способ диагностики, лечения и прогноза для солидных нелимфоидных опухолей и их метастазов

Формула изобретения

1. Способ прогнозирования метастатического потенциала солидных нелимфоидных опухолей, отличающийся тем, что для образца данной опухоли измеряют клеточно-ассоциированный IL-2R и определяют клеточный опухолеспецифичный маркер, вычисляют первое процентное соотношение, включающее число клеток опухоли или поверхности опухолевой ткани, содержащих IL-2R и имеющих клеточный опухолевый маркер, вычисляют второе процентное соотношение как число клеток, имеющих IL-2R, к числу клеток с идентифицированным опухолевым фенотипом, который определяли, используя один или более показателей, выбранных из группы, включающей размер, признаки формы, данные переднеуглового светорассеяния по результатам проточной цитофлуориметрии (FALS), а затем суммируют первое и второе процентное соотношения для получения коэффициента клеток, формирующих метастатические колонии (Met CFC), пропорционального метастатическому потенциалу, и определяют метастатический потенциал согласно следующей зависимости:

Met CFC - коэффициент - Вероятность метастазирования

0% - 0%

< 10% - < 30%

> 45% - 100%

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что клеточно-ассоциированный IL-2R измеряют способом, выбранным из группы способов, включающих флуоресцентную микроскопию, Вестерн блот анализ, мРНК Нозерн и слот-блот анализ, ферментную амплификацию и анализ мРНК, проточную цитофлуориметрию и иммунологическую оценку.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что клеточный опухолеспецифичный маркер определяют с использованием антител, специфичных по отношению к данному маркеру, выбранных из группы, включающей HEA125 Mab, HT29-15 Mab, BCD-B4 Mab, NCRC-11 Mab, anti-PSA антитела, PD 41 Mab, ALT-04 Mab, B 72.3 Mab, HMD4 Mab, COC183B2, MM46 Mab, 9.2.27 Mab, Mgb2 Mab, ZCE 025 Mab, BW94 Mab, CEB 9 Mab, HSAN 1.2 Mab, HISL-19 Mab, TRA-1-60 Mab, где Mab - моноклональные антитела.

4. Способ наблюдения эффективности противораковой терапии метастазов солидных нелимфоидных опухолей, направленной на прометастатические территории органа-мишени, отличающийся тем, что он включает измерение клеточно-ассоциированного IL-2R, причем уменьшение метастатических клеток солидных нелимфоидных опухолей, экспрессирующих клеточно-ассоциированный IL-2R, после проведения терапии по отношению к числу клеток, экспрессировавших клеточно-ассоциированный IL-2R до начала терапии, свидетельствует о противораковом эффекте терапии.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что клеточно-ассоциированный IL-2R измеряют способом, выбранным из следующей группы способов: флуоресцентная микроскопия, Вестерн блот анализ, мРНК Нозерн и слот-блот анализ, ферментная амплификация и анализ мРНК, проточная цитофлуориметрия и иммунологическая оценка.

6. Клинический диагностический набор для определения метастатического потенциала солидной нелимфоидной опухоли, отличающийся тем, что он включает реагенты для измерения клеточно-ассоциированной экспрессии IL-2R опухолевыми клетками и реагенты для определения клеточного маркера, специфичного для образца указанной опухоли.

7. Диагностический набор по п.6, отличающийся тем, что реагенты для измерения клеточно-ассоциированного IL-2R содержат антитела к IL-2R с определением связывания антител способом, выбранным из группы способов, состоящих из флуоресцентной микроскопии, Вестерн блот анализа, проточной цитофлуориметрии и иммунодиагностики, или специфичные к IL-2R олигонуклеотиды с использованием способа определения, выбранным из группы способов, состоящих из мРНК Нозерн и слот блот анализа, ферментной амплификации и анализа мРНК.

8. Диагностический набор по п.6, отличающийся тем, что реагент для измерения опухолевого клеточного маркера, специфичного для данного типа опухолевых клеток, содержит антитела, связывающиеся специфически с указанным опухолевым клеточным маркером, причем указанные антитела выбраны или представляют собой комбинацию антител из группы, включающей HEA125 Mab, HT29-15 Mab, BCD-B4 Mab, NCRC-11 Mab, anti-PSA антитела, PD 41 Mab, ALT-04 Mab, B 72.3 Mab, HMD4 Mab, COC183B2, MM46 Mab, 9.2.27 Mab, Mgb2 Mab, ZCE 025 Mab, BW94 Mab, CEB9 Mab, HSAN 1.2 Mab, HISL-19 Mab, TRA-1-60 Mab, где Mab - моноклональные антитела.

9. Клинический диагностический набор для наблюдения эффективности противораковой терапии метастатических клеток солидной нелимфоидной опухоли, отличающийся тем, что он включает реагенты, выбранные из группы, состоящей из реагентов для измерения клеточно-ассоциированного IL-2R и реагентов для определения клеточно-ассоциированного специфичного для опухоли идиотипа TCR или их комбинации.

10. Диагностический набор по п.9, отличающийся тем, что реагенты для измерения опухолевого клеточно-ассоциированного IL-2R содержат антитела к IL-2R с определением связывания антител, способом, выбранным из группы способов, состоящих из флуоресцентной микроскопии, Вестерн блот анализа, проточной цитофлуориметрии и иммунодиагностики, или специфичные к IL-2R олигонуклеотиды с использованием способа определения, выбранного из группы способов, состоящих из мРНК Нозерн и слот блот анализа, ферментной амплификации и анализа мРНК.

11. Диагностический набор по п.9, отличающийся тем, что реагенты для измерения клеточно-ассоциированного специфичного для опухоли идиотипа TCR содержат реагент, специфичный к TCR включающий антитела к TCR с определением связывания антител способом, выбранным из группы способов, состоящих из флуоресцентной микроскопии, количественного флуоресцентного анализа и иммунодиагностики, или специфичные к TCR олигонуклеотиды с использованием способа определения, выбранного из группы способов, состоящих из мРНК Нозерн и слот блот анализа, ферментной амплификации и анализа мРНК.

12. Клинический диагностический набор для наблюдения эффективности противораковой терапии метастазов солидной нелимфоидной опухоли, отличающийся тем, что он включает реагенты для измерения клеточно-ассоциированного IL-2R.

13. Диагностический набор по п.12, отличающийся тем, что реагенты для измерения клеточно-ассоциированного IL-2R содержат антитела к IL-2R с определением связывания антител способом, выбранным из группы способов, состоящих из флуоресцентной микроскопии, Вестерн-блот анализа, проточной цитофлуориметрии и иммунодиагностики, или специфичные к IL-2R олигонуклеотиды с использованием способа определения, выбранного из группы способов, состоящих из мРНК Нозерн и слот блот анализа, ферментной амплификации и анализа мРНК.

14. Способ определения метастатического потенциала солидных нелимфоидных опухолей, включающий получение образца клеток солидной нелимфоидной опухоли, отличающийся тем, что определяют опухолевую клеточно-ассоциированную экспрессию IL-2R для данного образца, а метастатический потенциал солидной нелимфоидной опухоли определяют равным 0% в случае, когда экспрессия IL-2R в опухолевых клетках не определяется, равным приблизительно 30%, когда экспрессия IL-2R определяется в приблизительно от 1 до 10% опухолевых клеток, и равным более, чем 80%, когда экспрессия IL-2R определяется более, чем в 35% опухолевых клеток.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что клеточно-ассоциированный IL-2R определяют способом, выбранным из группы способов, состоящих из флуоресцентной микроскопии, Вестерн-блот анализа, мРНК Нозерн блот и слот анализа, ферментной амплификации и анализа мРНК, проточной флуориметрии и иммуноанализа.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к новым способам, касающихся корреляции между степенью экспрессии альфа рецептора интерлейкина-2 (IL-2R ) и вероятностью метастазов (метастатическим потенциалом) нелимфоидных опухолей. Причем измерение экспрессии IL-2R в опухолевых клетках может быть использовано для прогноза метастазов, чтобы облегчить поиск локализации метастазов, нацелить терапевтические мероприятия на территории возможных метастазов и контролировать эффективность лечения опухолей, особенно в отношении метастатических опухолевых клеток и опухолевых клеток, имеющих высокую вероятность метастазов. Настоящее изобретение также относится к взаимосвязи между экспрессией солидными нелимфоидными опухолями T-клеточного рецептора цепи (TCR ) или опухолеспецифичных вариантов и использованием методов нацеленного терапевтического воздействия и контроля эффективности лечения данных опухолей.

