способ исследования антиагрегационного действия препаратов с помощью определения агрегации тромбоцитов in vitro

Формула изобретения

Способ исследования антиагрегационного действия препаратов с помощью определения агрегации тромбоцитов in vitro, включающий забор крови, стабилизацию ее после забора, разделение с получением богатой тромбоцитами плазмы с помощью центрифугирования, введение антиагрегационного препарата с последующим перемешиванием, инкубацией плазмы с препаратом и без него при 36,5-37,5^oC, определения информационного показателя до введения антиагрегационного препарата, после введения и анализ полученных данных, по которым судят об эффективности препарата для назначения больному, отличающийся тем, что в качестве исследуемого препарата используют тест-систему из антиагрегационных препаратов, имеющих различные механизмы антиагрегационного действия на тромбоциты, в качестве информационного показателя используют показатель степени агрегации тромбоцитов - АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов (AДФ-АТ) и рассчитывают его по каждому тесту, в случае снижения АДФ-АТ препарата на 50% и более от контрольной пробы препарат определяют как эффективный.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к исследованиям патологических процессов в артериальной системе кровоснабжения человека для улучшения профилактики и лечения больных в ангионеврологических и кардиологических клиниках путем применения антитромбоцитарных препаратов.

Известен способ исследования активации тромбоцитов (патент RU 2108579, кл. G 01 N 33/49, 1996), согласно которому данные характеристики тромбоцитов исследуются по интенсивности светорассеяния при различных условиях разбавления плазмы крови. Последние позволяют варьировать среду и проводить исследования при значениях концентрации ионов кальция в среде, близких к физиологическим. Однако в данном способе не задействована оценка многообразных механизмов активации тромбоцитарной клетки.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ исследования внутрисосудистой агрегеции тромбоцитов in vitro с помощью дезагрегантов (патент RU 2102754, кл. G 01 N 33/48, G 01 N 33/49, 1996), включающий забор крови, стабилизацию ее после забора, разделение с получением богатой тромбоцитами плазмы с помощью центрифугирования, инкубации плазмы при 36,5-37,5^oС с последующим перемешиванием и введением антиагрегационного препарата. О величине внутрисосудистой агрегации судят по кривой дезагрегации.

Однако данным способом невозможно определить степень индивидуальной чувствительности человека к тому или иному антиагрегационному препарату.

В механизмах действия антиагрегационных препаратов на тромбоцитарные клетки ведущую роль играет изменение рецепторной чувствительности мембран тромбоцитов. Эти пути, как правило, включают связывание индуктора агрегации со своим рецептором на внешней мембране тромбоцита и передачу сигнала внутри клетки путем изменения концентрации внутриклеточных метаболитов. Эти два процесса приводят к активации рецепторов фибриногена, вследствие чего происходит его рецепция и связывание клеток друг с другом фибриногеновыми мостиками с образованием клеточных агрегатов. Это сопровождается образованием активированных форм тромбоцитов и их агрегатов.

Активация тромбоцитов может быть вызвана множеством агонистов (АДФ, адреналином, коллагеном, и т.д.), которые действуют через специфические рецепторы на поверхности тромбоцитов.

Формирование клеточного ответа заключается в последовательной активации систем регуляции концентраций вторичных посредников с образованием цепи передач сигнала и является общим для различных клеток. Существование в кровяных пластинках многочисленных мембрано-связанных внутриклеточных механизмов активации позволяет вовлекать многоступенчатую модуляцию активности клеток в процессе тромбообразования. Все это определяет существование и многообразие биологически активных соединений, обладающих способностью изменять функцию тромбоцитов и способствующих вовлечению в процесс как активаторных, так и ингибиторных внутри клеточных механизмов. К числу биологически активных соединений, в том числе, используемых в качестве лекарственных средств, относятся препараты, обладающие способностью модулировать функцию тромбоцитов посредством вовлечения в процессы ингибирования фософолипазы А2 циклооксигеназы, тромбоксансинтетазы, изменение фосфолипидной композиции мембран клеток, образования внутриклеточных посредников - циклических аденозин- и гуанозинфосфатов и оксидазота, а также блокирование специфических рецепторов на мембране клеток.

Исследование эффективности антиагрегантов с различными механизмами действия дает возможность выявлять индивидуальную резистентность к ним у отдельных больных. Это открывает пути повышения эффективности антиагрегационнного действия препаратов посредством индивидуального подбора лекарственных средств на основе данных предварительного исследования чувствительности к ним тромбоцитов крови больных.

Техническим результатом является повышение эффективности антиагрегационного действия препаратов за счет определения индивидуальной чувствительности больных к антиагрегантам с использованием методики агрегации тромбоцитов in vitro.

Он достигается тем, что в способе исследования антиагрегационного действия препаратов с помощью определения агрегации тромбоцитов in vitro, включающем забор крови, стабилизацию ее после забора, разделение с получением богатой тромбоцитами плазмы с помощью центрифугирования, введение антиагрегационного препарата с последующим перемешиванием, инкубации плазмы с препаратом и без него при 36,5-37,5^oC, определения информационного показателя до введения антиагрегационного препарата, после его введения и анализ полученных данных, по которым судят об эффективности ингибирующего действия, дополнительно используют тест-систему из антиагрегационных препаратов, имеющих различные механизмы антиагрегационного воздействия на тромбоциты, концентрацию препарата в тест-системе выбирают, исходя из принятой однократной его дозы, информационный показатель рассчитывают по каждому тесту и по результатам расчета выбирают наиболее эффективный препарат для назначения больному, а при отрицательном информационном показателе назначают омега-3-полиненасыщенные жирные кислоты.

