среда инкубации для определения активности каталазы в плазме крови

Формула изобретения

Среда инкубации для определения активности каталазы в плазме крови, содержащая фосфатный буферный раствора ацетилацетона, метанол, перекись водорода, детергент, отличающаяся тем, что среда инкубации дополнительно содержит хлорид аммония, а в качестве детергента тритон X-100 при следующем соотношении компонентов, мМ/л:

K₂HPO₄/NaH₂PO₄ - 60

Ацетилацетон - 500

Метанол - 500

H₂O₂ - 11,6

Тритон Х-100 - 0,769

NH₄Cl - 500е

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в терапии, кардиологии, биохимии, биологии.

Известна среда инкубации для определения активности каталазы (КФ 1.11.1.6) с реактивом перманганата калия (1) с воспроизводимостью метода до 8,7% и по снижению концентрации перекиси водорода в кювете спектрофотометра при длине волны = 240 нм [1].

Известна также среда инкубации, содержащая фосфатный буфер, ацетилацетон / метанол, перекись водорода [2].

Указанные среды инкубации для определения активности каталазы в плазме крови не обеспечивают высокой точности определения активности каталазы в плазме крови и не позволяют проводить кинетическое определение активности каталазы.

Наиболее близкой (прототип) является среда инкубации для определения активности каталазы в тест-системе для определения общего холестерина крови [3], содержащая фосфатный буфер 600 мм/л, pH 7,0, ацетилацетон / метанол 420 мм/л/ 2500 мм/л, гидроксиполиетоксидекан 2,1%, перекись водорода 11,6 мм/л. Конечный объем смеси 760 мкл (длина оптического пути 1 см). Измерение проводят при = 405 нм и температуре 37^oC после 45-минутной инкубации пробы. Регистрацию начинают после внесения 60 мкл раствора метанол/каталазы. Регистрируют окрашенный комплекс 3,5-диацил-1,4 дигидролутидина с одновременным определением холестеролэстеразы в инкубацинной среде.

Известна среда инкубации для определения холестерола, в которой под влиянием холестеролоксидазы холестерол превращается в холестенон, а побочным продуктом реакции является H₂O₂, которая под влиянием добавленной каталазы превращается в H₂O₂ с одновременным окислением метанола в формальдегид. Полученный формальдегид хорошо растворим в воде при температуре 37^oC и прозрачен. Он реагирует с ацетилацетоном в присутствии фосфата аммония с образованием окрашенного в желтый цвет 3,5-дигидролутидина, регистрируемого при = 405 нм при условии линейной зависимости протекания реакции в течение 9 минут.

Как показали экспериментальные исследования, проведенные нами, среда инкубации-прототип не дает возможности определения линейной зависимости реакции, то есть не позволяет проводить кинетическое определение активности каталазы, так как в среде инкубации прототипа предусмотрена концентрация ингредиентов, оптимальная для предварительного исследования активности холестеролэстеразы, а именно концентрация фосфатного буфера высока и в 10 раз отличается от оптимальной молярности буфера, используемой при определении активности каталазы и других ферментов переокисления [2, 4, 5].

Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение качества среды за счет возможности регистрации кинетики активности каталазы.

Поставленная задача решается путем создания инкубационной среды для кинетического определения активности каталазы в плазме крови, содержащей фосфатный буферный раствор, ацетилацетон, метанол, перекись водорода, хлорид аммония и тритон Х-100 при следующем соотношении компонентов, ммоль/л:

K₂HPO₄/NaH₂PO₄ - 60

NH₄Cl - 500

Ацетилацетон - 500

Метанол - 500

H₂O₂ - 11,6

Тритон Х-100 - 0,769

В проанализированной авторами литературе не найдено совокупности отличительных признаков и они явным образом не следуют для специалиста из уровня техники. Данную среду инкубации можно использовать для регистрации кинетики активности каталазы в плазме крови.

Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень", промышленно применимо.

Для определения активности каталазы в плазме крови среду инкубации получают указанным выше образом.

Затем вносят 60 мкл плазмы крови.

Регистрацию проводят в течение 10 мин.

Пример 1.

Больной В., 40 лет, обследование в НИИКИФ МЗРФ, г. Томск 21.05.97 г. по поводу ИБС, стенокардии напряжения, ФК II.

Общий анализ крови отклонений от нормы не имел. СОЭ 78 мм/ч, НВ 154 г/л; эритроциты 5,510¹²/л.

Активность каталазы в плазме крови определена с помощью предложенной среды инкубации и составляла 6,0 мкат/л.

Кинетическая кривая активности каталазы представлена на графике N 5 (см. фиг. 5).

Среда инкубации для определения активности каталазы была апробирована в ряде экспериментов (см. выше) и при проведении клинических испытаний. При кинетическом определении активности каталазы в плазме крови у 96 больных ишемической болезнью сердца (ИБС) и здоровых лиц (табл. 5 и график N 5).

С целью получения оптимальной среды инкубации для определения активности каталазы крови нами были проведены экспериментальные исследования с использованием среды инкубации способа-прототипа.

