способ размножения гречихи in vitro с получением селекционно-ценных сомаклонов

Формула изобретения

Способ размножения гречихи in vitro с получением селекционно-ценных сомаклонов, включающий вычленение эксплантов, их культивирование с получением первичной каллусной ткани, индукцию органогенеза и получение растений-регенерантов, отличающийся тем, что в качестве зксплантов используют участки гипокотиля недельных асептических проростков, растения-регенеранты размножают и укореняют делением стебля на микрочеренки на одной питательной среде, переводят растения-регенеранты в нестерильные условия и принудительно переопыляют внутри клона, получают семена сомаклонов, которые размножают на пространственно изолированных участках и оценивают в полевых условиях.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к селекции растений и сельскохозяйственной биотехнологии.

Известен способ размножения гречихи in vitro, включающий, вычленение эксплантов, их культивирование с получением первичной каллусной ткани, индукцию органогенеза и получение растений-регенерантов (см., например, авторское свидетельство СССР №1704715, МПК⁵ А 01 H 4/00, 1992 г.)

Недостатком этого способа размножения гречихи in vitro является:

- трудоемкость вычленения недозрелых зародышей;

- отбор для культивирования зародышей требуемого размера от 0, 5 до 3 мм;

- отсутствие этапа микроразмножения, что может привести к потере регенеранта при высадке в нестерильные условия в случае его гибели или при отсутствии завязывания полноценных плодов;

- не предусматривается селекционная оценка полученных растений-регенерантов в полевых условиях, что ограничивает их применение в прикладных аспектах для селекции гречихи.

Известен также способ размножения гречихи in vitro, включающий, вычленение эксплантов, их культивирование с получением первичной каллусной ткани, индукцию органогенеза и получение растений-регенерантов (см., например, авторское свидетельство СССР №1658928, МПК⁵ А 01 Н 4/00, 1991 г.)

Недостатком данного способа размножения гречихи in vitro является:

- не предусматривается этап дедиференциации экспланта - образование каллусной ткани, общеизвестно, что это не способствует накоплению сомаклональной изменчивости, вызываемой длительным культивированием каллусных клеток на средах с гормональными добавками;

- применение данного способа в качестве микроклонального размножения возможно, но неэффективно, так как среда с препаратом 6-бензиламинопурин (БАП) способствует появлению аномальных форм побегов, снижающих эффективность микроразмножения.

Цель изобретения - увеличение генетического разнообразия растений гречихи, за счет создания качественно нового исходного материала, вовлеченного в сортоулучшение способом сомаклональной селекции.

Указанная цель достигается тем, что способ размножения гречихи in vitro с получением селекционно-ценных сомаклонов, включающий вычленение эксплантов, их культивирование с получением первичной каллусной ткани, индукцию органогенеза и получение растений-регенерантов, при этом в качестве эксплантов используют участки гипокотиля недельных асептических проростков, растения-регенеранты размножают и укореняют делением стебля на микрочеренки на одной питательной среде, переводят растения-регенеранты в нестерильные условия и принудительно переопыляют внутри клона, получают семена сомаклонов, которые размножают на пространственно изолированных участках и оценивают в полевых условиях.

По сравнению с прототипом признаками изобретательского уровня предлагаемого способа размножения гречихи in vitro с получением селекционно-ценных сомаклонов является:

1. "в качестве эксплантов используют участки гипокотиля недельных асептических проростков...", что позволяет:

- получить значительно большее количество каллусных культур, так как с одного асептического проростка можно использовать несколько участков гипокотиля, а с одного зародыша - только одну;

- упростить процесс введения in vitro, так как убирается трудоемкая операция вычленения зародышей определенного размера;

- использовать участки гипокотиля недельных асептических проростков в работе круглый год и не требует дополнительного посева семян для получения незрелых зародышей.

2. "...растения-регенеранты размножают и укореняют делением стебля на микрочеренки на одной питательной среде...", что позволяет:

- экономически более эффективно в течение одного пассажа на одном составе питательной среды получить укорененные растения-регенеранты гречихи, пригодные как для перевода в нестерильные условия, так и для дальнейшего размножения in vitro;

- избежать появления аномальных форм побегов, так как БАП не используется;

- сократить сроки получения растений-регенерантов и ускорить производство семян сомаклонов.

3. "...переводят растения-регенеранты в нестерильные условия и принудительно переопыляют внутри клона, получают семена сомаклонов...", что позволяет:

- закрепить мутации, возникшие в процессе культивирования и способствовать более быстрому выявлению и отбору рецессивно наследуемых признаков;

- упростить и ускорить селекционный процесс, так как он осуществляется в контролируемых условиях.

4. "...размножают на пространственно изолированных участках и оценивают в полевых условия", что позволяет:

- сохранить генетическую чистоту сомаклонов, повысить гомозиготность материала по интересующим селекционно-ценным признакам;

получить достаточный объем семенного материала для последующей оценки;

- отобрать сомаклоны, отличающиеся от исходного сорта по селекционно-ценным признакам;

- ускорить и повысить эффективность селекционной работы, за счет получения нового исходного материала с необходимыми признаками.

Признаки, указанные в отличительной части описания достижения цели доказывают, что заявляемый способ размножения гречихи in vitro с получением селекционно-ценных сомаклонов, обладает новизной. Совокупность признаков, приведенных в сравнении свойств заявляемого и известного решения, дает основание сделать вывод, что заявляемый способ имеет изобретательский уровень.

