способ определения антиоксидантной активности супероксиддисмутазы и химических соединений

Формула изобретения

1. Способ определения антиоксидантной активности супероксиддисмутазы и химических соединений путем оценки их способности ингибировать скорость реакции аутоокисления адреналина в щелочной среде, которую оценивали спектрофотометрически по величине оптической плотности продукта аутоокисления адреналина, образующегося в отсутствии и присутствии исследуемых препаратов, отличающийся тем, что антиоксидантную активность определяют по накоплению продукта аутоокисления адреналина, поглощающего при длине волны 347 нм (волновое число 28,8).

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что добавляют адреналин, используя готовую аптечную форму 0,1% раствора адреналин гидрохлорида.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что pH среды, в которой проводят реакцию, составляет не менее 10,65 ед.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что реакцию проводят при любой комнатной температуре, но не ниже 15^oС.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области аналитической биохимии, в частности к клинической медицинской биохимии и фармакологии. Оно может быть использовано в биологии и медицине при исследованиях с целью оценки антиоксидантных свойств биологического материала и различных химических соединений, претендующих на роль антиоксидантов. Подобная оценка крайне необходима, поскольку нужно контролировать ситуации, связанные с образованием активных форм кислорода в условиях окислительного стресса и индентифицировать антиоксидантные свойства химических соединений, используемых для антиоксидантной зашиты, что крайне важно в сложной экологической обстановке сегодняшнего дня.

Кроме того, в медицинской практике для установления диагноза, наблюдения за процессом лечения и характером течения болезни (обострение, стадия ремиссии) важно контролировать состояние системы антиоксидантной защиты организма.

Для выявления антиоксидантного статуса организма определяют активность первого, стоящего на страже защиты от супероксидных радикалов фермента, супероксиддисмутазы - СОД (КФ 1.15.1.1.), катализирующей реакцию дисмутации, в результате которой происходит превращение высокореакционного аниона радикала кислорода (супероксид аниона, O^-₂) в относительно менее активную перекись водорода и молекулярный кислород

O^-₂ + O^-₂+ 2H⁺ = H₂O₂ + O₂

По величине активности этого фермента (наряду с другими последующими ферментами - глютатионпероксидазой и каталазой, - инактивирующими уже продукт реакции СОД - перекись водорода) можно судить об антиоксидантном статусе ткани или организма в целом. Активность СОД определяют часто в гемолизате эритроцитов, поскольку именно в эритроцитах имеется мощная антиоксидантная защитная система. Величина активности фермента характеризует его способность утилизировать образующиеся супероксидные радикалы, что дает информацию о состоянии системы антиоксидантной защиты организма как в физиологических условиях, так и в условиях патологического процесса.

Известен способ измерения активности СОД, основанный на ее способности тормозить аутоокисление адреналина в щелочной среде:

1. Me Cord J.M., Fridovich I. / J. Biol. Chem. - 1969. - Vol. 244, N 22. - P. 6049-6055.

2. Misra H.P., Fridovich 1. / J. Biol. Chem. -1972.- Vol. 247, N 10. - P.3170-3175.

Аутоокисление адреналина, попадающего в щелочную среду, инициируется супероксидными радикалами, возникающими в результате внутримолекулярных перестроек адреналина в ходе его превращения через адреналинхинон в адренохром. Фермент СОД, перехватывая супероксидные радикалы, ингибирует образование адренохрома. Этот подход авторы используют как способ оценки активности фермента [1, 2]. В соответствии с предлагаемым способом по количеству адренохрома, продукта аутоокисления адреналина в щелочной среде, имеющего максимум поглощения в области 480 нм, оценивают активность препаратов, содержащих СОД. Измерение количества образующегося адренохрома проводят на спектрофотометре при длине волны 480 нм (волновое число 20,8) в 0.05 М карбонатном буфере, pH 10,1 или 10,2, при температуре 25 - 30^oC и концентрации адреналина от 200 до 600 мкМ. Так как спонтанные реакции дисмутации протекают обычно медленно и стационарные концентрации супероксида, которые могут быть в такой химической реакции, низкие, то для выявления эффективность работы СОД в исследуемую систему вносят дополнительный источник генерации супероксидных анионов. В качестве такого источника O^-₂ авторы использовали ферментативную систему ксантин-ксантиноксидаза.