1. Метастазы.

Метастазами называют распространение злокачественной опухоли на участки, отдаленные от исходной или первичной опухоли. Метастазы затрудняют диагностику и лечение злокачественных опухолей вследствие нескольких причин: (а) метастазы могут быть представлены всего одной или несколькими клетками и, следовательно, не обнаруживаются при клинической диагностике, даже с использованием современных методов; (б) метастазы часто присутствуют к моменту, когда у пациента диагностирована злокачественная нелимфоидная опухоль (Silverberg et al. , 1989, CA Cancer J. Clin. 39:3-21); (в) их лечение сложнее, чем просто хирургическое удаление первичной опухоли; (г) системная терапия метастазирующих нелимфоидных опухолей, таких как карцинома почки остается неэффективной и дает незначительное улучшение выживаемости (Rosenberg et al. , 1985, N. Engl. J. Med. 313:1485-1492); (д) не все злокачественные опухоли имеют одинаковый метастатический потенциал, прямая зависимость между типом конкретной опухоли и вероятностью ее метастазирования не установлена.

2. Поверхностные молекулы T-клеток, Интерлейкин и рецептор Интерлейкина 2.

Для характеристики и классификации поверхностных молекул T-клеток, таких как кластеры дифференцировки человеческих лейкоцитарных антигенов (CD), используются моноклональные антитела. Рецептор T-клеток (TCR) является экспрессирующимся на поверхности T-лимфоцитов интегрированным мембранным белком, представляющим собой гетеродимер, связанный дисульфидными группами и нековалентно связанный с CD3. TCR имеет отношение к аутоиммунным заболеваниям, так как показана терапевтическая эффективность антител к TCR в лечении аутоиммунных заболеваний (Basi et al., 1992, J. Immunol. Methods 155:175-191). Из группы поверхностных молекул T-клеток Кунгом с соавт. (Kung et al.) обнаружено увеличение концентрации растворимого CD8 в сыворотке детей с неходжкинскими лимфомами (U.S. Patent N 5,006,459). Уровень увеличения CD8 соотносится со стадией лимфомы и ее подверженности терапии.

Интерлейкин 2 и рецептор интерлейкина 2 (IL-2R) взаимодействуют в регуляции иммунного ответа T клеток. IL-2R существует в трех формах, различающихся по силе связывания с IL-2 и по наличию двух связывающих белков и цепей). Высокоаффинный рецептор содержит обе и цепи, рецептор с промежуточной аффинностью содержит цепи и рецептор с низкой аффинностью содержит цепи (Leonard et al., 1990, Prog. Clin. Biol. Res., 352:179-187). IL-2R экспрессируется только на активированных клетках. Показано, что IL-2 вызывает рост T клеток благодаря стимуляции цепей. Кунгом с соавторами (Kung et al., см. выше) было обнаружено увеличение концентрации в сыворотке IL-2 рецепторов (IL-2R) у больных с активными формами рака лимфатической системы, такими как лейкозы и лимфомы, и далее, концентрация растворимой фракции ILR2 находится в прямой связи с тяжестью и прогнозом рака лимфатической системы. Авторы также обнаружили, что концентрация растворимой фракции ILR2 рецепторов обычно не возрастает у пациентов при раковых заболеваниях нелимфатической природы. Дополнительно, уровень растворимой фракции ILR2 плохо коррелирует с числом циркулирующих лимфоцитов, несущих IL-2R.

Иммунотерапия лимфокинами используется как системная форма противораковой терапии, ее задачей является стимуляция иммунного ответа организма на раковые клетки. Описаны различные составы, включающие IL-2: патент США N 5,229,109 Гримма с соавт. (Grimm et al.) показывает низкую токсичность аналогов IL-2; патент США N 5,089,261 Нитеки с соавт. (Nitecki et al.) показывает, что IL-2 коньюгат с полимером уменьшает иммуногенность, увеличивает растворимость и время полувыведения в циркулирующем состоянии; патенты США N 5,061,488 и N 5,126,129 Вилтроута с соавт. (Wittrout et al.) описывают состав и способы получения комбинации флавон-8-уксусной кислоты (flavone-8-acetic acid) и рекомбинантного IL-2; патент США N 5,098,702 Циммермана с соавт. (Zimmerman et al. ) показывает действие IL-2 и/или Интерферона- и фактора некроза опухоли в отношении опухолевых клеток; патент США N 4,939,093 Макгрогана с соавт. (McGrogan et al.) показывает способы производства полипептидов, сходных с человеческим IL-2, и патент США N 4,789,658 Иошимото с соавт. (Yoshimoto et al.) показывает производство человеческого IL-2 и его использование против опухолевых заболеваний. Патент США N 4,690,915 Розенберга (Rosenberg) показывает адаптивную иммунотерапию, включающую лечение пациента иммунными клетками, лимфокин-активированными лимфоцитами и IL-2 терапию.

Таким образом, имеющаяся литература не приводит данные о наличии корреляции между существованием IL-2R и наличием метастазов или метастатическим потенциалом солидных нелимфоидных опухолей. Далее, не существует способов, использующих наличие IL-2R для прогноза метастатического потенциала нелимфоидных опухолей или для диагностики метастазов и их целенаправленной терапии. Имеющаяся литература не приводит данных, отличающихся от обычной систематической терапии, о способах проведения противораковой терапии против нелимфоидных метастатических клеток непосредственно по органам и областям, где развиваются метастазы (прометастатические территории). Кроме того, нет данных о том, что TCR экспрессируется в нелимфоидных опухолях и что TCR является мишенью для методов противораковой терапии, направленных против опухолей, экспрессирующих TCR . Способы, изложенные в настоящем изобретении значительно облегчат диагностику и противораковую терапию для пациентов с нелимфоидными опухолями их метастазами или нелимфоидными опухолями с высокой вероятностью метастазов.

Сущность изобретения.

Задачей настоящего изобретения является создание способа определения метастатического потенциала нелимфоидных опухолей посредством определения экспрессии опухолевыми клетками IL-2R.

Другой задачей изобретения является разработка способа для направления противоопухолевых агентов на нелимфоидные опухоли и их метастазы или нелимфоидные опухоли, имеющие высокую вероятность метастазов. Соответственно, задача состоит в разработке способов и составов для направления противораковой терапии против метастатических клеток в прометастатических территориях вовлеченного органа(ов).

Кроме того, задачей настоящего изобретения является получение возможности для наблюдения эффективности противораковой терапии в отношении нелимфоидных опухолей, их метастазов и опухолей, имеющих высокую вероятность метастазов.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 представляет собой графическое отображение частоты очагов метастазирования по отношению к средней интенсивности флуоресценции (экспрессия IL-2R ) клеток меланомы. При этом пункты на графике A, B, D и E соответствуют клеткам различных групп до начала лечения и клеткам метастазов у животных, получивших клетки от соответствующих групп.

Фиг. 2 представляет собой графическое отображение числа очагов метастазирования в печени по отношению к средней интенсивности флуоресценции всей пробы (соответствует экспрессии IL-2R ), причем круги A - E соответствуют клеткам различным групп до начала лечения и клеткам метастазов у животных, получивших клетки от соответствующих групп.

Фиг. 3 представляет собой графическое отображение числа очагов метастазирования в печени по отношению к проценту клеток, экспрессирующих IL-2R, причем круги A - E соответствуют клеткам различных групп до начала лечения и клеткам метастазов у животных, получивших клетки от соответствующих групп.

Фиг. 4 Представлена фотография среза печени, показывающая специфичность связывания агглютинина зародышей пшеницы, помеченного родамином эндотелиальных клеток 1-го типа в прометастатических территориях (светлые зоны) по отношению к остальной структуре печени (темные зоны).

