способ выявления веществ, обладающих антиоксидантными свойствами, in vitro

Формула изобретения

Способ выявления веществ, обладающих антиоксидантными свойствами, in vitro, заключающийся в использовании тест-объектов, отличающийся тем, что в качестве тест-объекта используют ферменты глутатионредуктазу, супероксиддисмутазу, глутатионпероксидазу и каталазу, определяют скорость ферментативной реакции веществ на тест-объектах, при этом соотношение скорости ферментативной реакции на тест-объекте после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества должно быть больше 1.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, и может быть использовано, в частности, в фармакологии.

Разработка современных эффективных экспресс-методов для скрининга веществ, обладающих антиоксидантной активностью, является актуальной в связи с необходимостью сокращения сроков исследования веществ, обладающих различной биологической активностью. Эта задача может быть решена путем разработки молекулярных тест-систем с использованием ферментов в качестве тест-объектов.

Антиоксидантную активность оценивают на различных моделях.

Известен стандартный микробиологический метод хемолюминесценции, позволяющий выявлять вещества, обладающие антиоксидантной активностью, с помощью тест-объекта, в качестве которого используют перитонеальные макрофаги [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармокологических веществ, Минздрав РФ, 2000 г.].

Наиболее близким способом к заявляемому относится известный метод определения антиоксидантной активности с использованием в качестве тест-объекта нейтрофилов крови. Ингибировался зимозаном процесс кислородного взрыва и исследовался процесс его ингибирования исследуемым препаратом [патент РФ 2115425].

Исследование в известном способе проводились на цельной крови донора. Гепаринизированная кровь, полученная из локтевой вены, в количестве 0,1 мл добавлялась в анализатор хемолюминометра, затем добавлялось по 0,1 мл раствора люминола и зимозана (для индуцированного кислородного взрыва в нейтрофилах крови). В клетках крови нарастал кислородный взрыв, что регистрировалось по увеличению хемолюминесценции. На пике кислородного взрыва в анализатор вводился препарат и измерялось изменение люминесценции. Контролем служила кровь, к которой не добавлялся препарат.

Недостатком этих способов выявления веществ, обладающих антиоксидантной активностью, является большая трудоемкость и необходимость постоянного контроля за сохранностью и чистотой стандартных тест-объектов, что значительно увеличивает экономические и временные затраты на первичный скрининг.

Цель данного изобретения - создание способа, обладающего высокой специфичностью и чувствительностью, хорошей воспроизводимостью, меньшей трудоемкостью, более высокой экономичностью, чем известные способы.

Поставленная цель достигается за счет использования в качестве тест-объектов ферментов глутатионредуктазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и каталазы, определяют скорость ферментативной реакции веществ на тест-объектах, при этом соотношение скорости ферментативной реакции на тест-объекте после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества должно быть больше 1.

Фермент глутатионредуктаза (далее ГР) катализирует восстановление дисульфида глутатиона (окисленного глутатиона) в глутатион (восстановленный глутатион) [Классификатор ферментов. - М., 1995 г., 1.6.4.2.].

Фермент супероксиддисмутаза (далее СОД) катализирует реакцию дисмутации супероксидного аниона (O₂ ^-) [Классификатор ферментов. - М. , 1995 г., 1.15.11.].

Фермент глутатионпероксидаза (далее ГП) катализирует окисление восстановленной формы глутатиона в присутствии гидропероксида (Н₂O₂) или липидного пероксида (LOOH) [Классификатор ферментов. - М., 1995 г., 1.11.1.9.].

Фермент каталаза расщепляет перекись водорода и присутствует во всех животных и растительных клетках и органах [Классификатор ферментов. - M., 1995 г., 1.11.1.6.].

Для доказательства специфичности заявляемого способа выявления веществ, обладающих антиоксидантной активностью, in vitro с применением заявляемых ферментов были изучены вещества:

- с установленной антиоксидантной активностью, принадлежащие к различным химическим классам;

- с неизвестной биологической активностью;

- вещества, относящиеся к другим фармакологическим группам и не обладающие искомыми свойствами.

Изученные вещества и их характеристика приведены в таблицах 1 и 3.

Изучали влияние веществ, указанных в таблице 1, на скорость реакций, катализируемых ферментами ГР, СОД, ГП, и КАТ in vitro. Скорости реакций, катализируемых заявляемыми ферментами, определяли спектрофотометрически известными методами. Скорость ГП и ГР реакций определяли по убыли НАДФН (никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный) при длине волны 340 нм. Скорость СОД-реакции определяли в присутствии тетразолия нитросинего и феназинметасульфата по приросту НАДН (никотинамидадениндинуклеотид восстановленный) при длине волны 540 нм. Скорость КАТ-реакции определяли по убыли субстрата (Н₂O₂), которую измеряли в виде комплекса с молибдатом аммония по поглощению при длине волны 410 нм. Измеряли скорость ферментативной реакции без добавления изучаемого вещества (контроль) и после добавления изучаемого вещества (опыт). Полученные результаты представлены в таблице 2. В таблице 2 приводятся средние арифметические значения из 2-3 параллельных определений и стандартные отклонения среднего результата (Mm). В примерах приведены результаты, полученные при оптимальных концентрациях вещества в пробе. Из представленных примеров видно, что вещества с антиоксидантной активностью активизируют ферменты ГР, СОД, ГП, КАТ. Вещества, не обладающие антиоксидантной активностью, угнетают заявляемые ферменты.

Исследуемые вещества 5 и 6 обладают антиоксидантной активностью, а исследуемое вещество 7 не обладает антиоксидантной активностью.

Способ выявления веществ, обладающих антиоксидантными свойствами, на заявляемых четырех ферментах позволяет добиться высокой степени точности при определении искомой активности.