способ определения аллелей гена хемокинового рецептора ccr2 по полиморфному сайту v64i

Формула изобретения

Способ определения аллелей гена хемокинового рецептора CCR2 по полиморфному сайту V64I, включающий забор материала от пациента, амплификацию фрагмента гена CCR2 с использованием пары праймеров, отличающийся тем, что амплификацию осуществляют методом аллельспецифической ПЦР с использованием двух пар праймеров, при этом для идентификации распространенного аллеля CCR2 64V используют прямой праймер 5"-TGCGCAGTTTATTAAGATGAGGTC-3", для идентификации редкого аллеля CCR2 64I используют прямой праймер 5"-TGCGCAGTTTATTAAGATGAGGCT-3", а в качестве обратного праймера для идентификации обоих аллелей используют праймер 5"-GTGTGGTCATCATTTTGTTCTTTG-3".

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к молекулярной биологии и медицине и может быть использовано для быстрого и массового определения аллелей и генотипов гена хемокинового рецептора CCR2 по полиморфизму V64I.

Полиморфизм гена хемокинового рецептора CCR2, обусловленный заменой G на А в 190-й позиции кодирующей части, приводящей соответственно к замене валина (V) на изолейцин (I) в 64-й позиции полипептида (обозначаемый как CCR2 64I), широко изучен в связи с генетически обусловленными различиями в развитии симптомов СПИД после заражения вирусом ВИЧ. Популяционная частота более редкого аллеля CCR2 64I для европеоидов составляет 9,8%, афроамериканцев - 15,1%, монголоидов - 25% (Smith et al., Science, 1997, v.277, p.959-964). Анализ генетических ассоциаций показал, что у ВИЧ-инфицированных индивидуумов, несущих аллель CCR2 64I, развитие симптомов СПИД задерживается на 2-4 года по сравнению с нормой. Имеются работы по ассоциации этого аллеля с сахарным диабетом (Szalai С et al., Pediatr Res, 1999, v.46(1), р.82-4) и астмой (Romano-Spica et al., Amer J Hum Genet., 2000, v.67(4), p.238).

Все известные способы выявления аллелей гена CCR2 основаны на использовании ПЦР в сочетании с анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (Michael et al., Nature Med, 1997, v.3(10), р.1160-1162; Smith et al., Nature Med, 1997, v.3, p.1052-1053) либо на использовании анализа конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК (SSCP) или секвенирования (Smith et al., Science, 1997, v.277, р.959-964).

Наиболее близким к заявляемому способу (прототипом) является способ, основанный на двухэтапной процедуре амплификации ДНК с последующим расщеплением амплифицированного фрагмента рестриктазой BsaBI (Michael et al., Nature Med, 1997, v.3(10), p.1160-1162). В данном способе используют праймер, содержащий замену для генерации искусственного сайта рестрикции, отсутствующего в нуклеотидной последовательности гена CCR2.

Режим амплификации в прототипе: 94^oС в течение 4 мин, затем 5 циклов 30 с при 94^oС, 30 с при 65^oС, 30 с при 72^oС, затем 21 цикл 30 с при 94^oС, 30 с при 65^oС с последующим понижением температуры на 0,5^oС в каждом цикле до 55^oС, 30 с при 72^oС, затем 15 циклов 30 с при 94^oС, 30 с при 55^oС, 30 с при 72^oС, затем прогрев 10 мин при 72^oС. Амплификация с праймерами CCR2B-forward 5"-TTGTGGGCAACATGaTGG-3" (позиции 170-187) и CCR2B-reverse 5"-GAGCCCACAATGGGAGAGTA-3" (позиции 335-352) приводит к наработке фрагмента размером 183 п. н. Здесь и далее нумерация соответствует последовательности кДНК CCR2 из GenBank ( U03882), в которой отсчет идет от аденина инициирующего кодона трансляции. Выделенный аденин в первом праймере (см. выше) указывает на произведенную искусственную замену С на А (поз. 184 в кДНК), что в случае редкого аллеля, у которого в поз. 190 вместо G находится А, ведет к синтезу и амплификации фрагмента ДНК с сайтом рестрикции для эндонуклеазы BsaBI (GA¹⁸⁴TNN^ NNA¹⁹⁰TC). При добавлении рестриктазы BsaBI к ПЦР-продукту в случае аллеля CCR2 64I происходит расщепление ДНК с образованием двух фрагментов различной длины, 165 и 18 п.н., а в случае распространенного аллеля CCR2 64V этого не наблюдается. Таким образом, в результате электрофоретического анализа ДНК в 4% агарозе от генотипов, гомозиготных по распространенному аллелю (CCR2 64V), идентифицируется только полоса, соответствующая фрагменту ДНК длиной 183 п.н.; от гомозигот по редкому аллелю (CCR2 64I) - две полосы - 165 и 18 п.н., а от гетерозигот - три полосы - 183, 165 и 18 п.н.