На фиг. 5 представлена зависимость интенсивности клеточного роста по отношению к концентрации IL-2. Фиг. 5A показывает зависимость пролиферации клеток B16F10 от концентрации IL-2. Фиг. 5B показывает зависимость пролиферации клеток CTLL-2 от концентрации IL-2.

Детальное описание изобретения.

Настоящее изобретение направлено на измерение TCR или его опухолеспецифичных вариантов и/или IL-2R экспрессируемого нелимфоидными опухолевыми клетками. Измерение IL-2R может быть полезно в диагностике метастазов или в определении метастатического потенциала солидных нелимфоидных опухолей. Измерение IL-2R или TCR может быть использовано для направления противоопухолевых агентов на нелимфоидные опухоли, экспрессирующие соответствующий рецептор; в наблюдении эффективности противоопухолевой терапии таких опухолей, экспрессирующих этот рецептор. Дальнейшее описание настоящего изобретения дается в следующей последовательности:

1. Способы прогноза вероятности метастазирования и локализации метастазов.

2. Противораковая терапия, ограниченная прометастатическими областями, с использованием составов, нацеленных на клетки, формирующие метастатические колонии и покоящиеся метастатические опухолевые клетки, и контроль эффективности такой терапии.

3. Противоопухолевая терапия, направленная на нелимфоидные опухолевые клетки, экспрессирующие TCR или опухолеспецифичные варианты цепей.

1. Способы прогноза вероятности метастазирования и локализации метастазов.

1.1 Взаимосвязь между экспрессией IL-2R и вероятностью метастазов.

Настоящее изобретение предлагает способ для измерения экспрессии IL-2R в солидных нелимфоидных опухолях. При использовании настоящего изобретения клеточно-ассоциированная экспрессия IL-2R измеряется в солидных нелимфоидных опухолях. Эксперименты показывают, что метастатические клетки нелимфоидных опухолей у человека и экспериментальные метастазы экспрессируют IL-2R в соответствии с их потенциалом метастазирования. Также число метастазов находится в прямой пропорциональной зависимости от процента клеток, экспрессирующих IL-2R. Следующие примеры в разделах А - Д показывают определение клеточно-ассоциированного IL-2R в человеческих и экспериментальных опухолях с использованием одного или нескольких методов из следующей группы методов: флуоресцентная микроскопия (измерение IL-2R на поверхности), Вестерн-блот гибридизация (измерение внутренней и мембранной фракций IL-2R ), мРНК Нозерн и слот-блот анализ (измерение экспрессии мРНК, соответствующей IL-2R ), амплификация и анализ мРНК (измерение экспрессии мРНК, соответствующей IL-2R ) и использование проточной цитофлюориметрии (измерение поверхностного IL-2R с помощью проточной цитофлюориметрии). Опухоли человека и экспериментальные опухоли были получены из следующих источников: клетки меланомы B16F10 были предоставлены Др. М.Ф. Пупон (M.F. Poupon) из Парижа. Клетки Colon 51B и клетки Colon 51B lim 10 были предоставлены Др. Р. Бресалиером (R. Bresalier) из США. Клетки MCA - 26 были предоставлены Др. И. Фидлером (I. Fidler) (США). MMC-7489 клетки были предоставлены Др. Дж. Ваагенд (J. Vaageand). SW480, SW480E, SW480R и SW620 были предоставлены Др. И.Б. Вейнстейном (I. B. Welnstein). Человеческий биопсийный материал был предоставлен Др. Алонзо и Др. Пеллин (Alonso and Pellin) из Испании. Все опухолевые линии выращивались в пластиковых фласкетах во влажной атмосфере с 5% содержанием CO₂, в соответствующей культуральной среде с содержанием 10% эмбриональной сыворотки (FBS) и пенициллина со стрептомицином.

А. Флуоресцентная микроскопия IL-2R

Опухолевый биопсийный материал или хирургическая биопсия, содержащая материал нелимфоидной опухоли, может быть дезагрегирована и приготовлена непосредственно для флуоресцентного анализа. В другом случае опухолевые клетки могут быть культивированы в 8 луночных планшетах (Биотек) в течение 48 часов, затем супернатант удаляется, лунки нежно промываются буфером (PBS) и фиксируются фиксатором Карнуа. После 3 промывок PBS клетки инкубируются в течение 30 минут при 37^oC в растворе PBS, содержащем 4 мкг/мл крысиных, меченных ФИТЦ иммуноглобулин G₂ моноклональных антител против мышиного IL-2R (клон AMT, Boehringer Manheim). После инкубации лунки дважды промываются PBS. Контроль проводится с использованием крысиных меченных ФИТЦ моноклональных антител к мышиному иммуноглобулину G₂ (Boehringer Manheim). Клетки наблюдают в лазерный сканирующий флуоресцентный микроскоп.

Б. Вестерн-блот гибридизация для IL-2R

Для Вестерн-блот анализа 510⁶ опухолевых клеток и контрольных клеток (КонА активированные клетки селезенки и CTLL-2 клетки) были собраны в PBS, содержащий 1 мМ PMSF. После промывки клетки были гомогенизированы на льду при помощи ударов на гомогенизаторе Доунса в буфере 10 мМ Трис-HCl pH 7.4, содержащем 0,25 М сахарозы, 1 мМ MgCl₂, 5 mM CaCl₂ и смеси ингибиторов протеаз.

Ядра клеток осаждали (при 600g в течение 10 мин), надъядерный супернатант центрифугировали при 100000g в течение 1 часа для получения цитозольной фракции и грубой мембранной фракции. Выполняли электрофорез в полиакриламидном геле. Белки переносили на нитроцеллюлозные фильтры посредством электрофореза в течение 2 часов при 40V. Фильтр затем инкубировали в авидин Д блокирующем растворе с 3% нормальной сывороткой с последующими 3-мя промывками TTBS. Моноклональные антитела к рецептору интерлейкина 2 мыши были добавлены к TTBS с последующей инкубацией в течение 2 часов. После 3 промывок в TTBS был добавлен на 1 час биотинилированный кроличий антикрысиный иммуноглобулин G в разведении 1:200. Затем проведены 3 промывки раствором TTBS и блот был инкубирован с авидин DH и биотинилированной пероксидазой хрена H в течение 30 минут. Затем блот был инкубирован с DAB, места связывания антител выявляются по коричневому преципитату. Были использованы маркеры молекулярного веса: бетагалактозидаза (116 Кд), Бычий альбумин (66 Кд), яичный альбумин (45 Кд) и ангидраза углекислоты (29 Кд).

Присутствие клеточно-ассоциированного IL-2R, экспрессируемого нелимфоидными клетками, также может быть обнаружено на мембранной фракции и цитозольном экстракте этих клеток способом, при котором IL-2R используется как антиген. Эти иммунологические способы включают в себя, но не ограничиваясь, радиоиммуный анализ, энзим-связанный иммуноферментный анализ (ELISA), "сэндвич" анализ, реакцию преципитации, анализ агглютинации и флуоресцентный иммуноанализ.

В. Нозерн мРНК и слот-блот анализ

мРНК получали из клеток селезенки, КонА-активированных клеток селезенки и опухолевых клеток. Опухолевые клетки исследовали интактными и после воздействия на них в условиях in vitro. Воздействие выполняли путем инкубации клеток в течение 24 часов или в обычной среде, содержащей 125 U/ml IL-2 в 5% CO₂, или в среде, содержащей 10 U/ml IL-1, или в среде, содержащей 5 мкг/мл КонА. Клетки снимали после короткой инкубации в 0,1% трипсине с 2 мМ EDTA, затем инкубировали в течение 48 часов во фласкетах в среде DMEM с 10% сыворотки FBS в 5% CO₂.