Недостатки этого метода: невысокая скорость реакции (даже в присутствии ксантин-ксантиноксидазы прирост величины оптической плотности конечного продукта окисления адреналина составляет 0,005-0.026 опт.ед./мин); необходимо термостатирование образцов (25 - 30^oC) и требуются дорогие коммерческие препараты (ксантин, адреналин, ферменты ксантиноксидаза и СОД). Наиболее близким к предлагаемому способу по набору технических средств является метод, который используют Симонян М.А., Набалдян P.M. (Биохимия. - 1975. - Т. 40, вып. 4., с. 726-734) [3]. Способ основан также на реакции аутоокислении адреналина в щелочной среде и является модификацией метода [1, 2]. Определение адренохрома проводят не применяя дополнительных источников генерации супероксида, однако, чтобы измерить достаточное количество образовавшегося адренохрома в реакционную среду вносят высокую концентрацию адреналина - 1 мМ (т.е. для приготовления рабочего 0,01М раствора адреналина необходимо иметь коммерческий сухой препарат). Измерение проводят также при температуре выше комнатной (25^oC), в 0.2 М карбонатном буфере, pH 10,2, используя длину волны 490 нм.

Недостатки метода: необходима высокая концентрация адреналина в пробе и, следовательно, требуется коммерческий препарат адреналина, измерение проводят при термостатировании образцов.

Известны и другие способы определения СОД, которые имеют более высокую чувствительность в сравнении с "адренохромными" методами [1-3], однако методы трудоемкие, скорости реакции невысокие (0.015 оп. ед. /мин [3] или 0.0065-0.044 оп. ед./мин [4]), измерения проводят при термостатировании образцов [3] и требуются дорогие коммерческие препараты, такие как: нитросиний тетрозолий (НСТ), цитохром C и ксантин-ксантиноксидаза [3] или НАДН- феназинметасульфат (НАДН-ФМС) [4].

3. Beauchamp C., Fridovich I. / Analytic. Biochem. - 1971. - Vol. 44. - P. 276-287.,

4. Nishikimi N., Rao N.A., Yagi K. / Bioch. Bioph. Res. Commun.- 1972.- Vol. 46, N 2.- C.849-854.]

Таким образом, как описано выше, известные методы определения активности фермента СОД требуют дорогих химических реактивов, таких как: ксантин и ксантиноксидаза или НАДН и ФМС, нитросиний тетрозолий или цитохром C, коммерческий препарат СОД, высокие концентрации адреналина. Реакцию проводят при температуре 25-30^oC, т.е. необходимо термостатирование образцов.

Задачей настоящего изобретения является создание более простого способа определения антиоксидантной активности СОД и расширение его возможностей для использования как тест-системы при оценке антиоксидантных свойств биологических материалов (гемолизаты эритроцитов крови) и различных химических соединений за счет применения абсолютно доступных недорогих химические реактивов при сохранении высокой чувствительности.

Решение поставленной задачи достигается тем, что в известном способе определения антиоксидантной активности СОД по реакции аутоокисления адреналина в щелочной среде проводят по накоплению продукта его окисления - адренохрому, имеющего поглощение при 480 нм, согласно предлагаемому способу активность СОД и оценку антиоксиданных свойств химических соединений проводят по ранее образующемуся новому продукту аутокисления адреналина, имеющему поглощение при 347 нм.

