способ оценки изменения состояния мембран эритроцитов

Формула изобретения

Способ оценки изменения состояния мембран эритроцитов, включающий выделение эритроцитов из крови и регистрацию их агрегации, отличающийся тем, что в качестве индуктора агрегации используют пикриновую кислоту, при этом эритроциты помещают в кювету агрегометра, добавляют пикриновую кислоту до конечной концентрации 3-5 мМ, об изменении состояния мембран эритроцитов судят по степени их агрегации в сравнении с контрольными.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для оценки изменений состояния мембран эритроцитов при хранении крови и анемиях различного генеза.

В настоящее время нет единого универсального метода, позволяющего адекватно оценивать изменения состояния мембран эритроцитов. Обычно используют несколько методов в совокупности.

Известны способы оценки состояния мембран эритроцитов, включающие определение осмотической хрупкости, кислотной устойчивости, концентрации внутриклеточной АТФ, K⁺, Na⁺, Cа²⁺ (Стусь Л.К. и др. Гематология и трансфузиология - 1988. T.33. N4. С.44-48).

Известен способ оценки состояния мембран эритроцитов, взятый за прототип (Hessel Е., Lerche D. Vox.Sang - 1985. V.49. N.2. P.86-91), включающий выделение эритроцитов из крови, определение степени их агрегации, вызванной одновременным снижением ионной силы и рН инкубационной среды. О состоянии мембран эритроцитов судят по агрегатограмме, которая строится графически по точкам индекса агрегации, определяемым визуально под микроскопом, путем подсчета клеток, входящих в агрегаты.

Однако способ трудоемок и занимает длительное время, т.к. процесс агрегации эритроцитов длится 30-40 мин.

Задача создания несложного и достаточно быстрого по исполнению способа оценки изменений состояния мембран эритроцитов является актуальной.

Задача достигается способом, который заключается в том, что эритроциты выделяют из крови, помещают в кювету агрегометра, куда в качестве агента, вызывающего агрегацию эритроцитов, добавляют пикриновую кислоту до конечной концентрации 3-5 мМ. Процесс агрегации регистрируется фотоколориметрически с записью на самописце в виде агрегатограммы. Об изменении состояния мембран эритроцитов судят по степени их агрегации в сравнении с контрольными.

Способ позволяет сократить время исследований за счет использования пикриновой кислоты, при которой процесс агрегации идет быстрее (1,5-2,0 мин), чем в способе, взятом за прототип, и регистрировать изменения состояния мембран при воздействии на них как внешних, так и внутренних факторов.

Способ осуществляется следующим образом.

Эритроциты трижды отмывают от плазмы и белых клеток крови центрифугированием в 10-кратном объеме физиологического раствора. Отмытые эритроциты ресуспензируют в соотношении 1:200 в забуференном физиологическом растворе (10 мМ трис-НСl,146 мМ NaCl, pH 7,4), после чего суспензию клеток помещают в кювету для изучения агрегации и добавляют пикриновую кислоту до конечной концентрации 3-5 мМ. Регистрацию агрегации осуществляют фотометрическим методом (Шереметьев Ю.А. и др. Биофизика - 2000. Т.45. №1. С.79-82). Пикриновую кислоту готовят на физиологическом растворе. После добавления пикриновой кислоты pH среды снижается с 7,4 до значений 1,5-2,0.

В концентрации 3-5 мМ пикриновая кислота является сильным эхиноцитным агентом (Meiselman H.J. - Biorheology. 1978. 1978. V.5. N.3-4. P.225-238). При концентрации ниже 3 мМ изменение формы эритроцитов меньше выражено и поэтому меньше агрегация клеток. При концентрациях пикриновой кислоты выше 5 мМ наблюдается сильное изменение формы эритроцитов, с появлением сфероцитов. Это также снижает степень агрегации эритроцитов.

С целью изменения состояния мембран отмытые эритроциты подвергали различной предварительной обработке. Для этого эритроциты обрабатывали глутаровым альдегидом, инкубировали при 50С, проводили снижение внутриклеточного уровня АТФ.

Пример 1. Оценка изменений состояния мембран эритроцитов, обработанных глутаровым альдегидом.

Фиксацию эритроцитов проводили в 0,1% забуференном растворе глутарового альдегида в течение 1 ч. После фиксации эритроциты трижды отмывали физиологическим раствором и исследовали на агрегацию. На чертеже приведена агрегатограмма нормальных (1) и фиксированных (2) эритроцитов, анализируя которую можно сделать вывод о сильных изменениях состояния мембран после обработки глутаровым альдегидом.

Пример 2. Оценка изменений состояния мембран после инкубации эритроцитов при 50С.

Суспензию эритроцитов инкубировали при 50С в течение 15 мин. Затем суспензию охлаждали до комнатной температуры. Анализ агрегатограммы (чертеж) показывает существенные изменения состояния мембран эритроцитов после их инкубации при 50С (3) относительно нормальных (1).

Пример 3. Оценка изменений состояния мембран АТФ-истощенных эритроцитов.

Снижение уровня АТФ в эритроцитах получали инкубацией клеток в забуференном физиологическом растворе в течение 20 ч.

Уровень внутриклеточного АТФ контролировали ферментативным методом и он составлял 30% от уровня нормальных клеток. Анализ агрегатограммы показывает существенные изменения состояния мембран АТФ-истощенных эритроцитов (4) относительно нормальных (1).

Приведенные примеры показывают возможности применения способа оценки изменений состояния мембран эритроцитов и его преимущества перед прототипом (время определения сокращается с 40 мин в прототипе до 2 мин на проведение и оценку агрегации в предлагаемом способе).