20 мкг очищенной мРНК, после выделения и определения мРНК (посредством простого электрофореза в 0,7% агарозном геле), было разделено в 1,2% агарозном геле, содержащем 2,2 М формальдегид. Электрофорез выполнялся при напряжении 80V. Дорожки, содержащие стандарты молекулярного веса, были отрезаны от геля и измерен путь миграции. Гель был промыт и перенесен на нитроцеллюлозный фильтр. В другом случае, образцы РНК были блоттированы с помощью слот-блот прибора на нитроцеллюлозном фильтре, пропитанном 10SSC. Перед блоттированием 2 мкг мРНК были разведены до конечного объема 100 мкл в 10SSC-формальдегиде и денатурированы путем нагрева при 65^oC в течение 10 мин. мРНК была связана с нитроцеллюлозным фильтром с помощью УФ облучения. Блот был прегибридизирован в течение 4 часов при 45^oC в 6SSC, 0.5 SDS, 5Denhart s, 10 мМ ЭДТА, 50 мкг/мл обработанной ДНК спермы лосося и 50 мкг/мл тРНК E. coli. Одновременно было помечено 5 пикомолей ДНК зонда к человеческому IL-2R и IL-2R морской свинки (Amgen Biologicals). Мечение проводили согласно стандартному протоколу путем мечения 5"" конца олигонуклеотидным зондом с ³²P АТФ. 100 мкг ДНК человеческого бета-актина (Clontech) было помечено с помощью случайного праймера. Гибридизацию мРНК блота проводили при 45^oC в течение 24 ч с радиоактивными зондами (210⁹ cpm/l специфической радиоактивности). Затем блоты были промыты раствором 5SSC - 0.1 SDS при температуре гибидизации в течение 20 мин. Блоты были экспозированы в течение различных периодов времени на рентгеновскую пленку при -70^oC. Зонды были удалены с фильтров путем инкубации в стерильной воде при 100^oC в течение 10 мин и фильтры были регибридизированы с остальными зондами. Количественный анализ 10 авторадиограмм был выполнен с помощью видеоденситометра.

Г. Ферментная амплификация мРНК опухолевых клеток

Экспрессия IL-2R может быть обнаружена путем экстракции и очистки мРНК клеток нелимфоидных опухолей с последующей энзиматической амплификацией очищенной мРНК для получения количеств, достаточных для обнаружения и анализа. Могут быть использованы следующие методы, используемые для ферментативной амплификации: PCR (полимеразная цепная реакция), QB репликаза и NASBA (амплификация, основанная на секвенировании нуклеиновых кислот). Обнаружение амплифицированной нуклеиновой кислоты может быть проведено различными методами, включая, но не ограничиваясь:

электрофорез в агарозном геле, Нозерн блоттинг, гибридизация с последующим анализом, основанным на флуоресценции, гибридизация с последующим анализом, основанным на хемилюминесценции, титрование по результатам гибридизации. Олигонуклеотидные праймеры и зонды могут быть синтезированы по результатам секвенирования IL-2R гена (Leonard et al., 1984, Nature 311:626-631). Зонды могут быть синтезированы со встроенной изотопной или неизотопной меткой. С другой стороны, метка может быть встроена непосредственно в амплифицированный продукт.

В данном примере одноцепочечная кДНК получена путем обратной транскрипции из экстрагированной из опухолевых клеток мРНК. ДНК была амплифицирована с использованием праймеров для IL-2R и IL-2R генов, полученных из коммерческих источников. Амплифицированный продукт был разделен в 1.2% агарозном геле и окрашен бромидом этидия в параллелях с позитивным и негативным контролями. Количественное определение выполнено с помощью установки "Photoquant System" (BAF, Испания).

Д. Анализ с помощью проточной цитофлуориметрии

Опухолевые клетки культивировались в 24-луночных планшетах в течение 48 часов, супернатант был удален и лунки были нежно промыты PBS. Затем клетки нежно счищали с лунок и инкубировали в течение 30 мин при 4^oC в растворе PBS, содержащем 1 мкг/мл крысиных моноклональных антител против мышиного IL-2R. После промывки клетки инкубировались в течение 30 мин при 4^oC в растворе PBS, содержащем 20 мкг/мл меченных ФИТЦ кроличьих противокрысиных антител, проводили фиксацию 1% параформальдегидом, анализ проводили в течение 48 часов, используя прибор FACS (Coulter). Во всех случаях был поставлен контроль с использованием только вторичных антител. Клетки селезенки были использованы как отрицательный контроль и КонА-активированные клетки селезенки были использованы как положительный контроль экспрессии антигенов. Количественный анализ экспрессии IL-2R в опухолевых клетках был выполнен с использованием проточного цитофлуориметра.

В табл. 1 (см. в конце описания) представлены нелимфоидные опухоли человека и экспериментальные опухоли, метастатический потенциал которых был сопоставлен с экспрессией клеточно-ассоциированного IL-2R. Метастатический потенциал опухолей человека был определен по результатам клинического наблюдения. Метастатический потенциал экспериментальных опухолей был определен in vitro по анализу клеточного роста и эффективности метастазирования (описано ниже в п. 1.1, раздел Е).

Результаты табл. 1 показывают, что клеточно-ассоциированная экспрессия IL-2R хорошо коррелирует с метастатическим потенциалом нелимфоидных опухолей человека, для которых был определен потенциал метастазирования, и экспериментальных опухолей.

Для иллюстрации этого положения клетки меланомы B16F10 культивировались в различных условиях для сопоставления числа метастатических очагов с интенсивностью экспрессии IL-2R или процентом клеток, экспрессирующих IL-2R. Воздействие на клетки в условиях in vitro состояло в инкубации клеток при 37^oC в 5% растворе CO₂, группы клеток культивировались в следующих растворах: А) 24 часа в обычной ростовой среде (контроль); Б) 24 часа в среде, содержащей 125 U/мл IL-2 (активируется рост метастатических клеток); В) 24 часа в среде, содержащей 10 U/мл IL-1 (активируется клеточный рост); Г) 24 часа в среде, содержащей 5 мкг/мл КонА (активируется клеточный рост); Д) снятие клеток посредством короткой инкубации в 0,1% трипсине с 2 мМ ЭДТА, затем инкубация клеток в течение 48 часов во вращающихся фласкетах в среде DMEM с 10% FBS (активируется клеточный рост).

Затем, после воздействия в условиях in vitro, в некоторых планшетах для каждой из 5 групп клеток удаляли супернатант, клетки осторожно промывали PBS и осторожно счищали с планшета для культивирования. Клетки инкубировались 30 мин при 4^oC в растворе PBS, содержащем 1 мкг/мл крысиных моноклональных антител против мышиного IL-2R. Затем клетки промывались и инкубировались в течение 30 мин при 4^oC в растворе PBS, содержащем 20 мкг/мл ФИТЦ меченных кроличьих антител к иммуноглобулину крысы. Клетки фиксировали 1% параформальдегидом и исследовали в течение 48 часов на проточном цитофлуориметре для количественного анализа экспрессии IL-2R. Клетки селезенки использовались как отрицательный контроль, а клетки селезенки, стимулированные КонА, использовались как положительный контроль экспрессии антигенов.

В каждой из 5 групп клеток было взято 510⁵ клеток, которые в объеме 0,05 мл были инъецированы в верхний полюс селезенки анестезированной мыши. Клетки каждой из 5 групп воздействия были инъецированы в группу из 20 мышей. Через 5 мин у животных проводилась спленэктомия. Группа из 20 животных забивалась через 7 дней после инъекции клеток посредством дислокации шейных позвонков: печень и легкие удалялись и замораживались в жидком азоте. Было сделано 10 криостатных серийных срезов толщиной 40 мкм на расстоянии 200 мкм. Срезы окрашивали на сукцинат дегидрогеназу (SDH-окраска); погружали в ацетон на 45 с при -20^oC, затем промывали дважды по 5 мин в PBS. Срезы исследовали в микроскоп с системой анализа изображений. Исследовали изображения каждого среза в проходящем свете (SDH-окрашивание). Одиночные фокусы были четко очерчены как неокрашенные SDH регионы печеночной ткани. Количество очагов, объем каждого очага и общий объем опухоли в каждой печени вычисляли по данным анализа изображений в соответствии со стереологическими критериями (Aherne & Dunnill, Morphometry. ed. Edward Arnold, London, 1982), используя модифицированное программное обеспечение (DPLAN, Испания).