С помощью среды инкубации возможно определение активности каталазы, что продемонстрировано нами с помощью введения в инкубационную среду вместо каталазы плазмы крови сухой кристаллической каталазы фирмы "Fluka" в концентрации, указанной в способе-прототипе (2460000 ЕД/л). Кинетика реакции и статистическая обработка результатов представлены на графике N 1 (см. фиг. 1) и в таблице N 1. Реакция протекала нелинейно.

Далее мы внесли в инкубационную смесь концентрацию каталазы, близкую к таковой в плазме крови.

Результаты представлены на графике N 1 и в таблице N 1.

Экспериментальным путем подбирались оптимальные концентрации ингредиентов реакции. Результаты измерения концентрации фосфатного буфера, pH 7,0 с последующим определением кинетики каталазной реакции представлены на графике N 2 (см. фиг. 2). Результаты измерения концентрации ацетилацетона с последующим определением кинетики каталазной реакции представлены на графике N 3 (см. фиг. 3) и в таблице N 3. Результаты изменения концентрации метанола с исследованием кинетики каталазной реакции представлены на графике N 4 (см. фиг. 4) и в таблице N 4. Результаты определения кинетики каталазной реакции в оптимальных условиях представлены на графике N 1 и в таблице N 1.

При изменении концентрации веществ в инкубационной среде в сторону их увеличения или уменьшения реакция замедляется, что свидетельствует о подобранной авторами оптимальной концентрации ингредиентов для фотометрического определения кинетики активности каталазы. При других концентрациях ингредиентов среды инкубации подобного эффекта не достигнуто.

Таким образом, предлагаемая среда инкубации для определения активности каталазы в плазме крови позволила с достаточно высокой специфичностью до 99% определить активность каталазы в плазме крови. Этот факт проверен с блокированием фермента NaN₃ 10 м/л с чувствительностью до 0,01 ед. оптической плотности (прибор ФП-901 позволяет измерять ее с точностью до 0,001) и с воспроизводимостью до 4,06 %.

Используемая же среда инкубации способа-прототипа позволила получить воспроизводимость метода, равную 16,7%.

Данные преимущества использования предложенной среды инкубации для определения активности каталазы в плазме крови были достигнуты дополнительным введением в среду инкубации NH₄Cl, снижением в 10 раз концентрации фосфатного буфера [4-6], изменением концентрации ацетилацетона/метанола.

Введение NH₄Cl и изменение концентрации компонентов инкубационной среды позволило определить кинетику активности каталазы в плазме крови.

Предлагаемая среда инкубации позволила создать оптимальные условия для кинетического определения активности каталазы в плазме крови в течение 9 минут, что позволяет рекомендовать разработанную среду инкубации для проведения клинических лабораторных исследований. В настоящее время не вызывает сомнений необходимость одновременно с исследованием интенсивности процессов перекисного окисления липидов (определения концентрации малонового диальдегида, активности миелопероксидазы, супероксидисмутазы, глутатионпероксидазы) определения активности каталазы в плазме крови для оценки наследственной предрасположенности к атеросклерозу, возможности ранней диагностики ишемической болезни сердца и острого инфаркта миокарда, а также ряда аутоиммунных заболеваний [6, 7].

В настоящее время в клинической практике отсутствует оптимальная среда инкубации для определения активности каталазы в плазме крови, так как до недавнего времени считалось, что активность этого фермента в крови и моче изменяется только при железодефицитной анемии, талассемии, пернициозной анемии, гематурии, протенурии, пиурии. Однако в настоящее время в связи с решением самых насущных задач профилактической медицины стало необходимо определение активности каталазы одновременно с определением активности креатинфосфокиназы, трансаминаз, ферментов антиоксидантной защиты на разных стадиях коронарного атеросклероза и при разработке способов его профилактики.

Следовательно, разработка среды инкубации для определения активности каталазы в плазме крови насущно необходима в клинической лабораторной практике, так как эта среда инкубации позволяет проводить клиническое определение активности каталазы в биологических объектах.

ЛИТЕРАТУРА

1. Архипова О. Г. в кн: "Методы исследования в профкардиологии", 1988, 127-157.

2. Burs R.F. SIZER L.W. BIOL. CHEM. 1952. N 195. P. 133-140.

3. ROSCHLAN R. et al. Z. KLIN. CHEM. KLIN. BIOCHEM. 1974. N 12. P. 403.

4. Ланкин В.З. и др. Кардиология, 1980, N 7, с. 97-99.

5. Ланкин В.З. Тер. архив, 1985, N 5, с. 58-62.

6. Давиденкова Е.Ф., Шафран М.Г., Векслер Б.М. Клин. Мед., 1990, N 2, с. 34-38.

7. Давиденкова Е.Ф. и др. Клиническая медицина, 1990, N 2, с. 34-38.

8. Прайор. Свободные радикалы в биологии. - М.: Мир, 1979, том 1, 317 с.

9. Осипов А.Н., Азизова О.А., Владимиров В.А. Успехи биологической химии. - М.: Наука, 1990, том 31, с. 180-208.