килооснований /E.G.pAMI 17/, а в другой вставку длиной 4,0 килооснований /E.C.pAMI 25/. Экстенсивный рестрикционный анализ показал, что вставки обоих типов содержали одинаковые участки длиной примерно в 2,0 килооснования. Определение последовательности этого участка методом химической деградации /A.Maxam, W.Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 1977, 560/ выявило наличие открытой считываемой структуры длиной 1182 нуклеотида, которую идентифицировали как кодирующий фрагмент ГИ. На фиг. 2, 3 представлена нумерация аминокислотной последовательности ГИ в сопоставлении с последовательностями других глюкозоизомераз. В нижеследующим изложении нумерация аминокислотных остатков дана в соответствии с фиг. 2, 3.

В условиях контроля транскрипции гена промотором RiG HTWARD /ПР/ бактериофага лямбда достигается очень высокий уровень экспрессии в E.coli. Процедура состояла в следующем.

Плазмиду pLK 94 /J.Botterman, M.Zabena, DNA 1987, 6, 583/ сначала модифицировали с целью элиминирования сайта PstI в гене бета-лактамазы. Для этого выделяли фрагмент EcoRI /PstI плазмиды pLK 70-70P длиной 880 пар оснований /Botterman, Zabena, там же/, содержащий N-концевой участок гена бета-лактамазы, и фрагмент EcoRI/ PstI плазмиды pLK 94 длиной 1700 пар основания, содержащий C-коцевой участок гена беталактамазы вместе с точкой инициации репликона. Последующее лигирование этих фрагментов приводило к образованию pLK 94P.

pAM 17 расщепляли, используя PstI, после чего смесь двух очищенных фрагментов длиной около 1800 пар оснований, один из которых содержал ген ГИ, лигировали в сайте PstI плазмиды pLK 94 P. Лигационную смесь использовали для трансформации E.coli /штамм АВ1886/. При выращивании на среде MMX получали трансформанты ГИ, устойчивые к ампициллину.

Плазмидную ДНК выделяли из нескольких трансформантов, полученных путем селекции, и охарактеризовали методом рестрикционного анализа. Плазмиду pLK 94 P, включавшую фрагмент PstI с геном ГИ, обозначали символом pLK 94ГИ. Ген ГИ был ориентирован таким образом, что уникальный сайт BamHI располагался на расстоянии примерно 470 пар оснований выше инициирующего кодона gTg.

Плазмиду pLK 70-70P расщепляли PstI и при помощи обработки ДНК-полимеразой I /фрагментом Кленова/ получали тупой конец, а затем переваривали ХbaI.

Плазмиду pLK 94 ГИ переводили в линейную форму, используя BamHi, после чего переваривали эндонуклеазой Bal 31. Забор проб производили в различные сроки. Реакцию прекращали добавлением в систему двунатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты /ЭДТА/. Полученные пробы подвергали расщеплению ХbaI и анализировали с помощью гелевого электрофореза с целью установления среднего размера резецированных BamHI XbaI фрагментов. Фрагменты размером от 1350 до 1450 пар оснований получали элюцией с геля, после чего лигировали их в плазмиде pLK 70-70P. Штамм K 514 E.coli/C.Colson et al. Genetics 52, 1965, 1043/ трансформировали в лигационной системе, после чего отбирали устойчивые к ампициллину трансформанты при 37oC. Плазмидную ДНК, выделенную из отдельных трансформантов, характеризовали с помощью рестрикционного анализа. Были отобраны 24 клона, содержавшие плазмиды с интактным ГИ. Их тестировали на способность продуцировать ЭКОАМИ /DCM/ ГИ. Культуры оставляли на ночь при температуре 37oC, после чего цельные клеточные экстракты фракционировали с помощью электрофореза в поликриламидном геле /ПААГЭ/, содержавшем 12,5% додецил-сульфата натрия /DDC/, как описано U.Laemmli /Nalure 227, 1970 /680/. Путем сравнения с контрольной культурой нетрансформированного штамма К514 установлена способность одного из клонов контролировать высоко активный синтез нового белка с мол. м. 42 килодальтона /кДа/. Методом иммуноблоттинга с использованием поликлональных антител к очищенному ГИ Actinoplanes missouriensis полученный белок был идентифицирован как ГИ. Плазмида, обеспечивающая интенсивную продукцию белка ГИ в E.coli /штамм К 514/, была обозначена как pLK70 ГИ.