Накопление этого соединения, достаточного для количественной оценки, происходит в течение 1-3 мин от момента добавления в щелочной раствор низких концентраций адреналина (230 мкМ), что позволяет использовать готовую аптечную форму 0.1% раствора адреналин гидрохлорида. Его вносят в 0,2 М карбонатный буфер, pH 10,65, при комнатной температуре (не ниже 15^oC), в отсутствии дополнительных источников генерации супероксидных радикалов и измеряют поглощение при 347 нм через 3 мин. Опытным путем было установлено, что коммерческий препарат СОД, гемолизат эритроцитов, известные антиоксиданты (аскорбат, цистеин) способны ингибировать процесс накопления этого соединения, что позволяет использовать этот способ измерения как тест-систему для экспресс оценки антиоксидантных свойств различных препаратов и химических соединений. Существенным преимуществом предлагаемого подхода является возможность использования легко доступных, недорогих химических реактивов: 0.1% аптечного раствора гидрохлорид адреналина и 0.2 М карбонатного буфера, pH 10.65.

В доступных источниках научно-технической и патентной информации, включая просмотр базы данных Medline и PubMed, журналы "Изобретения РФ", патентная база данных США (1976-1999 г.г.), "Изобретения стран мира", тематическая подборка вып. 84, N 1-24 и вып. 8 N 1-24, не выявлены сведения об определении активности СОД, основанные на измерении продукта реакции аутоокисления адреналина, поглощающего при 347 нм. Поэтому предлагаемое техническое решение способа обладает новизной и соответствует критерию патентоспособности "изобретательский уровень".

Способ определения антиоксидантной активности (активности СОД) в соответствии с изобретением осуществляется следующим образом.

В спектрофотометрическую кювету к 2 мл карбонатного буфера, pH 10,65, при комнатной температуре (не ниже 15^oC), добавляют 100 мкл 0.1% раствора адреналина (230 мкМ). Происходит быстрое (в течение нескольких минут) аутоокисление адреналина, которое регистрируют не по образованию адренохрома, а по ранее появляющемуся продукту окисления адреналина, поглощающему при длине волны 347 нм (волновое число 28,8). Образование этого продукта ингибируется СОД. Прирост величины оптической плотности накопления этого соединения составляет 0,025-0.1 оп.ед./мин. В течение указанного времени образование адренохрома еще не наблюдается: нет поглощения при 480 нм. В этом состоит ПРИНЦИПИАЛЬНОЕ отличие предлагаемого способа в сравнении с известными.

Благодаря обнаруженному СОД-чувствительному процессу аутоокисления адреналина с образованием продукта, поглощающего при 347 нм и опережающего по времени и скорости накопление адренохрома, появилась возможность быстро, в течение 3-5 мин (время на постановку одной пробы) определять интенсивность процесса аутоокисления адреналина в отсутствии СОД-содержащих препаратов или антиоксидантов (контроль) и в их присутствии (исследуется ингибирующее действие СОД или антиоксидантов относительно контроля). Рассчитывая процент ингибирования аутоокисления адреналина в сравнении с контрольной пробой, можно количественно оценить антиоксидантную эффективность исследуемых биологических препаратов или химических соединений. Этот подход дает возможность добавлять низкие (230 мкМ) концентрации адреналина, что позволяет использовать готовую форму аптечного препарата 0.1% раствора адреналин гидрохлорида и исключает применение дополнительных источников генерации O^-₂. Предлагаемое решение дает высокий экономический эффект, поскольку не нужны дорогостоящие импортные коммерческие препараты.

На фиг. 1 представлены спектры поглощения адреналина (2.310^-4 М) в воде (A) и 0.2 М карбонатном буфере pH 10,65 (Б). Показано, что при добавлении адреналина в щелочную среду (pH 10.65) наблюдается сдвиг максимума поглощения в УФ-области (280 нм) и появление поглощения при 330-350 нм, которое увеличивается во времени (фиг. 1, Б). Наблюдая за процессом аутоокисления адреналина в щелочной среде, постоянно регистрируя весь спектр в течение 10-15 мин, была выявлена динамика спектральных изменений при 347 нм. На фиг. 2 представлена динамика реакции аутоокисления адреналина в карбонатном буфере, pH 10,65, измеряемая при длине волны 347 нм (приведены результаты двух параллельных измерений). Таким образом установлено, что о скорости реакции аутоокисления адреналина можно судить по изменению оптической плотности при этой длине волны за промежуток времени не менее 1 - 3 мин.