К недостаткам метода следует отнести: возможность ошибочного генотипирования гомозигот и гетерозигот по редкому аллелю CCR2 64I в случае неполного расщепления амплифицированного фрагмента ДНК рестриктазой BsaBI; необходимость проведения большого числа циклов амплификации для визуализации при электрофорезе фрагментов ДНК; усложненный температурный профиль ПЦР, обусловленный неполным соответствием структуры праймера нуклеотидной последовательности гена; относительная трудоемкость анализа и, наконец, необходимость применения рестриктазы, что существенно удорожает анализ.

Технической задачей предлагаемого изобретения является повышение точности и надежности выявления аллельных вариантов и генотипов CCR2, упрощение и удешевление анализа для массового использования в клинических лабораториях.

Предлагаемый способ заключается в следующем:

Геномную ДНК из крови выделяют из 5-10 мл периферической крови по стандартной методике с использованием протеиназы К с последующей экстракцией фенол/хлороформом (Смит К., Клко С., Кантор Ч. В сб. Анализ генома. Под ред. К. Дейвиса. , М. : Мир, 1990. С.58-94). Для амплификации распространенного аллеля (CCR2 64V) с G в 190-й позиции используют прямой праймер 5"-TGCGCAGTTTATTAAGATGAGGTC-3" (позиции 213-190) с цитозином на 3" конце. Для амплификации более редкого аллеля (CCR2 64I) с А в 190-й позиции прямой праймер имеет структуру 5"-TGCGCAGTTTATTAAGATGAGGCT-3" (позиции 213-190) с тимином на 3" конце. В качестве обратного праймера для амплификации обоих аллелей используют праймер 5"-GTGTGGTCATCATTTTGTTCTTTG-3".

Используемый режим амплификации включает стадии: начальную денатурацию при 95^oС в течение 5 мин, затем 32 цикла - с денатурацией в течение 1 мин при 95^oС; отжигом в течение 0,9 мин при 55^oС и синтезом в течение 1,2 мин при 72^oС. Продукты ПЦР анализируют электрофорезом в 4% полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием.

Определение аллелей гена CCR2 проводят по наличию или отсутствию в геле фрагмента размером 296 п.н. В случае, если фрагмент выявляется при амплификации ДНК с обеими парами праймеров, это свидетельствует о присутствии обеих аллелей в генотипе индивида. Следовательно, носитель образца ДНК - гетерозигота. Амплификация фрагмента только с одной парой праймеров и отсутствие амплификата при использовании другой пары свидетельствует о гомозиготном состоянии по соответствующему аллелю.

С помощью предлагаемого способа обследованы 93 русских и 20 якутов. В результате среди русских выявлены 19 гетерозиготных и 1 гомозиготный по аллелю CCR2 64I индивидуум. У якутов число гетеро- и гомозигот составляет 9 и 1 соответственно. Частота редкого аллеля для европеоидов (русские) составляет 11,3%, для монголоидов (якуты) - 27,5%.