Транскрипционный комплекс выделяли в составе фрагмента EcoFI-XbaI. После элюции с агарозного геля этот фрагмент лигировали в pMA 5-8 и pMC 5-8 /Stanssens et al. Nucleic. Acids Res. 17, 1989, 4441/, которые переваривали EcoRI и XbaI с образованием соответственно pMA5 ГИ и PMC5 ГИ. Векторы pMA 5-8 и pMC 5-8 депонировали в DCM под регистрационными номерами соответственно 4567 и 4555. Эти векторы в равной степени эффективно направляли синтез ГИ, причем уровень экспрессии достоверно не отличался от наблюдавшегося при использовании плазмиды pLK 70 ГИ.

Дальнейшее усиление экспрессии ГИ достигалось переводом инициирующего кодона gTg в триплет ATg. Эту операцию осуществляли посредством сайт-специфического мутагенеза, как описано Stanssens et al. (Jbid), используя в качестве олигонуклеотидной затравки последовательность

5"-GGACAGACATGGTTACC-3"

Б. Выделение продукта экспрессии.

Продукцию дикого и мутантного ферментов ГИ осуществляли в штамме K 514 E. coli при культивировании в среде, содержащей 1% триптона,1% NaCl, 0,5% дрожжевого экстракта и ампициллин в концентрации 100 мг/л /в случае вектора типа PMA/, либо хлорамфеникол в концентрации 25 мг/л /в случае вектора типа PMC/. Клетки выращивали в течение ночи при 37oC, после чего отделяли центрифугированием. Очистку фермента осуществляли следующим образом. Образовавшийся при центрифугировании клеточный осадок ресуспендировали в минимальном объеме 0,05 М трис /оксиметил/-аминометана /трис-HCl буфера/, содержавшем 0,1 мМ CaCl2, 10 мМ MgCl2, 0,1 М KCl, 5% глицерина и 5 мМ ЭДТА при pH 8,0. В суспензию добавляли лизоцим в конченой концентрации 1,0 мг/л. Смесь оставляли на 20 мин при 0oC, клетки лизировали давлением, центрифугировали /при 23000 в течение 30 мин/, после чего надосадочную жидкость разбавляли равным объемом 5% -ного раствора стрептомицинсульфата. Полученную смесь инкубировали в течение 3 ч при 4oC и снова центрифугировали /при 23000 g в течение 30 мин/. Конечный супернатант прогревали при 70oC /за исключением менее стабильных мутантов, которые прогревали при 50oC/ на протяжении 30 мин и снова центрифугировали. Верхнюю растворимую фазу разбавляли до концентрации 80% сернокислым аммонием. Осадок, содержавший основную часть ферментативной активности, после центрифугирования разводили 0,02 М трис-HCl буфером, 5 мМ ЭДТА и 0,85М сульфатом аммония. Затем проводили последовательное хроматографирование на фенил-суперозе, сафакриле S-200 HP и, наконец, на моно-Q-HR 10/10. Важно отметить, что для удаления металлических ионов во все использовавшиеся при хроматографии буферные растворы требовалось добавлять 5 мМ ЭДТА. Полученный фермент перед употреблением подвергли трехкратному диализу против 200 объемов 10 мМ триэтаноламина pH 7,2, содержавшего 10 мМ ЭДТА /конечная величина pH около 5,2/, а затем против 200 объемов 5 мМ раствора 2-N-морфолиноэтансульфоновой кислоты /МЭС/ pH 6,0 с трехкратной сменой буферного раствора. Содержание металлов в конечном ферментативном препарате определяли с помощью атомной абсорбционной спектрометрии /вариантный спектр 30/40/. Анализ выявил отсутствие металлов в белке. В качестве примера можно указать, что концентрация ионов кобальта, который с высоким сродством связывается с ферментом, составляли примерно лишь 1.10-4 моль на 1 моль мономерного ГИ. В случае отсутствия ЭДТА в буферных растворах для хроматографии концентрация кобальта достигала 0,5 моля на 1 моль мономерного фермента. Чистоту продукта оценивали с помощью электрофореза в ПААГ с DDC и окраски серебром, а также посредством обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии /ВЭЖХ/ на колонке VYDAC C4.