Результаты приведены на фиг. 1 и 2. Фиг. 1 показывает частоту очагов метастазирования по отношению к экспрессии IL-2R в клетке (средний показатель для 10.000 клеток) для различных групп воздействия. Результаты показывают, что увеличение экспрессии IL-2R коррелирует с увеличением метастатических очагов. Например, наибольшее число рецепторов IL-2R экспрессируется в клетках, подвергнутых воздействию КонА. Клетки меланомы, активированные КонА, также представляют собой группу клеток, в которой частота очагов метастазирования наиболее высока (фиг. 1, круг D). Фиг. 2 показывает число метастатических очагов в печени по отношению к экспрессии IL-2R в образце в целом (как это было бы измерено с помощью иммуноферментного анализа). Данные показывают, что средняя интенсивность экспрессии IL-2R соответствует числу метастатических очагов в печени. Например, клетки меланомы, обработанные КонА, имеют наиболее высокую экспрессию IL-2R, они же наибольшее число очагов метастазирования (фиг. 2, круг D).

1.2 Клиническое применение определения клеточно-ассоциированной экспрессии IL-2R нелимфоидными опухолями.

А. Определение прогноза метастазирования

Методы прогноза метастазирования необходимы в связи с проблемами в диагностике и лечении нелимфоидных опухолей, которые вызваны наличием метастазов. Использование (настоящего изобретения) для определения прогноза метастазирования включает следующие шаги:

(а) Получить образец первичной опухоли (дохирургическая или хирургическая биопсия);

(б) Установить процент нелимфоидных клеток с IL-2R, используя один из методов, описанных выше в разделе 1.1 пп. А-Д, или комбинацию методов. Выбор метода, наиболее подходящего для определения клеточно-ассоциированной экспрессии IL-2R в образце зависит от биопсии нелимфоидной опухоли и типа опухоли. Например, для определения клеточно-ассоциированной экспрессии IL-2R в гистологических срезах нелимфоидных опухолевых тканей или в гистологических срезах фиксированных или проросших опухолевых тканей может быть проведена с использованием клинического диагностического набора для флуоресцентной микроскопии. Клинический диагностический набор для определения клеточно-ассоциированной экспрессии IL-2R в клетках изолированных нелимфоидных опухолей может включать микроплаты и реагенты для иммуноферментного анализа, реагенты для анализа методом проточной цитофлюориметрии или реагенты, включающие специфические праймеры и зонды для полимеразной цепной реакции. Клинический диагностический набор содержит 2 основных элемента: 1). Антитела к IL-2R, соединенные с регистрируемым компонентом, таким как флюорохром, хромофор или фермент. Примеры таких веществ: алкалин фосфатаза, флуоресцеин-5-изотиоцианат, пероксидаза, фикоэритрин и родамин; 2). Антитела к клеточному опухолевому маркеру (TCM), данный маркер, как известно, ассоциирован со специфическим типом опухоли. Антитела к клеточному опухолевому маркеру, ассоциированному со специфическим типом опухоли, могут быть использованы в сочетании со способом, описанном в настоящем изобретении. Эти антитела включают в себя указанные в табл. 2 (но не ограничиваются ими) (см. в конце описания).

Антитела к специфическому опухолевому маркеру соединяются с флюорохромом, хромофором или ферментом, причем отличным от того, с которым соединены антитела к IL-2R.

Для определения вероятности метастазирования вычисляются два процентных соотношения. Первое соотношение вычисляется путем измерения процента опухолевых клеток или процента поверхности опухоли, несущей оба антигена (IL-2R+, TCM+ клетки). Второй процент вычисляется путем подсчета опухолевых клеток, которые могут быть идентифицированы по фенотипу (включая размер, показатели формы, данные переднеуглового светорассеяния по результатам проточной цитофлуориметрии) и которые являются IL-2R позитивными (Опухолевый фенотип+, IL-2R+). Сумма обоих процентных соотношений образует коэффициент клеток, образующих метастатические колонии (Met-CFC коэффициент). Met-CFC коэффициент пропорционален вероятности метастазирования. Экспериментальные оценки следующие:

Met-CFC коэффициент - Вероятность метастазирования

0% - 0%

< 10% - < 30%

> 45% - 100%

Заметим, что экспрессия IL-2R может быть использована сама по себе для определения метастазов, поскольку T-клетки в самой опухоли отсутствуют. Однако, для исключения экспрессии IL-2R в T-клетках в материале, взятом при биопсии опухоли, используется совместное определение IL-2R, антител к TCM и опухолевого фенотипа.

Для иллюстрации данного положения, основанного на определении только экспрессии IL-2R, было использовано культивирование клеток меланомы B16F10 при различных условиях для сопоставления интенсивности метастазирования и экспрессии IL-2R. Клетки B16F10 были обработаны в условиях in vitro как описано выше в разделе Е, исключая тот факт, что обработка состояла в инкубации различных групп клеток в следующих растворах: А) 24 часа в обычной ростовой среде (контроль); Б) 24 часа в среде, содержащей 125 U/мл IL-2 (активируется рост метастатических клеток); В) 24 часа в среде, содержащей 10 U/мл IL-4 (блокируется экспрессия IL-2R; Г) 24 часа в среде, содержащей 5 мкг/мл КонА (активируется клеточный рост); Д) снятие клеток посредством короткой инкубации в 0,1% трипсине с 2 мМ ЭДТА, затем инкубация клеток в течение 48 часов во вращающихся фласкетах в среде DMEM с 10% FBS (активируется клеточный рост). Анализ экспрессии IL-2R и анализ опухолевого роста и интенсивности метастазирования в условиях in vivo выполнялись, как описано выше в разделе Е, исключая тот факт, что каждая группа мышей состояла из 6 членов вместо 20. Результаты приведены в табл. 3, они свидетельствуют, что, если менее 10% клеток экспрессируют IL-2R, то метастазы наблюдаются у 30% мышей (B16F10, клетки без воздействия и после воздействия IL-2); если клетки не экспрессируют IL-2R, то метастазы не наблюдаются ни у одной из мышей (0% мышей с метастазами, на клетки воздействовали IL-4), если 35% клеток экспрессируют IL-2R, то метастазы наблюдаются более, чем у 80% мышей (B16F10, рост в суспензии); если более 50% клеток экспрессируют IL-2R, то метастазы наблюдаются у 100% мышей (B16F10, обработка клеток КонА).

Также была найдена высокая корреляция или даже метастазы были исключительно локализованы в зонах, которые в терминах настоящего изобретения обозначаются как "прометастатические территории".

2. Противораковая терапия, ограниченная прометастатическими зонами, с использованием составов, нацеленных на клетки, формирующие метастатические колонии и покоящиеся метастатические опухолевые клетки, и контроль эффективности такой терапии.

2.1 Прометастатические зоны.

Злокачественные новообразования гематологической природы, включая лимфомы и лейкемии, эффективно лечатся с использованием IL-2, связанного с токсином, который соединяется с клетками, несущими рецепторы высокой аффинности к IL-2, а токсин повреждает клетку (LeMaistre et al., 1992, Immunol. Res., 11, 42-53; Waidmann et al., 1992, Ann Intern Med. 116: 148-160); или с помощью антител к рецептору высокой аффинности IL-2 человека (hIL-2R), или с помощью этих антител (anti-hIL-2R), соединенных с токсинами или радиоизотопами (Waidmann et al., 1992, см. выше). Способ лечения метастазов солидных нелимфоидных опухолей и солидных нелимфоидных опухолей, имеющих высокую вероятность метастазирования, изложенный в настоящем изобретении, отличается несколькими важными аспектами. Гематологические опухоли экспрессируют hIL-2R (содержащий обе и цепи), который эффективно связывается с IL-2 и антителами к hIL-2R. Далее, при проведении лечения IL-2-токсином, anti-hIL-2 или anti-hIL-2, соединенными с токсином, необходимы систематические инъекции согласно природе опухоли. Настоящее изобретение показывает наличие корреляции между метастатическим потенциалом солидных нелимфоидных опухолей и экспрессией IL-2R, поэтому такие опухоли, экспрессирующие IL-2R, могут связывать с низкой аффинностью IL-2-токсин или anti-hIL-2R-токсин или anti-hIL-2R. Таким образом, один из способов, предложенных в настоящем изобретении для противораковой терапии в отношении метастазов солидных нелимфоидных опухолей и солидных нелимфоидных опухолей, имеющих высокую вероятность метастазирования, включает использование в терапевтически эффективных количествах молекул, связанных с токсином, радиоизотопом или хемотерапевтическим агентом, причем молекулы специфичны по отношению к IL-2R (т.е. имеют высокую эффективность связывания), таких как антитела к человеческому IL-2R.