Кроме того, в качестве информационного показателя используют показатель степени агрегации тромбоцитов-АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов (АДФ-АТ), разовую дозу антиагрегационного агента выбирают в случае снижения АДФ-АТ по сравнению с измеренным без воздействия препарата на 50 и более процентов, а в случае отсутствия эффективного снижения АДФ-AT в качестве дополнительного антиагреганта в виде омега-3-полиненасыщенных жирных кислот используют эйконол.

Тест-система для определения агрегации тромбоцитов является удобной моделью для оценки ингибирования процесса агрегации различными биологически активными соединениями, в том числе, лекарственными препаратами. До сих пор не было попыток внедрить модельные тромбоцитарные тест-системы в каждодневную лабораторную клиническую диагностику с целью индивидуальной оценки воздействия лекарственных средств на функцию тромбоцитов. Это представляется важной задачей, поскольку, несмотря на широкий спектр препаратов с антиагрегантными свойствами. До сих пор остается не ясной эффективность их применения для лечения и профилактики состояний у больных с цереброваскулярной патологией.

Исследования действия препаратов с антиагрегантными свойствами в опытах in vitro с помощью тромбоцитарной тест-системы проведено у 722 больных с цереброваскулярной патологией. Оценивали ингибирующий эффект на агрегацию тромбоцитов ряда препаратов (аспирин, кавинтон, трентал, сермион, вазобрал, БАД-алликор) в сопоставлении степени АДФ-АТ после инкубации с препаратом с параллельной пробой без лекарственного средства. При этом рассматривали как антиагрегантный, так и проагрегантный эффекты препаратов. Соответственно проводился учет частоты встречаемости in vitro резистентности тромбоцитов к воздействию вышеперечисленных препаратов.

Установлено, что у более одной четверти больных эти препараты в дозировках, принятых для однократного приема лекарств, оказываются не только не эффективны, но и оказывают проагрегантный эффект на тромбоциты. В этом случае, а также во всех случаях, когда информационный показатель АДФ-АТ агрегации тромбоцитов по сравнению с измеренным без воздействия препаратов не снижается на 50 или более процентов, или даже, наоборот, повышается, используют омега-3 ПНЖК. Данные соединения с одной стороны, оказывают мягкое антиагрегационное действие на клетки крови пациента, и с другой - способны потенцировать антиагрегационное действие таких лекарственных средств, как аспирин, кавинтон, вазобрал и т.д. Данные результаты открывают новые возможности в антиагрегационной терапии.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

Кровь забирают в пластиковую центрифужную пробирку объемом более 10 мл с 1 мл раствора антикоагулянта (цитрата натрия). Стабилизируют после забора 130 мМ раствором цитрата натрия в отношении 1/9 и медленно перемешивают. Центрифугируют при 200 g (1400 оборотов в минуту) в течение 10 минут для получения богатой тромбоцитами плазмы. Далее 2,5 мл супернатанта отбирают. Оставшуюся кровь центрифугируют при 3000 оборотов в минуту для получения бедной тромбоцитами плазмы, которая используется для разведения богатой тромбоцитами плазмы до фиксированной объемной концентрации тромбоцитов.

Вводят один из антиагрегационных препаратов тест-системы и пробы с препаратами инкубируют при температуре 36,5-37,5^oС в течение 5 минут до проведения измерения. Добавляют индуктор агрегации, в частности АДФ, записывают кривую агрегации тромбоцитов в агрегометре в течение 5 минут. Таким образом измеряют АДФ-АТ в параллельных пробах до введения препарата и после его введения.

Затем в параллельную пробу вводят другой антиагрегационный препарат, пользуясь той же последовательностью операций. Анализируют изменения АДФ-АТ под влиянием препарата в сравнении с пробой без лекарственного средства (контроль). Хороший эффект действия препарата считается при снижении АДФ-AT на 50% и более от контрольной пробы. В данном случае препарат рекомендуется больному.

В случаях отсутствия эффекта или проявления проагрегантного действия нескольких препаратов больным назначают препарат омега-3 ПНЖК. Последний влияет на липидный состав плазмы и мембран клеток крови, оказывает антиагрегационное действие, в частности, это относится и к эйконолу. Последний содержит до 30% омега-3 ПНЖК. Нами установлено, что он cпособствует восстановлению чувствительности тромбоцитов к воздействию антиагрегантов у больных с хронической цереброваскулярной патологией на фоне выраженного атеросклеротического поражения магистральных артерий головы. Это подтверждается тестированием чувствительности тромбоцитов к препаратам до курса лечения и после него. Так, после курса лечения препаратами омега-3 ПНЖК при тестировании эффекта препаратов, таких, как аспирин, кавинтон, трентал, сермион и др. установлено снижение АДФ-AT на 22% (р<0,05).