Как указывалось выше, мутагенез индуцировали по методу, описанному Stannssens et al. Зная желаемые аминокислотные замены и используя методику Stannes et al /хотя, разумеется, существуют и другие методы/, нетрудно понять, каким образом получают искомую мутантную молекулу глюкозоизомеразы.

В. Получение рекомбинантного штамма Streptomyces lividans, экспрессирующего мутантную ГИ.

Для конструирования штаммов Streptonyces, экспрессирующих мутантную ГИ, были использованы: промежуточный вектор pIj 448-101, содержащий области начала репликации E.coli /pBR 322/ и Streptomyces (pIj101), ген резистентности к ампициллину, функционирующий в E.coli, гены резистентности к эритромицину и тиострептону, функционирующие у Streptomyces.

Этот вектор был сконструирован встройкой большого PstI-фрагмента pIj 486 /см. Mol. Gen. Genet. 1986, 203, 468 470/ в pIj 488.

Вектор экспрессии был получен лигированием мутантного гена ГИ с EcoRI - Sph фрагментом pIj 488-101.

Результирующая плазмида pWGIмутантная глюкозоизомераза с измененной субстратной   специфичностью и способ ее получения, патент № 2096457git была введена в S.lividans.

Полученный штамм содержал указанную плазмиду и продуцировал мутантную ГИ.

Для того, чтобы минимизировать плазмиду экспрессии, был делетирован ген устойчивости к эритромицину путем обработки XbaI, а затем проведено лигирование. Введение полученной плазмиды pWgxмутантная глюкозоизомераза с измененной субстратной   специфичностью и способ ее получения, патент № 2096457git в клетки S.lividans обеспечивало высокий уровень экспрессии целевого белка /продукция его примерно в 3 раза превышала продукцию в E.coli/.

Выделение и очистку экспрессированной мутантной ГИ осуществляли, как описано выше.

Г. Испытание энзиматической активности экспрессированного продукта.

Энзиматическая активность глюкозоизомеразы испытывалась следующим образом /1 единица энзиматической активности продуцирует 1,0 мкмоль продукта - D-ксилулозы или D-фруктозы в минуту; поэтому специфическая активность выражается в виде единиц на мг энзима ГИ/.

ГИ активность испытывалась непосредственно измерением увеличения поглощения 278 нм ксилулозой, продуцированной при 35oC путем изомеризации ксилолозы глюкозоизомеразами. Это испытание осуществляли в 50 мМ триэтаноламиновом буфере с pH 7,5, содержащем 10 мМ MgSO4 в присутствии 0,1М ксилозы. Конечная концентрация глюкозоизомеразы в эксперименте составляла мутантная глюкозоизомераза с измененной субстратной   специфичностью и способ ее получения, патент № 20964570,01 мг/мл, эту концентрацию точно определяли перед ее разбавлением в энзиматической экспериментальной смеси, путем определения поглощения спектра и использованием коэффициента затухания 1,08 при 278 нм для раствора энзима концентрацией 1,0 мг/мл.