Относительно небольшие дозы IL-2, несмотря на низкую аффинность IL-2R к IL-2, сконцентрированные в прометастатических зонах, активируют покоящиеся метастатические клетки и делают их более подверженными действию противоопухолевых препаратов. Таким образом, другой способ терапии метастатических колоний или покоящихся метастатических клеток, описанный в настоящем изобретении, заключается в одновременном использовании IL-2 и противораковых препаратов в прометастатических зонах. Заметим, что способ противораковой терапии согласно данному положению настоящего изобретения не включает системное лечение, использует целенаправленную терапию непосредственно в прометастатических зонах.

Прометастатические зоны, являющиеся объектом противораковой терапии согласно настоящему изобретению, определяют по их васкуляризации, конечной концентрации сахара, концентрации внеклеточных молекул адгезии (ICAMs), экспрессирующихся на поверхности клеток в зоне. Метастатические клетки солидных нелимфоидных опухолей дают начало метастатическим очагам ("колонизируют") только в определенных местах органа мишени, таких как печень или легкие, местах с уникальной капиллярной сетью (Barbera-Guillem et al., 1989, Cancer Research 49:4003-4010: Barbera-Guillem et al., 1992, Int. J. Cancer Res. 52: 974-977; Barbera-Guillem et al., 1993, Int. J. Cancer 53:298-301: Barbera-Guillem et al., 1993, Int. J. Cancer 54:880-884). Например, в печени прометастатические зоны расположены в 1-ой половине (преимущественно во втором квадранте данной половины) синусоида, идущего от портальной вены до печеночной вены. Эта область синусоида также известна, как перипортальный сегмент синусоида. В легких прометастатические зоны находятся в терминальных преальвеоляных венулах и терминальных плевральных капиллярах. Сходные зоны найдены в других органах, включая надпочечник.

Общим свойством всех охарактеризованных прометастатических зон является наличие специфических эндотелиальных клеток в капиллярах в таких зонах, называемых "эндотелиальные клетки 1-го типа" (Vidal-Vanachlocha et al., 1993, Hepatology 18: 328-339). Эндотелиальные клетки 1-го типа имеют общие черты, характеризующие их поверхность, включающие наличие олигосахаридов с высокой концентрацией специфических терминальных сахаров (N-ацетил галактозамина; Gal NAC), концентрация которых выше, чем в остальной части капилляра от 6 до 10 раз (Barbera-Guillem et al., 1991, Hepatology 14:131-139; Vidal-Vanachlocha et al., 1993, см. выше). Высокая экспрессия этих специфических сахаров приводит к преимущественному связыванию с эндотелиальными клетками 1-го типа пектинов, которые, будучи инъецированными в циркуляторное русло непосредственно перед прометастатическими зонами, связываются с этими сахарами. Таким образом, инъецированные лектины, такие как агглютинин зародышей пшеницы (WGA), задерживаются и фактически захватываются прометастатическими территориями. Это показано на фиг. 4, где зоны печени, которые не колонизируются опухолевыми клетками, свободны от WGA, помеченного родамином (темные зоны); и капиллярные эндотелиальные клетки 1-го типа прометастатических зон связывают WGA, помеченный родамином (светлые зоны). Таким образом, захват молекул лектина, помеченных флуорохромом, происходит в зонах-мишенях печени, которые колонизируются опухолевыми клетками и где развиваются метастазы. Чем выше концентрация лектина в капиллярах прометастатических зон, тем выше концентрация Gal NAC в эндотелиальных клетках 1-го типа в капиллярах данных территорий.

Эндотелиальные клетки печени прометастатических зон также содержат высокую концентрацию ICAMs. Поэтому лиганд или антитела, которые связываются специфически с ICAM, могут быть использованы как целенаправленный агент для данной клеточной субпопуляции. Прометастатические зоны в легких также содержат эндотелиальные клетки с высокой концентрацией ICAMs (Zhu et al., 1992, Int. J. Cancer 53:628-633; Zhu et al., 1992, J. Clin. Invest. 89:1718-1724). При этом лиганды или антитела, которые связываются специфически с IСАМ, могут быть использованы, как целенаправленный агент, специфичный для данной клеточной субпопуляции.

Метастатические клетки, которые задерживаются в прометастатических зонах могут переходить в покоящееся состояние или пролиферировать медленно (псевдопокоящееся состояние), что делает их очень устойчивыми к натуральным киллерам и противоопухолевым препаратам. Они выходят из этого состояния под воздействием локальных низких концентраций IL-2 и IL-1. Когда включается пролиферация бластных метастатических клеток, то они становятся более чувствительны к действию противоопухолевых препаратов и натуральных киллеров.

Для иллюстрации связи между концентрацией цитокинов и изменением клеточного роста нелимфоидной опухоли были использованы клетки меланомы B16F10, которые инкубировали при различных концентрациях IL-1 и IL-2, и регистрировали результатирующее изменение клеточного роста. Определение эффекта IL-2 на рост клеток меланомы B16F10 проводили следующим образом: по 10.000 жизнеспособных опухолевых клеток добавляли в каждую лунку 96 луночного планшета и инкубировали в течение 48 часов при 5% CO₂ в бессывороточной среде или обычной среде с 10% FBS, содержащей мышиный рекомбинантный IL-2 в концентрациях 10-200 U/мл; или 20, 125 или 250 U человеческого рекомбинантного IL-2 (hrIL-2). Затем лунки проводили импульсное мечение с помощью ³H-тимидина в дозе 1 Ci, через 6 часов клетки снимали с последующим измерением радиоактивности. Протокол определения эффекта IL-1 на рост клеток меланомы B16F10: 10.000 жизнеспособных опухолевых клеток добавляли в каждую лунку 96 луночного планшета и инкубировали в течение 48 часов при 5% CO₂ в бессывороточной среде или обычной среде с 10% FBS, содержащей мышиный IL-1 в одной из следующих концентраций - 1, 10 или 20 U/мл. В некоторых случаях одновременно с IL-1 были добавлены антитела к IL-2R. Затем проводили импульсное мечение содержимого каждой лунки с помощью ³H-тимидина в дозе 1 Ci, через 6 часов клетки снимали с последующим измерением радиоактивности. Данные на фиг. 5 показывают, что высокие концентрации IL-2 (выше, чем 75 U/мл) приводят к цитостатическому эффекту и вызывают гибель бластных клеток, но не влияют на метастатические клетки B16F10 в псевдопокоящемся состоянии. Терапевтически важно заметить, что IL-2 в концентрации выше, чем 75 U/мл, подавляет клеточный рост метастатических клеток, в то же время концентрации от 75 U/мл до 100 U/мл не являются токсичными для лимфоцитов (фиг. 5, представлено CTLL-2), обработанных аналогичным образом. Табл. 4 показывает, что IL-2 и IL-1 в низких концентрациях вызывают переход из псевдопокоящегося в бластное состояние и индуцируют пролиферацию бластных клеток.

Таким образом, способы лечения метастазов солидных нелимфоидных опухолей, изложенные в настоящем изобретении, включают противораковую терапию, нацеленную на прометастатические территории. Преимущества такого способа заключены в том, что противораковая терапия направлена непосредственно на клетки прометастатических территорий специфического органа, следовательно, терапевтическая концентрация противораковых препаратов или токсических агентов достигается в зоне локализации клеток солидных нелимфоидных опухолей с минимальным повреждением иммунной и кроветворной систем.

2.2 Противораковая терапия, направленная на прометастатические зоны.

Противораковая терапия согласно настоящему изобретению включает один или более принципов:

Принцип (А). Состав, содержащий терапевтически эффективные концентрации IL-2 или IL-1 и противоопухолевый препарат (хемотерапевтический агент), используется в прометастатической зоне для избежания цитостатического эффекта на бластные клетки IL-2 и для активации псевдопокоящихся метастатических клеток для предотвращения их устойчивости к терапии с обеспечением при этом соответствующей концентрации и захвата противоопухолевого препарата, приводящего к гибели метастатических клеток.