Все измерения проводили при комнатной температуре (от 15 -17^oC в осенне-зимний период и от 22^oC и иногда выше в летний период), т.е. не термостатируя образцы. В этих условиях при используемой концентрации адреналина образования адренохрома (поглощение при длине волны 480 нм), как это видно из фиг. 1, Б, не наблюдается. Очевидно, что для образования адренохрома необходима интенсификация скорости аутоокисления адреналина, которая может быть обеспечена разными факторами, такими как:

1. Более высокая температура, чем в наших условиях (что имеет место в аналоге и прототипе [1-3]), или

2. Более высокая концентрация адреналина (что имеет место в прототипе [3]), или

3. Использование любого известного окислителя, который также мог бы ускорить аутоокисление адреналина (например, FeSO₄ или более сильный окислитель (K₃{Fe(CN)₆).

Так показано, что в присутствии ионов двухвалентного железа (50 мкМ FeSO₄) наблюдается и появление пика поглощения адренохрома. Важно, что с появлением поглощения в области 480 нм, амплитуда пика при 347 нм не уменьшается и что амплитуда пика при 347 нм значительно больше, чем амплитуда пика при 480 нм (см. табл. 1).

Все исследования, в отличие от прототипа и аналога, проводили при pH 10,65. На фиг. 3 представлены данные по влиянию различных величин pH 0.2 М карбонатного буфера на ход реакции аутоокисления адреналина, измерение проведено при длине волны 347 нм (1 - 10.65; 2 - 10.55; 3 - 10.45; 4 - 10.3; 5 - 10.2). Наиболее интенсивно процесс окисления адреналина происходит в карбонатном буфере при pH10,65; при более низких значения pH скорость реакции аутоокисления адреналина существенно ослабевает.

Данные, представленные на фиг. 4, показывают, что накопление продукта, имеющего поглощение при 347 нм, чувствительно к ферменту СОД: коммерческий препарата СОД ("Serva", Германия) ингибирует процесс аутоокисления адреналина. Бычий сывороточный альбумин (BSA), используемый как контроль, подобного действия не оказывает (фиг. 4 - Действие различных концентраций СОД и BSA на аутоокисление адреналина: О - контроль; - 100 нг/мл СОД; - 600 нг/мл СОД; - 800 нг/мл СОД; - 500 нг/мл BSA; - 1 мкг/мл BSA).

Гемолизат эритроцитов, содержащий фермент СОД, также ингибирует аутоокисление адреналина. На фиг. 5 показано ингибирующее действие гемолизата эритроцитов крови пациента на процесс аутоокисления адреналина: - контроль; O - в присутствии гемолизата эритроцитов. Приведены результаты трех параллельных измерений.

Было проведено исследование некоторых соединений, которые могут быть ловушками активных форм кислорода, выступая, таким образом, в роли антиоксидантов.

На фиг. 6 показано ингибирующее действие микромолярных концентраций аскорбиной кислоты на процесс аутоокисления адреналина: - контроль, О - 5 мкМ, - 25 мкМ.

На фиг. 7 представлены данные по исследованию влияния различных концентраций цистеина на реакцию аутоокисления адреналина: 1 - контроль (данные трех параллельных измерений), 2 - 2.5 мкМ, 3 - 5 мкМ, 4 - 25 мкМ. Проверено, что добавление тестируемых соединений в 0.2 М карбонатный буфер не изменяет его величины pH. Полученные результаты показывают, что предлагаемый способ можно использовать как тест-систему для исследования эффективности действия различных антиоксидантов.

Таким образом, положительный эффект предлагаемого изобретения заключается в том, что разработанный способ измерения антиоксидантной активности биологических материалов (гемолизат эритроцитов) и различных химических соединений (аскорбат и цистеин), основанный на их способности ингибировать реакцию аутоокисления адреналина, об интенсивности который судят, в отличии от прототипа и аналогов, не по накоплению адренохрома в щелочной среде, поглощающего при длине волны 480-490 нм, который еще не образуется в этих условиях, поскольку используются низкие концентрации адреналина (230 мкМ), невысокая комнатная температура (15-20^oC) и отсутствуют дополнительные источники генерации супероксидных радикалов, а по накоплению нового, ранее образующемуся продукту окисления адреналина - поглощение при 347 нм -, что позволяет применить готовый аптечный 0.1% раствор адреналина и проводить исследования при указанных ниже условиях. Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Определение активности СОД эритроцитов крови пациентов.