В двойном испытании D-сорбитол-дегидрогеназы энзиматическое определение D-ксилозы осуществляли при 35oC, как описано ранее /Kesters-Hilderson и др. Enzym Microb. Technol. 9(1987, 145) в 50 мМ триэтаноламине, pH 7,5, 10 мМ MgSO4 и 0,1 М ксилозы, в присутствии мутантная глюкозоизомераза с измененной субстратной   специфичностью и способ ее получения, патент № 20964572мутантная глюкозоизомераза с измененной субстратной   специфичностью и способ ее получения, патент № 209645710-8 М D-сорбитол-дегидрогеназы /1-идитол: NAD оксидоредуктаза, Ec 1.1.14/, и 0,15 мМ NaDH. Финальная концентрация глюкозоизомеразы в этом опыте составляли мутантная глюкозоизомераза с измененной субстратной   специфичностью и способ ее получения, патент № 20964572мутантная глюкозоизомераза с измененной субстратной   специфичностью и способ ее получения, патент № 209645710-3 мг/мл.

С глюкозой в качестве субстрата активность ГИ может быть испытана путем измерения D-фруктозы, продуцированной во время реакции изомеризации с использованием цистеин-карбазольного метода /CCM/, основанного на реакции кетосахаров с карбазолом в кислотах для производства фиолетового продукта /Dische и Borenfreund, J.Biol, Chem. 192 /1951/ с. 583/. Альтернативно, D-фруктоза, продуцированная во время реакции изомеризации, может быть определена энзиматически с использованием сорбитолдегидрогеназы и NADH.

В качестве меры специфичности иногда используют соотношение Vmax/Km /Уэллс и др. см.выше/. Для мутантов значения Vmax/Km по ксилозе и по глюкозе рассчитывали обычным образом. Измерения параметров по ксилозе проводили при 35oC, тогда как параметры по глюкозе определяли при 60oC. Эти температуры выбраны из практических соображений. Чтобы установить, что рассуждения об относительной специфичности применимы вообще, независимо от температуры измерения, проводили несколько измерений по ксилозе при 60oC как для дикого, так и для мутантного энзима. Было обнаружено, что заключения, которые могут быть выведены касательно устойчивого состояния параметров при 60oC, подобны заключениям при 35oC.

Пример 1. Мутанты с улучшенными католическими свойствами.

Трехмерная структура Actinoplanes missouriensis глюкозоизомеразы была изучена для выбора тех остатков, которые при их изменении должны были обеспечить улучшенное связывание субстрата, каталитическую активность или субстратную специфичность. Остатки, непосредственно или косвенно /посредством другого остатка или молекулы воды/ в пределах 4 мутантная глюкозоизомераза с измененной субстратной   специфичностью и способ ее получения, патент № 2096457 от 01-06 субстрата были отобраны и изменены сайт-направленным мутагенезом с помощью pMA, pMC-векторной системы /Stanssens и др. Nucl. Acids Res. 17/1989, 4441/.

В табл. 2 ниже показаны энзиматические параметры нескольких из этих выбранных мутантов.

Условия для определения энзиматических параметров были следующими:

Vmax, ксилоза: 35oC, 10 мМ Mg2+, pH 7,5

Vmax, глюкоза: 60oC, 10 мМ Mg2+, pH 7,5

Km, ксилоза: 35oC, 10 мМ Mg2+, pH 7,5

Km, глюкоза: 60oC, 10 мМ Mg2+, pH 7,5

Активности измеряли на очищенных энзимах. Двойной опыт с сорбитол-дегидрогеназой использовали для ксилозы, а для глюкозы использовали цистеин-карбазольный или прерывистый сорбитолдегидрогеназный методы.

Пример 2. Глюкозоизомераза с улучшенной аффинностью к глюкозе.

