способ выделения натриевой соли днк из тканей животного происхождения

Формула изобретения

Способ выделения натриевой соли ДНК из тканей животного происхождения, включающий обработку замороженного исходного сырья в нагретом растворе хлористого натрия, фильтрацию смеси, очистку фильтрата, концентрирование его, добавление к полученному концентрату этилового спирта в соотношении 1: 2 и сушку осадка, отличающийся тем, что в качестве замороженного исходного сырья используют гомогенизированные отходы производства препарата лидазы, обработку в растворе хлористого натрия ведут при температуре 80 - 90^oC в течение 1 ч с последующей выдержкой при этой температуре еще 1 - 1,5 ч, причем раствор хлористого натрия используют с концентрацией 10,0 - 10,5%, очистку фильтрата проводят трехкратно через пористый материал, концентрирование - в 5 - 6 раз, а сушку осуществляют при 40 - 90^oC.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к получению биологически активных веществ из ранее неиспользуемых отходов производства препарата лидазы, а именно к способу получения натриевой соли ДНК, которая может быть использована в качестве пищевой добавки.

Известен способ получения дезоксирибонуклеиновой кислоты из молок осетровых рыб путем гомогенизации молок, промывания их 0,85%-ным раствором хлорида натрия, депротеинизации комплекса ДНК-белок протосубтилином, выделенным из Bacillus Zubtilis (авторское свидетельство СССР N 780444, C 07 D 13/06, 1985).

Недостатками указанного способа являются длительность и усложненность процесса, большой расход этилового спирта и работа с микроорганизмами.

Наиболее близким аналогом к заявленному способу является способ выделения натриевой соли ДНК из молок осетровых рыб, включающий гомогенизацию замороженных молок осетровых рыб, обработку их в нагретом растворе хлористого натрия, охлаждение смеси, фильтрацию, очистку фильтрата, концентрирование его, добавление к полученному концентрату этилового спирта в соотношении 1: 2 и сушку осадка (патент РФ N 2034554, кл. A 61 K 35/60, 1995).

Недостатком данного способа является сложная многоэтапная технология с использованием большого количества реактивов (цитрат натрия, додецилсульфат натрия, хлорид натрия, кизельгур), оборудования (реактор, высокооборотная мешалка, нутч-фильтр, многокамерный аппарат-электродиализатор, фильтр прессного типа, сепараторы-турбулизаторы, модуль магнитостриктора, установка "Биокон"). Указанное оборудование используется для проведения сложных технологических операций: перемешивание с кизельгуром на высокооборотной мешалке, электродиализное обессоливание и концентрирование, ультразвуковая обработка).

Технический результат данного изобретения заключается в упрощении технологии производства препарата и улучшении экологии.

Сущность изобретения заключается в следующем. В качестве исходного сырья используют гомогенизированные замороженные отходы производства препарата лидазы, обработку смеси в растворе хлористого натрия осуществляют при температуре 80-90^o в течение 1 часа с последующей выдержкой при этой температуре еще 1-1,5 часа, причем раствор хлористого натрия используют в концентрации 10,0 - 10,5%, очистку фильтрата проводят через пористый материал 3-кратно, концентрируют в 5 - 6 раз, а сушку ведут при температуре 40 -90^oC.

Замороженные отходы производства препарата лидазы представляют собой стерильный гомогенат бычьих семенников с большим содержанием ДНК, из которых извлечен фермент гиалуронидаза, что позволяет использовать дешевое сырье для получения препарата и улучшать экологию.

Также использование гомогенизированных замороженных отходов производства препарата лидазы исключает процесс гомогенизации и сохраняет стерильность гомогената. Замораживание, а затем оттаивание и прогревание в течение 2 - 2,5 часов при температуре 80 - 90^oC в высококонцентрированном растворе хлорида натрия приводит к большому выходу ДНК, что позволяет исключить обработку реакционной массы ультразвуком. Трехкратная очистка ДНК-содержащего раствора через пористый материал исключает использование кизельгура на нутч-фильтре, что также упрощает технологию получения ДНК.

Концентрирование в 5 - 6 раз по объему позволяет сократить в 5 - 6 раз количество этилового спирта, необходимого для осаждения ДНК. Кроме того, этиловый спирт после перегонки может быть использован многократно.

Способ осуществляют следующим образом.

Пример 1.

Берут 500 г замороженного сырья, размораживают, добавляют 2 л 10%-ного раствора хлорида натрия с pH 7,0. Смесь нагревают в течение 1 часа до температуры 90^oC и выдерживают при этой температуре еще 1 час при постоянном перемешивании. Затем в горячем виде смесь фильтруют последовательно через миткаль, пищевой картон и стерильный фильтр 0,22 нм "Миллипор". Полученный стерильный фильтрат концентрируют на ультрафильтрационных половолоконных разделительных аппаратах в 6 раз по объему. К концентрату добавляют этиловый спирт в соотношении 1 часть концентрата и 2 части этанола. Выпавший осадок отделяют и высушивают в термостате при температуре 40^oC.

Получают 7,1 г сухого порошка, в котором содержится 48% ДНК.

Пример 2.

Берут 1 кг замороженного сырья, размораживают при комнатной температуре, заливают 4-мя литрами 10,5% раствора хлорида натрия с pH 6,9. Смесь нагревают 1 час до температуры 80^oC и выдерживают при этой температуре 1,5 часа при постоянном перемешивании.

Затем в горячем виде смесь фильтруют последовательно через фильтровальную бумагу, фильтр 1,2 нм "Владипор" и стерильный фильтр 0,22 нм "Владипор". Полученный стерильный фильтрат концентрируют на ультрафильтрационных половолоконных разделительных аппаратах в 5 раз по объему. К концентрату добавляют перегон уже использованного этилового спирта с содержанием последнего 85 - 87% в соотношении 1 часть концентрата и 2 части перегона. Выпавший осадок отделяют и высушивают в термостате при температуре 90^oC.

Выход: 13 г сухого порошка, содержащего 47% ДНК.

В опытах на животных (кроликах, мышах) была изучена, в соответствии с требованиями Фармкомитета России, острая и хроническая токсичность полученного препарата ДНК.

Острая токсичность исследована на белых мышах. Препарат ДНК вводили однократно перорально в дозах 1; 5 и 10 г/кг живого веса. При всех введенных дозах мыши были живы и никаких визуальных изменений в их поведении и внешнем виде не выявлено. Мыши, которым была введена доза 10 г/кг, после эксперимента забиты. При гистологических исследованиях их внутренних органов отклонений от нормы не обнаружено.

При исследовании хронической токсичности препарат вводили кроликам перорально в течение 3-х месяцев ежедневно в дозе 10 мг/кг живого веса. Эта доза в 10 раз превышает суточную норму пищевой добавки для человека. Результаты оценки хронической токсичности препарата представлены в таблице.

Из представленных результатов видно, что препарат, содержащий ДНК, положительно влияет на показатели крови животных.

Таким образом, предложенный способ позволяет по упрощенной технологии получить, улучшая экологию, нетоксичный, безвредный препарат натриевой соли ДНК из отходов производства лидазы, пригодный для использования в качестве пищевой добавки.