Согласно данному принципу IL-1 или IL-2 могут быть связаны с молекулой лектина, противоопухолевый препарат может быть связан с молекулой лектина, такой как WGA, используя известные способы (как показано в Патенте США N 5.284.934). Данные компоненты смешиваются в терапевтически эффективных пропорциях для обеспечения состава с высокой аффинностью к прометастатическим территориям, которые являются целью противораковой терапии. С другой стороны, антитела к ICAM могут быть связаны с IL-1 или IL-2, те же антитела могут быть связаны с противоопухолевым препаратом, компоненты смешиваются в терапевтически эффективном соотношении для обеспечения состава с высокой аффинностью к прометастатическим территориям. Такие смеси могут быть заключены в липосомы как носители, используя известные способы, для удлинения времени удержания состава в прометастатических территориях. Для изучения данного положения были сконструированы липосомы, содержащие внутри родамин, а на поверхности WGA. Инъекция этих липосом в портальную вену печени приводила к такому же распределению флуоресценции, как изображено на фиг. 4. Дополнительно было показано, что эндотелиальные клетки 1-го типа не захватывают во внутрь лектин-липосомы, оставляя их открытыми для соседних метастатических клеток. Однако, существует возможное ограничение в использовании данного способа, связанное с тем, что клетки Купфера фагоцитируют в малых количествах, по данным флуоресцентного анализа, лектин-связанные липосомы.

Принцип (Б). Состав, содержащий молекулы, связанные с токсином, радиоизотопом или хемотерапевтическим агентом в терапевтически эффективном соотношении, причем молекулы являются специфичными по отношению к IL-2R, такими как антитела к человеческому IL-2R. Данный состав применяется в прометастатических зонах для связывания с прометастатическими клетками в этих зонах и приводит к их гибели.

Согласно обоим принципам (А) и (Б) смесь вводится через катетер непосредственно в сосудистое русло прометастатических зон. Также, согласно обоим положениям, эффективность лечения может быть прослежена путем измерения клеточно-ассоциированной экспрессии IL-2R, используя один из методов или их комбинацию, как описано в п.1.1 в разделах А-Д. При этом уменьшение числа метастатических клеток нелимфоидной опухоли, экспрессирующих клеточно-ассоциированный IL-2R, по отношению к числу клеток, экспрессировавших IL-2R до начала терапии, свидетельствует об эффективности противораковой терапии.

3. Проведение противораковой терапии, направленной на нелимфоидные опухолевые клетки, экспрессирующие TCR или опухолево-специфичные варианты цепей.

3.1 Состояние экспрессии TCR в нелимфоидных опухолях.

Согласно данному положению настоящего изобретения противораковая терапия нелимфоидных опухолей основывается на экспрессии этими опухолями T клеточного рецептора (TCR) и/или вариантов цепей. Существенно, что опухолевые клетки могут экспрессировать несколько различных вариантов цепей, относящихся к TCR (наиболее часто V8 ), представляющих собой гипервариабельную область для выражения тканевой и/или опухолевой специфичности. Тем не менее, даже будучи специфичными для ткани, эти последовательности не являются иммуногенными, так как несут функциональное сходство с TCR лимфоцитов. Более того, они могут вести себя как элемент, запускающий иммуносупрессию или анергию. Таким образом, способ, описанный в настоящем изобретении, заключается в направлении противораковой терапии на нелимфоидные опухоли, экспрессирующие TCR.

Согласно одному из положений настоящего изобретения клеточно-ассоциированная экспрессия TCR может быть определена в солидных нелимфоидных опухолях. Эксперименты показывают, что нелимфоидные опухоли человека и экспериментальные нелимфоидные опухоли экспрессируют TCR. Следующие примеры в разделах А - Г показывают определение клеточно-ассоциированного TCR в человеческих и экспериментальных опухолях с использованием одного или нескольких методов из следующей группы методов: флуоресцентная микроскопия (измерение TCR на поверхности), мРНК Нозерн и слот-блот анализ (измерение экспрессии мРНК, соответствующей TCR ), амплификация и анализ мРНК (измерение экспрессии мРНК, соответствующей TCR) и использование количественного флуоресцентного анализа (измерение поверхностного TCR ). Опухоли человека и экспериментальные опухоли были получены из следующих источников: клетки меланомы B16F10 были предоставлены Др. М.Ф. Пупон (MF Poupon) из Парижа. Клетки Colon 51B и клетки Colon 51B lim 10 были предоставлены Др. Р. Бресалиером (R. Bresalier) из США. Клетки MCA-26 были предоставлены Др. И. Фидлером (I. Fidler) (США). MMC-7489 клетки были предоставлены Др. Дж. Ваагенд (J. Vaageand). SW480, SW480E, SW480R и SW620 были предоставлены Др. И.Б. Вейнстейном (I.B. Weinstein). Человеческий биопсийный материал был предоставлен Др. Алонзо и Др. Пеллин (Alonso and Pellin) из Испании. Остальные опухолевые линии были получены из Американской Колекции Клеточных Культур (ATCC). Все опухолевые линии выращивались в пластиковых фласкетах во влажной атмосфере с 5% содержанием CO₂, в соответствующей культуральной среде с содержанием 10% эмбриональной сыворотки (FBS) и пенициллина со стрептомицином. Все образцы опухолей человека, для исключения возможной контаминации лимфоцитами, готовили следующим образом: образец опухоли удаляли во время оперативного вмешательства, промывали в ростовой среде, содержащей пенициллин и стрептомицин, резали и помещали на 10 мин при 37^oC в мешалку в 20 мл GBSS, содержащий 0.02% проназы Е (Sigma, США) и 0.05% коллагеназы 1-го типа при pH 7.4. Клетки суспензии затем фильтровали через нейлоновую марлю и центрифугировали дважды в течение 10 мин при 250 g. Изолированные клетки затем подкожно имплантировали голым мышам. Через 21 день опухолевого роста опухолевые клетки собирали для изучения экспрессии TCR.

А. Флуоресцентная микроскопия TCR

Материалы биопсии опухолевой или хирургической биопсии могут быть дезагрегированы и приготовлены непосредственно для флуоресцентного анализа. С другой стороны, опухолевые клетки могут быть культивированы в 8-ми луночных наклонных планшетах (Biotek) в течение 48 час. Затем удаляют супернатант, клетки осторожно промывают PBS, фиксируют фиксатором Карнуа. После 3 промывок PBS клетки инкубируют в течение 30 мин при 37^oC в растворе PBS, содержащем 4 мкг/мл моноклональных меченых ФИТЦ крысиных антител к человеческому TCR (постоянные и вариабельные области) (Genzyme, Boehringer Manheim). После инкубации лунки были дважды промыты PBS. Контроль готовили с использованием крысиных моноклональных антител, меченных ФИТЦ к мышиному иммуноглобулину G₂ (Genzyme, Boehringer Manheim), Клетки наблюдали с помощью лазерного сканирующего флуоресцентного микроскопа.

Б. Нозерн мРНК и слот-блот анализ

мРНК получали из клеток селезенки, КонА-активированных клеток селезенки и опухолевых клеток. После выделения и определения мРНК (электрофорез в 0,7% агарозном геле, доказана интактность) было взято 20 мкг очищенной РНК и разделено в 1,2% агарозном геле, содержащем 2,2 М формальдегида. Электрофорез выполнялся при напряжении 80V. Дорожки, содержащие стандарты молекулярного веса, были отрезаны от геля и измерен путь миграции. Гель был промыт и перенесен на нитроцеллюлозный фильтр. Перед блоттированием 2 мкг мРНК были разведены до конечного объема 100 мкл в 10SSC-формальдегиде и денатурированы путем нагрева при 65^oC в течение 10 мин. мРНК была связана с нитроцеллюлозным фильтром с помощью УФ облучения. Блот был прегибридизирован в течение 4 ч при 45^oC в 6SSC, 0.5 SDS, 5Denhart s, 10 мМ ЭДТА, 50 мкг/мл обработанной ДНК спермы лосося и 50 мкг/мл тРНК E. coli. Одновременно было помечено 5 пикомолей ДНК зонда к человеческому TCR или TCR морской свинки (Clontech). Мечение проводили согласно стандартному протоколу путем мечения 5"" конца олигонуклеотидным зондом с гамма-³²P АТФ. 100 мкг ДНК человеческого бета-актина (Clontech) было помечено с помощью случайного праймера. Гибридизацию мРНК блота проводили при 45^oC в течение 24 ч с радиоактивными зондами (210⁹ cpm/ l специфической радиоактивности). Затем блоты были промыты раствором 5SSC - 0.1 SDS при температуре гибридизации в течение 20 мин. Блоты были экспозированы в течение различных периодов времени на рентгеновскую пленку при -70^oC. Зонды были удалены с фильтров путем инкубации в стерильной воде при 100^oC в течение 10 мин и фильтры были регибридизированы с остальными зондами. Количественный анализ 10 авторадиограмм был выполнен с помощью видеоденситометра.