В табл. 3 сведены измеренные значения Km у различных мутантов по сравнению с энзимом дикого типа. Можно видеть, что все эти мутанты имеют более низкое значение Km по глюкозе. Это означает, что связывание субстратной глюкозы повысилось. Более того, что у некоторых из этих мутантов значение Km по глюкозе не улучшилось, но стало хуже, как показано в табл. 2. Так, мутанты M88S, T90S, T90SV135Q, H290N, K294Q, H243N обладают улучшенным соотношением Km ксилоза /Km глюкоза по сравнению с энзимом дикого типа.

Пример 3. Глюкозоизомеразы с повышенной каталитической активностью по глюкозе.

Мутантами глюкозоизомеразы с повышенной каталитической активностью по глюкозе являются E186D, K258K, H290N и сочетания мутаций с H290N, L258K не был выбран с использованием критериев, описанных в общей методике, поскольку лейцин в позиции 258 находится в 10 мутантная глюкозоизомераза с измененной субстратной   специфичностью и способ ее получения, патент № 2096457 от субстрата или ингибитора.

В табл. 4 показано отношение Vmax к Vmax дикого типа. Показано повышение от 8,9% до 43% Это вызывает более быструю изомеризацию предпочтительной субстратной глюкозы.

Vmax для глюкозы выражен в микромолях /мин/мг.

Мутант H290N показывает Vmax для глюкозы 41.80, что лучше, чем у фермента дикого типа. Более того, Vmax ксилозы не улучшился. Поэтому улучшилось соотношение Vmax глюкоза/Vmax ксилоза мутанта H290N, превращая этот мутант в более "правильную" глюкозоизомеразу.

Пример 4. Структура глюкозоизомеразы H290N.

В кристаллической структуре мутанта H290N наблюдается, что амидная группа боковой цепи Asn может быть "сверхнагружена" имидазольной группой дикой молекулы. Как следствие, амид у 290Asn сохраняет водородную связь с 245 Asp. В дополнение Oмутантная глюкозоизомераза с измененной субстратной   специфичностью и способ ее получения, патент № 2096457I атом 290 Asn может иметь водородную связь с гидроксилом 12Ser.

Гидроксильная группа 52 Thr, связанная водородной связью с ne2 290His в диких структурах, не может более быть связанной водородной связью с 290 Asn. У мутантов гидроксильная группа 52 Thr ротирует /скручивание X"/ таким образом, что она связывается водородной связью с молекулой воды /X" дикого типа 71o, X" мутанта 172,5o/. Эта молекула воды, присутствующая в структуре мутанта, расположена как 8 Metsd атом /расстояние 0,45 мутантная глюкозоизомераза с измененной субстратной   специфичностью и способ ее получения, патент № 2096457/ у дикого типа. Введение молекулы воды в эту позицию, которая образует водородную связь с 52 Thr, усиливает новую ориентацию боковой цепи 88 Met в мутантной структуре по сравнению с диким типом. В дополнение 52 Thr боковая цепь связана водородной связью в мутанте с водородом главной цепи 53 Phe /d 2,23 мутантная глюкозоизомераза с измененной субстратной   специфичностью и способ ее получения, патент № 2096457/.

Реориентация 88 Met боковой цепи в H290N делает необходимым перемещение 243 His. В дополнение молекула воды /490/, соединяя мостиком 12 Ser с 243 His в структуре дикого типа, исчезает ввиду стерического препятствия с метиловой группой 52 Thr и новой ориентации 88 Met. 243 His принимает другой X" угол /у дикого типа X" 169o, а у мутанта X" 77o/, препятствуя водородной связи с 215 Asn. Пространство, оставленное имидазолом 243 His, заполняется молекулой воды /616/, водород которой связан с амидом 215 Asn /не показано/. В дополнение водород этой молекулы воды связан с положением /872/, водород которого связан с водородным атомом 244 Jle главной цепи.

Дополнительное свидетельство изменения гибкости боковых цепей в C6 гидроксильном окружении дают температурные факторы для остатков 52 Thr, 88 Met и 243 His, которые вдвое выше, чем по сравнению со структурой дикого типа.