А) Процедура проведения реакции аутоокисления адреналина.

В спектрофотометрическую кювету с 2 мл 0.2 М карбонатного буфера, pH 10.65, добавляют 100 мкл 0,1% аптечного раствора препарата адреналина, тщательно и быстро перемешивают, помещают в спектрофотометр и измеряют величину оптической плотности при длине волны 347 нм (волновое число 28.8) через 15, 30 секунд в течение 3-5 мин.

Б) Определение активности СОД.

При работе с биологическими препаратами - гемолизаты эритроцитов крови - в кювету к буферу добавляют исследуемый препарат и затем вносят раствор адреналина, перемешивают и измеряют нарастание оптической плотности. В контрольную пробу, против которой проводится измерение, также добавляют такое же количество препарата, но не вносится адреналин.

Согласно описанной выше процедуре, определяют величину активности СОД в гемолизате эритроцитов пациентов: к 2 мл карбонатного буфера добавляют 10 мкл исследуемого препарата гемолизата и 100 мкл 0.1% аптечного раствора адреналина. Тщательно, быстро перемешивают, закрыв кювету крышечкой от спектральной кюветы, и регистрируют нарастание оптической плотности при 347 нм в течение 3-5 минут против контрольного раствора: те же компоненты, но без адреналина.

Гемолизат эритроцитов, как источник СОД получают общепринятым методом: берут 100 мкл крови из пальца пациента и помещают ее в 900 мкл 10% цитрата натрия; центрифугированием отделяют осадок эритроцитов, дважды промывают его 1 мл физиологического раствора, избегая грубых механических воздействий, и обрабатывают 0.3% раствором NaCl, содержащим 0.02% сапонина, в соотношении 1 объем взвеси эритроцитов и 2 объема раствора, в течение 15 мин при 4^oC.

На фиг. 5 показано ингибирующее действие гемолизата эритроцитов одного из пациента на реакцию аутоокисления адреналина: контроль, О - в присутствии гемолизата эритроцитов (данные трех параллельных измерений). На графике отмечено: D_контр - изменение величины оптической плотности при 347 нм через 3 мин от начала регистрации процесса окисления адреналина (контроль), D_опыт - то же, в присутствии гемолизата эритроцитов (опыт).

Для построения графиков используют компьютерные программы "Гарвардская графика" или "Sigma plot". При построении графиков учитывают количество биологического материала, вносимого в исследуемую пробу. Его оценка проводится путем измерения оптической плотности при 280 нм 10 мкл гемолизата, добавленного в 2 мл физиологического раствора. Величина оптической плотности гемолизата колеблется в диапазоне 0.11-0.18 ед.опт.плотности.

О скорости окисления адреналина судят по изменению оптической плотности, измеренной при 347 нм за 3 мин. Величину активности СОД в гемолизатах эритроцитов пациентов оценивают по степени ингибирования гемолизатом скорости аутоокисления адреналина. Процент ингибирования вычисляют по формуле:

{1-(D_опыт/D_{контроль})}100%,

где D_опыт и D_{контроль} - скорости реакции аутоокисления адреналина, соответственно, в присутствии и отсутствии гемолизата эритроцитов. Активность СОД выражают в условных единицах. За 1 условную единицу принимают 1% ингибирования.

Активность фермента в условных единицах рассчитывают на 0.1 ед. оптической плотности при 280 нм (удельная активность фермента).

В табл. 2 представлены данные расчета активности СОД конкретного эксперимента (фиг. 5).

С помощью предлагаемого способа определена активность СОД гемолизата эритроцитов 20 пациентов-добровольцев клинического центра "Моран" г. Пущино Московской области. Установлено, наличие индивидуальных изменений активности СОД в зависимости от состояния пациентов (клинический анализ крови). Средняя величина активности СОД условно контрольной группы, измеренная согласно изобретению, составляла 657 условных единиц.