Предлагаемый способ размножения гречихи in vitro с получением селекционно-ценных сомаклонов осуществляется следующим образом. Зрелые семена перед стерилизацией замачивают на 12 часов в дистиллированной воде, далее их обрабатывают в течение 10 минут в 70%-ном растворе этанола и в течение 10 минут в 10%-ном растворе хлорамина, удаляют околоплодник, помещают на 5 минут в 70%-ный раствор этанола и на 5 минут в 10%-ный раствор хлорамина и не менее трех раз промывают стерильной дистиллированной водой, выдерживая не менее 5 минут в каждой промывке. Помещают таким образом обработанные семена в пробирки с ватно-марлевыми пробками для культивирования на безгормональную среду Мурасиге и Скуга до получения недельных асептических проростков, при условии 16-часового фотопериода и интенсивности освещения от 4 до 5 тыс.люкс, температуре 232С. Гипокотили недельных асептических проростков делят на экспланты размером от 3 до 4 мм. Затем экспланты помещают в пробирки со средой Гамборга В₅, дополненной в мг/л: аскорбиновой кислотой 10,0; гидролизатом казеина 1000; 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (2,4-Д) 5,0; кинетином 0,1; сахарозой 25000; агаром 7000; при водородном показателе (рН), равном от 5,5 до 5,6, и культивируют в течение от 5 до 10 суток в термостате без освещения и температуре, равной 232С, до образования каллусной ткани. Затем пробирки с каллусной тканью помещают в условия 16-часового фотопериода и интенсивности освещения от 4 до 5 тыс.люкс, при температуре 232С на период не менее 25 суток. Далее для поддержания роста каллусной ткани ее культивируют на среде Гамборга В₅, дополненной в мг/л: гидролизатом казеина 1000; 2,4-дихлорфенокси-уксусной кислотой (2,4-Д) 1,0; кинетином 1,0; сахарозой 20000; агаром 7000; при рН от 5,5 до 5,6.

В таблице 1 представлена каллусообразующая способность гипокотиля недельных проростков гречихи в сравнении с прототипом.

Из представленных данных в таблице 1 можно сделать вывод, что экспланты-гипокотили недельных проростков гречихи обладают максимальной каллусообразующей способностью, равной 90,6%.

Для пролиферации органогенных или эмбриоидогенных структур каллусную ткань культивируют на свежей среде Гамборга В₅, дополненной в мг/л: гидролизатом казеина 1000; индолил-3-уксусной кислотой (ИУК) 0,2; БАП 2,0; агаром 7000; при рН от 5,5 до 5,8. Полученные растения-регенеранты размножают и укореняют на среде "А", включающей среду Мурасиге и Скуга, дополненной в мг/л: тиамин-НСl 2,0; пиридоксин-НСl 1,0; гидролизатом казеина 1000; 3-индолилмасляной кислотой (ИМК) 0,2; индолил-3-уксусной кислотой (ИУК) 0,5; сахарозой 20000; агаром 6000; при рН от 5,3 до 6,0 путем деления стебля на микрочеренки длиной от 7 до 15 мм. В течение 25 суток культивирования на данной среде из микрочеренка развивается нормально сформированное растение-регенерант гречихи с корневой системой, который готов к пересадке в нестерильные условия или использованию к дальнейшему размножению в культуре in vitro. В таблице 2 представлены результаты микроразмножения растений-регенерантов гречихи в течение 25 суток на используемых средах.

Из представленных данных в таблице 2 видно, что применение среды "А" наиболее эффективно для получения растений-регенерантов с корневой системой и достигает 66,7%.

Перед высадкой в нестерильные контролируемые условия культуральной комнаты с пробирок удаляют ватно-марлевые пробки и располагают пробирки с растениями-регенерантами в горизонтальном положении в течение 5 суток при освещенности 5 тыс.люкс, далее растения-регенеранты высаживают в сосуды с субстратом: почва-торф-песок (4:1:1). После высадки создают условия повышенной влажности в сосуде с помощью полиэтиленовых укрытий, которые снимают после акклиматизации растений к обычной влажности воздуха. Растения-регенеранты развиваются, а в фазе цветения их принудительно переопыляют внутри одного клона. Полученные семена сомаклонов высевают на пространственно изолированных участках для размножения. Размноженные семена сомаклонов высевают далее в селекционных питомниках и производят следующие учеты и наблюдения: фенологические; оценку всходов и состояние растений перед уборкой; оценку устойчивости к полеганию; определяют основные количественные признаки гречихи: высота растения, толщина первого междоузлия, длина первого междоузлия, число узлов на главном стебле, число ветвей первого, второго порядка, число соцветий с плодами, число соцветий без плодов, высота прикрепления первого соцветия, продуктивность растения, массу 1000 зерен, пленчатость, выход крупы, содержание белка, жира, рутина. Оценивают экологическую пластичность по показателю продуктивности растения. Наличие сомаклональной изменчивости признаков устанавливают после статистической обработки данных в сравнении с исходным сортом. В таблице 3 приведены данные по изменчивости количественных признаков у сомаклонов гречихи сорта "Приморская местная".

Из представленных данных таблицы 3 видно, что сомаклоны по приведенным признакам превышают значения показателей исходных форм.

Потомство сомаклонов имеет различную степень экологической пластичности по признаку продуктивности одного растения.

Из представленных данных в таблице 4. видно, что значение показателя экологической пластичности у разных сомаклонов различны и отличимы от исходного сорта.

Отмечаются проявления изменчивости окраски и формы плодов сомаклонов гречихи в сравнении с исходным сортом.

В селекционном питомнике, начиная со второго поколения проводят индивидуальные и индивидуально-семейные отборы с целью закрепления желаемых признаков.

В результате выделены три лучшие сомаклональные линии гречихи, которые испытали в контрольном питомнике, таблица 5.

Применение предлагаемого изобретения позволит увеличить генетическое разнообразие растений гречихи, за счет создания качественно нового исходного материала, вовлеченного в сортоулучшение способом сомаклональной селекции.