Как результат сложного переустройства, вызванного мутацией H290N, три молекулы воды сольватируют C6 гидроксильную группу сорбитола.

Это является примером того, что замещение, перемещение или перестановка связывающих водных молекул в активном сайте может привести к желаемым изменениям в энзиматической активности.

Пример 5. Глюкозоизомераза с улучшенным субстратным связыванием.

В табл. 5 показаны несколько мутантов с улучшенным связыванием ксилозы. A25K и E186Q обладают пониженным Km для как ксилозы, так и глюкозы. E186Q также обладает пониженным Km для фруктозы. Энзимы с высокой субстратной афинностью являются предпочтительными при условии низких концентраций субстрата.

Значения Km выражены в мМ.

Следует отметить, что только E186Q и A25K имеют улучшенную афинность к обоим испытанным субстратам.

Пример 6. Мутант с улучшенной специфичностью по глюкозе.

Относительная специфичность определяется как соотношением Vmax/Km для ксилозы, деленное на соотношение Vmax/Km для глюкозы. Поэтому, если это число меньше, чем для дикого типа, то относительная специфичность по глюкозе повысилась.

В табл. 6 показаны мутантные глюкозоизомеразы с повышенной относительной специфичностью по глюкозе. Мутанты V135Q, T90S V135Q и T90S V135Q N215S имеют значительно сниженную активность по ксилозе. Даже хотя в абсолютных выражениях активность по глюкозе уменьшилась, соотношение VmaxY/Km по глюкозе значительно улучшилось по сравнению с ксилозой. Поэтому эти мутанты изменили свою специфичность, став настоящими глюкозоизомеразами, в конечном счете, без ксилозоизомеразной активности.

Сочетание мутаций T90S, V135Q и N215S в тройном мутанте показывает, что эти мутации являются дополнительными в отношении кинетических параметров /см. табл. 6/.

Пример 7. Структурные изменения, происходящие в мутанте M88SH 243N

Субстратная специфичность может быть также изменена путем аминокислотных замещений, приводящих к аминокислотам, которые демонстрируют большую гибкость боковой цепи.

В кристаллической структуре мутанта M88SH 243N наблюдается, что 243Asn и 52 Thr принимают множественные конформации, отражая увеличение гибкости в окружении боковой цепи C6 гидроксильного окружения субстрата.

Наблюдается также, что Cмутантная глюкозоизомераза с измененной субстратной   специфичностью и способ ее получения, патент № 2096457 позиции смежных бета-нитей "цилиндра", содержащие остатки 88 Ser, 52 Thr, 135 Val и 177 Arg, смещены на 0,3 0,5 мутантная глюкозоизомераза с измененной субстратной   специфичностью и способ ее получения, патент № 2096457, делая внутренность цилиндра немного больше.

Пространство, создаваемое мутацией 88 Met на 88 Ser, заполняется дополнительной молекулой воды. Наблюдаемые локации других боковых цепей и небольшое перемещение "цилиндра" позволяют осуществить введение другой молекулы воды, а также перемещение молекулы воды в направлении C6 гидроксила субстрата.

Пример 8. Мутанты с улучшенными свойствами в присутствии Mn2+.

В качестве бивалентного катиона во время изомеризации помимо Mg2+ также может быть использован Mn2. Mn2+ обычно не используют в промышленных способах изомеризации, его применение может предусматриваться для таких случаев, в которых ионы металла не подходят для получения качественного продукта.

Мутант E18Q показывает улучшенную каталитическую активность по глюкозе в присутствии Mn2+, см. табл. 7.

Использованы методы по примеру 1. Улучшение Vmax глюкозы является 3 4-кратным по сравнению с энзимом дикого типа. Улучшение Km глюкозы является 4-кратным. Поскольку 186E находится в окрестностях позиции металла /см. фиг. 1/, можно предвидеть, что 186Q лучше сочетается с большим радиусом Mn2+, чем с радиусом Mg2+.