Пример 2. Определение антиоксидантной активности химических препаратов.

Измерения антиоксидантной активности аскорбиновой кислоты и цистеина проводили как описано в разделе "Процедура проведения реакции аутоокисления адреналина". Эти соединения известны как ингибиторы образования свободных радикалов, выступая, таким образом, в роли антиоксидантов. На фиг. 6 и 7 иллюстрируется ход реакции аутоокисления в контрольной пробе и в присутствии исследуемых химических соединений. Показано ингибирующее действие микромолярных концентраций аскорбиновой кислоты (фиг. 6) и цистеина (фиг. 7) на процесс аутоокисления адреналина.

Предлагаемое изобретение, таким образом, позволяет оценить антиоксидантную (синоним: антиокислительную) активность химических соединений и дать рекомендации по их использованию.

Вывод. Предлагаемый способ дает возможность определить активность СОД в биологическом материале (гемолизат эритроцитов) и наличие антиоксидантной активности химических соединений благодаря тому, что, как установлено, за процессом аутоокисления адреналина можно следить не по накоплению адренохрома, а по ранее появляющемуся продукту его окисления, образование которого также чувствительно к СОД. Для проведения реакции не требуется добавления высоких концентраций адреналина в щелочную среду, как это описано в прототипе [5] , и применение дополнительных источников генерации супероксидных радикалов, как это описано в аналогах [1 - 4], что позволяет обойтись без дорогостоящих импортных реактивов.

Способ определения антиоксидантной активности супероксиддисмутазы и химических соединений

Перечень фигур

Фиг. 1. Спектры поглощения адреналина (2,6 10^-4 М) в воде (А) и 0.2 М карбонатном буфере, pH 10,65 (Б) во времени: 1 - 30 сек, 2 - 1 мин, 3 - 2.5 мин, 4 - 4.5 мин, 5 - 6 мин.

Фиг.2. Динамика реакции аутоокисления адреналина (2.6 10^-4 М) в карбонатном буфере, pH 10,65, измеряемая при длине волны 347 нм. Приведены данные двух параллельных измерений.

Фиг. 3. Влияние различных величин pH 0.2 М карбонатного буфера на ход реакции аутоокисления адреналина. Измерение проведено при длине волны 347 нм.

Величины pH: 1 - 10,65; 2 - 10,55; 3 - 10,45; 4 - 10,3; 5- 10,2.

Фиг. 4. Действие различных концентраций супероксиддисмутазы (СОД) и бычьего сывороточного альбумина (BSA) на аутоокисление адреналина: О - контроль; нг/мл СОД; - 600 нг/мл СОД; - 800 нг/мл СОД; - 500 нг/мл BSA; - 1 мкг/мл BSA.

Фиг. 5. Ингибирование аутоокисления адреналина гемолизатом эритроцитов крови человека: - контроль, О - в присутствии гемолизата эритроцитов. Приведены данные трех параллельных измерений.

Фиг. 6. Влияние аскорбиновой кислоты на аутоокисление адреналина. - контроль; О - 5 мкМ; - 25мкМ.

Фиг. 7. Влияние цистеина на процесс аутоокисления адреналина: 1 - контроль; 2 - 2,5 мкМ; 3 - 5 мкМ; 4 - 25 мкМ.

Источники информации

1. Me Cord J.M., Fridovich I. / J. Biol. Chem. - 1969. - Vol. 244, N 22. - P. 6049-6055. 2. Misra H.P., Fridovich I. / J. Biol. Chem. -1972.- Vol. 247, N 10. - P.3170-3175.

3. Симонян M. A., Набалдян P.M. (Биохимия. - 1975. - Т. 40, вып. 4. С. 726-734).

4. Beauchamp C., Fridovich 1. / Analytic. Biochem. - 1971. - Vol. 44. - P. 276-287.

5. Nishikimi N., Rao N.A., Yagi K. / Bioch. Bioph. Res. Commun. - 1972.- Vol. 46, N2.- C.849-854.].