Определяющим существенным отличием заявляемого способа по сравнению с прототипом является то, что в прототипе проводят стандартную амплификацию ДНК с использованием пары праймеров, фланкирующих интересующий фрагмент. В заявляемом способе используют другой подход - аллель-специфическую амплификацию. При таком анализе амплификацию проводят в двух параллельных пробах: в одной - в качестве прямого праймера используют олигонуклеотид с концевым нуклеотидом (Т), комплиментарным аденину (А) в 190 позиции редкого аллеля гена (CCR2 64I), а в другой - праймер с концевой дезоксицитидиловой кислотой (С), комплиментарной гуанину (G) в 190 позиции распространенного аллеля (CCR2 64V). Такой подход позволяет значительно увеличить точность и надежность выявления соответствующих аллелей гена CCR2 и упростить процедуру анализа продуктов амплификации. Кроме того, в заявляемом способе отсутствует этап обработки рестриктазой амплифицированного фрагмента ДНК. Это снижает вероятность субъективной ошибки при интерпретации результатов генотипирования, поскольку идентификации подлежит одна полоса, а не несколько, как имеет место быть в случае прототипа.

Изобретение иллюстрируется следующим примером конкретного выполнения.

Геномную ДНК трех индивидуумов выделяли из периферической крови с использованием протеиназы К и экстракции фенол/хлороформом. Смесь для амплификации объемом 25 мкл содержала: 67мМ Трис-HCl, рН 8,8, 50 мМ КСl, 98мМ -меркаптоэтанол, 0,01% Tween-20, 0,5 мкг тотальной ДНК, по 0,5 мкМ прямого и обратного праймера, 0,2 мМ каждого из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, 1,5мМ MgCl₂, 10% глицерин и 1,25 е.а. Taq-полимеразы. Для идентификации распространенного аллеля (CCR2 64V) использовали прямой праймер 5"-TGCGCAGTTTATTAAGATGAGGTC-3". Для идентификации редкого аллеля (CCR2 64I) использовали прямой праймер 5"-TGCGCAGTTTATTAAGATGAGGCT-3". В качестве обратного праймера для амплификации обоих аллелей использовали олигонуклеотид 5"-GTGTGGTCATCATTTTGTTCTTTG-3". Режим амплификации: начальная денатурация при 95^oС - 5 мин, затем 32 цикла, каждый из которых состоял из денатурации - 1 мин при 95^oС; отжига - 0,9 мин при 55^oС и синтеза - 1,2 мин при 72^oС. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 4% полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием. На гель наносили 5 мкл амплификата. Электрофорез проводили в течение 30 мин при напряжении 300 В.

Электрофореграмма приведена на фиг. 1. Образец 1 взят от индивидуума, гомозиготного по аллелю 64V/64V. На это указывает наличие фрагмента ДНК размером 296 п.н. только на одной из пары дорожек в случае амплификации фрагмента ДНК CCR2 с парой праймеров, один из которых имеет 3"-концевой нуклеотид, комплиментарный гуанину в поз.190 распространенного аллеля (CCR2 64V) - (дорожки 1 и 2). Образец 2 принадлежит индивидууму с гетерозиготным генотипом 64V/64I (фрагмент размером 296 п.н. выявляется при амплификации с обоими парами праймеров - дорожки 3 и 4 соответственно). Образец 3 получен от индивидуума, гомозиготного по аллелю 64I/64I. На это указывает наличие фрагмента только при амплификации с той парой праймеров, где прямой имеет 3"-концевой нуклеотид, комплиментарный аденину в позиции 190 редкого аллеля (CCR2 64I) (дорожки 5 и 6).

Правильность определения генотипов заявляемым способом была подтверждена независимо с помощью полимеразной цепной реакции и гидролиза продукта ПЦР рестриктазой Bse8 I (СибЭнзим, Новосибирск, изошизомер рестриктазы BsaBI) по способу, взятому в качестве прототипа (Smith et al., Science 1997, v.277, р. 959-965), а также с помощью прямого секвенирования (фиг.2). Из фиг.2 видно, что результаты анализа, выполненного заявляемым способом и с помощью прямого секвенирования, полностью совпадают.