Пример 9. Испытание мутанта K253RH290N на применение.

Мутант H290N показывает повышенную активность по глюкозе, как можно видеть в табл. 4. Табл. 6 показывает, что специфичность к глюкозе также увеличена у этого мутанта.

Этот мутант иммобилизовали, как описано в ЕР-0351029 /см. пример 7 этого патента/. Испытание глюкозоизомеразы дикого типа и этого мутанта на их применение осуществляли, как описано в указанном патенте /см. пример 8/. Стабильность указывается по первому порядку константы разложения /Кд, чем ниже эта константа разложения, тем более устойчив данный фермент/. Табл. 8 дает значения Кд для глюкозоизомеразы дикого типа и мутанта.

Как можно видеть из табл. 8, H290N является дестабилизированным по сравнению с глюкозоизомеразой дикого типа. Обнаружено, что K253R стабилизирует глюкозоизомеразу дикого типа более чем в три раза. Сочетание H290N с мутацией стабильности K253R показывает, что эти характеристики складываются. Кроме того, из табл. 4 можно видеть, что активность по глюкозе K253RH290 не ухудшена мутацией стабильности, напротив, двойной мутант показывает даже большую активность по этому субстрату, чем мутант H290N.

Поскольку затрагивается также специфичность, в табл. 6 можно видеть, что мутации K253R незначительно влияют на специфичность мутанта H290N.

Таким образом, можно сделать вывод, что мутанты активности могут стабилизироваться путем введения мутаций, которые показаны для стабилизирования мутанта дикого типа.

Следует иметь в виду, что вышеприведенные примеры предназначены для того, чтобы продемонстрировать концепцию изобретения, а не для того, чтобы ограничить его объем. Учитывая это, ясно, что сочетания вышеупомянутых мутаций в соединении с другими мутациями, ведущими к изменению характеристик, например термостабильности, сдвинутому оптимуму pH или связыванию металлов, находятся в пределах объема объекта изобретения.

Класс C12N9/92 глюкозная изомераза

Класс C12N15/61 изомеразы (5)

Класс C12N15/00 Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев

способ идентификации вызывающих муковисцидоз мутаций в гене cftr человека, набор праймеров, биочип, набор мишеней и тест-система, используемые в способе -  патент 2529717 (27.09.2014)
рекомбинантная днк, кодирующая гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (g-csf) и рекомбинантная плазмида рas017, обеспечивающая синтез g-csf в клетках escherichia coli -  патент 2529363 (27.09.2014)
рекомбинантный штамм бактерий escherichia coli n41 (pbpun4/mr)-продуцент сайт-специфической эндонуклеазы рестрикции bpun4i -  патент 2529362 (27.09.2014)
рекомбинантная плазмидная днк ppa-oprf-eta, кодирующая синтез рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa, штамм escherichia coli pa-oprf-eta - продуцент рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa и способ получения рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa -  патент 2529359 (27.09.2014)
модифицированная дрожжевая двугибридная система для эффективного исследования взаимодействия между белками и их доменами. -  патент 2529356 (27.09.2014)
нуклеиноваяя кислота, обладающая активностью гена фосфатазы фосфатидной кислоты (варианты), белок, рекомбинантный вектор, трансформант и способ получения композиции жирной кислоты -  патент 2528875 (20.09.2014)
аптамер, специфичный к опухолевым тканям легкого человека -  патент 2528870 (20.09.2014)
лейколектины и их применение -  патент 2528860 (20.09.2014)
дисплей на поверхности клеток полипептидных изоформ на основе прочитывания терминирующего кодона -  патент 2528858 (20.09.2014)
модифицированный фактор виллебранда с удлиненным полупериодом существования in vivo, его применения и способы получения -  патент 2528855 (20.09.2014)
Наверх