В. Ферментная амплификация мРНК опухолевых клеток

Экспрессия TCR может быть обнаружена путем экстракции и очистки мРНК клеток нелимфоидных опухолей с последующей энзиматической амплификацией очищенной мРНК для получения количеств, достаточных для обнаружения и анализа. Могут быть использованы следующие методы, используемые для ферментативной амплификации: PCR (полимеразная цепная реакция), QB репликаза и NASBA (амплификация, основанная на секвенировании нуклеиновых кислот). Обнаружение амплифицированной нуклеиновой кислоты может быть проведено различными методами, включая, но не ограничиваясь:

электрофорез в агарозном геле, Нозерн блоттинг, гибридизация с последующим анализом, основанным на флуоресценции, гибридизация с последующим анализом, основанным на хемилюминесценции, титрование по результатам гибридизации. Олигонуклеотидные праймеры и зонды могут быть синтезированы по результатам секвенирования TCR гена (Waters et al., 1992, Diabetes 41:308-312). Зонды могут быть синтезированы со встроенной изотопной или неизотопной меткой. С другой стороны, метка может быть встроена непосредственно в амплифицированный продукт.

В данном примере одноцепочечная кДНК получена путем обратной транскрипции из экстрагированной из опухолевых клеток мРНК. ДНК была амплифицирована с использованием праймеров для TCR генов, полученных из коммерческих источников. Амплифицированный продукт был разделен в 1.2% агарозном геле и окрашен бромидом этидия в параллелях с позитивным и негативным контролями. Количественное определение выполнено с помощью установки "Photoquant System" (BAF, Испания),

Г. Количественный флуоресцентный анализ

Опухолевые клетки культивировали в 24-луночных планшетах в течение 48 часов, супернатант был удален и лунки были нежно промыты PBS. Затем клетки нежно счищали с лунок и инкубировали в течение 30 мин при 4^oC в растворе PBS, содержащем 1 мкг/мл коньюгированных с ФИТЦ крысиных моноклональных антител против мышиного TCR, проводили фиксацию 1% параформальдегидом, анализ проводили в течение 48 часов, используя микрофлуориметр. Во всех случаях был поставлен контроль. Клетки селезенки использовали как отрицательный контроль, а КонА-активированные клетки использовали как положительный контроль экспрессии антигенов. Количественный анализ экспрессии TCR проводили с использованием специального программного обеспечения (Imagel, США и Photoquant, Испания).

Табл. 5 показывает, что клеточно-ассоциированная экспрессия TCR представлена в нелимфоидных опухолях человека.

3.2 Клиническое использование клеточно-ассоциированной экспрессии солидными нелимфоидными опухолями человека TCR.

3.2.1 Иммуномодуляция

Настоящее изобретение предоставляет, благодаря специфичности TCR, способ направления препаратов непосредственно на клетки, формирующие метастатические колонии, и на покоящиеся метастатические опухолевые клетки. Стафилококковый энтеротоксин (SEA, SEB и т.д.) связывает вариабельные цепи опухолевых клеток с антигенами гистосовместимости класса II антиген-представляющих клеток (CMH II), что вызывает модуляцию ответа иммунной системы на опухолевые клетки. Эти реакции соотносятся с отсутствием иммунного ответа на большинство опухолей и переходом клеток опухоли в покоящееся состояние с возможностью обратного перехода вследствие случайного воспалительного процесса, даже годы спустя после удаления первичной опухоли.

Способ целенаправленного воздействия на клетки, формирующие метастатические колонии, покоящиеся клетки и раковые клетки в целом с помощью TCR, и включающий модуляцию иммунной системы, как описано в приведенных ниже положениях:

Положение (A). Способ модуляции иммунного ответа, который достигается путем использования молекул, способных идентифицировать TCR-специфичные последовательности опухолевых клеток каждого специфичного происхождения (органного, тканевого, группы клеток и т.д.) и которые распознавались бы иммунной системой, направляя необходимый процесс иммунологических взаимодействий. Эти молекулы включают стафилококковый энтеротоксин или антитела к идиотипу TCR, связанные с IL-1 или IL-2.

Положение (B). Способ модуляции пролиферации опухоли, который достигается путем использования молекул, способных идентифицировать TCR-специфичные последовательности опухолевых клеток каждого специфичного происхождения (органного, тканевого, группы клеток и т.д.) и которые распознавались бы иммунной системой, направляя необходимый процесс иммунологических взаимодействий.

Иммунная модуляция или модуляция пролиферации опухоли может быть достигнута путем производства моноклональных антител TCR идиотипа к клеткам нелимфоидной опухоли различных групп на основе органной специфичности опухоли, для их фармакологического или диагностического использования. С другой стороны, антитела к растворимому человеческому TCR, выделенному из определенных нелимфоидных опухолей, могут быть получены согласно способу, описанному Бази (Basi et al., 1992, J. of Immunol. Methods 155:175-191), причем полученные антитела распознают множественные эпитопы TCR клеточной поверхности, экспрессированного данной нелимфоидной опухолью. Соединение, которое может приводить к иммуномодуляции, может быть получено путем соединения известными способами IL-2 или IL-1 с антителами к идиотипу TCR. Такое соединение может включать IL-1 или IL-2, находящийся внутри липосом, как носителя и антитела к идиотипу TCR, встроенные известными способами в поверхность липосом. Соединение может использоваться по системному принципу.

3.2.2 Противоопухолевая лекарственная терапия, нацеленная на TCR

Согласно настоящему изобретению, специфическая противоопухолевая лекарственная терапия, нацеленная на TCR, включает использование по отношению к системам органов, в терапевтически эффективных количествах, соединения, состоящего из молекул токсина, радиоизотопа или хемотерапевтического агента соединенного с антителами к человеческому идиотипу TCR. Такое соединение может включать хемотерапевтический агент, находящийся внутри липосомального носителя и антитела к идиотипу TCR, встроенные в поверхность липосом, используя известные способы. За эффективностью лечения можно наблюдать путем измерения клеточно-ассоциированной экспрессии TCR путем использования одного из методов, описанного выше в п. 3.1 в разделах А-Г, или используя клинический диагностический набор для иммунологической оценки с использованием антител к идиотипу TCR. Причем уменьшение числа нелимфоидных опухолевых клеток, экспрессирующих клеточно-ассоциированный TCR, по отношению к числу нелимфоидных опухолевых клеток, экспрессирующих TCR до начала лечения, является показателем эффективности противораковой терапии.

Пептиды, соответствующие противо-TCR идиотипу опухолевых клеток, могут быть встроены для фармакологического использования в MHC II антиген-представляющих клеток.

Возможно, что вследствие специфичности вариантов -цепей в опухолях для создания соединений, целенаправленно связывающихся с TCR, необходимо выделить у пациента опухолевые клетки, получить специфичные антитела к идиотипу TCR данного опухолевого варианта или определить нуклеотидную последовательность варианта и синтезировать соответствующий пептид.

Хотя настоящее изобретение, для лучшего понимания, описано с помощью иллюстраций и примеров в деталях, различные модификации представляются очевидными из описания и графических материалов. Эти модификации подразумеваются включенными в объем заявляемого изобретения и соответствуют заявляемой формуле изобретения.