Курская государственная сельскохозяйственная академия им. И.И. Иванова
Приоритеты:
подача заявки: 2000-06-09
публикация патента: 27.02.2002
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения анатоксина для специфической профилактики заболеваний стафилококковой этиологии. Сущность изобретения заключается в том, что для выращивания стафилококков используют жидкую солевую синтетическую среду, автоклавирование биомассы проводят при 1-1,1 атм в течение 30-35 мин с последующим ее отделением от культуральной жидкости, детоксикацию которой осуществляют 0,3-0,4%-ным формалином. Технический результат заключается в снижении дозы формалина для инактивации, что повышает его антигенную активность. 2 табл.
Способ получения стафилококкового анатоксина, включающий выращивание стафилококков на жидкой питательной среде, стерилизацию биомассы автоклавированием, детоксикацию формалином, отличающийся тем, что для выращивания стафилококков используют жидкую, солевую синтетическую среду, автоклавирование биомассы проводят при 1-1,1 атмосфере в течение 30-35 мин с последующим ее отделением от культуральной жидкости, детоксикацию которой осуществляют 0,3-0,4%-ным формалином.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения стафилококкового анатоксина для специфической профилактики заболеваний стафилококковой этиологии. Известен способ получения стафилококкового анатоксина, предусматривающий выращивание стафилококков на мясоказеино-гидролизатной среде, связан с необходимостью добавления сыворотки крови, подачей стерильной углекислоты и кислорода с последующей длительной детоксикацией токсина и инактивацией стафилококков 0,4-0,6%-ным формалином /Дзагуров С.Г., Репетова М.И. Справочник по применению бактерийных и вирусных препаратов. М., Медицина, 1975, 222 с./. Недостатком способа является необходимость подачи стерильных газов, отсутствие температурной стерилизации снижает выход биологически активных веществ из микробной клетки и существенно удлиняет период детоксикации токсина. За прототип взят разработанный "Способ получения стафилококковой анатоксин-вакцины против стафилококкоза птиц". Указанный способ предусматривает выращивание стафилококков на жидкой питательной среде с 5-7% хлористого натрия и 4% глицерина в течение 7-10 дней до концентрации 5-7 млрд. микробных клеток в 1 мл, стерилизацию при 85-100oС в течение 1,0-1,5 ч и детоксикацию токсина 0,6-0,8%-ным формалином при экспозиции 45-55oС в течение 7-10 дней /Евглевский А.А. с соавт. А.С. 1706631, МПК А 61 К 39/085/. Недостатком указанного способа получения стафилококковой анатоксин-вакцины является слишком высокая, до 0,6-0,8%, концентрация формалина в вакцинном препарате, не позволяющая его применять при парентеральном методе введения без предварительного разведения ввиду неизбежных воспалительных реакций. В то же время, разведение препарата до требуемой 0,3-0,4%-ной концентрации формалина, в два раза снизит его антигенную активность, что неизбежно потребует увеличения дозы введения или удлинения курса лечения. Для устранения вышеперечисленных недостатков предлагается способ получения стафилококкового анатоксина, включающий выращивание стафилококков на жидкой питательной среде, стерилизацию биомассы автоклавированием, детоксикацию токсина культуральной жидкости формалином. Новым является то, что для выращивания стафилококков используется жидкая солевая синтетическая стандартная питательная среда /Патент 2132382/, а полученную после окончания роста микробов биомассу подвергают стерилизации автоклавированием при 1-1,1 атм в течение 30-35 мин, фильтрацией отделяют биомассу от культуральной жидкости, детоксикацию последней проводят 0,3-0,4%-ным формалином. Использование жидкой солевой синтетической среды обеспечивает хороший и бурный рост стафилококков при плотности посева 90-100 млн. микробных тел на 1 мл среды, стабилизировать и максимально повысить накопление биомассы до 14-15 млрд. микробных тел в 1 мл культуральной жидкости. Стерилизация автоклавированием, проводимая в режиме 1-1,1 атм в течение 30-35 мин, позволяет полностью убить биомассу стафилококков и способствует увеличению выхода токсина в культуральную жидкость до 0,7-0,8 мг/мл, что повышает ее биологическую активность, а следовательно, иммуногенные свойства вакцинного препарата. Для получения стафилококкового анатоксина убитую автоклавированием биомассу стафилококков отделяют фильтрацией от культуральной жидкости, после чего в последнюю для детоксикации токсина добавляют формалин до 0,3-0,4%-ной концентрации. Данная концентрация формалина выбрана с учетом общепринятых требований его содержания в вакцинных препаратах, предназначенных для парентерального введения. Опыты показали, что данная концентрация формалина обеспечила полную инактивацию и детоксикацию токсичных свойств препарата, так как при внутримышечном его введении в дозе 0,5 мл белым мышам он не вызывал их заболевания и гибели в течение 10 дней, в то время как контрольное введение не подвергнутого детоксикации культурального фильтрата вызывало их гибель в течение суток. Пример осуществления способа. Для получения стафилококкового анатоксина использовали стандартные 2-литровые биобутыли с объемом синтетической питательной среды 1 л. Плотность посева стафилококков составляла 100 млн. микробных тел на 1 мл среды. Выращивание стафилококков проводили при 37oС, периодически, 2 раза в сутки, взбалтывая содержимое биобутылей, до конечной концентрации 15 млрд. микробных тел в 1 мл. Выращенную биомассу стафилококков подвергли стерилизации при 1 атм в течение 30 мин до выделения 0,8 мг/мл белка, после чего биомассу отделили фильтрацией от культуральной жидкости, а полученный культуральный фильтрат подвергли детоксикации 0,4%-ным формалином при температуре 45oС в течение 7 дней. Полученный нативный стафилококковый анатоксин пригоден для аэрозольного или накожного применения. Для парентерального применения стафилококковый анатоксин подвергли сорбции на геле гидроокиси алюминия из расчета 2-3 мг окиси алюминия на 1 мл. Таким образом, данный способ получения стафилококкового анатоксина, по сравнению с известными, имеет ряд преимуществ, в частности, использование стандартной синтетической питательной среды для выращивания стафилококков позволяет обеспечить бурный и равномерный рост биомассы до конечной ее концентрации 14-15 млрд. микробных тел в 1 мл, что выше чем на других питательных средах, и при этом не требуется подача стерильной углекислоты и кислорода; указанный режим автоклавирования позволяет полностью убить биомассу стафилококков и способствует увеличению выхода токсина в культуральную жидкость; значительно сокращен период детоксикации токсина культурального фильтрата. Полученный стафилококковый анатоксин был клинически испытан для лечения и профилактики заболеваний стафилококковой этиологии. Примером оценки профилактической эффективности стафилококкового анатоксина могут служить данные его применения на собаках породы восточно-европейская овчарка в питомнике УВД г. Курска. Для профилактики заболеваний стафилококковой этиологии стафилококковый анатоксин применяли двукратно, подкожно, в дозе 0,5+0,5 мл с интервалом 14 дней. Контролем служили интактные собаки. Результаты применения стафилококкового анатоксина для наглядности отражены в таблице 1. Для лечебных целей стафилококковый анатоксин применяли на собаках, больных дерматитом, в патогенезе которого активное участие принимал золотистый стафилококк. Результаты оценки лечебной эффективности применения стафилококкового анатоксина отражены в таблице 2. Исходя из результатов испытания стафилококкового анатоксина можно утверждать, что полученный препарат обладает выраженными лечебными и профилактическими свойствами при заболеваниях стафилококковой этиологии.
