способ диагностики рефлюкс-нефропатии

Формула изобретения

Способ диагностики рефлюкс-нефропатии у детей с хроническим пиелонефритом на фоне пузырно-мочеточечникового рефлюкса, включающий иммуноферментный анализ суточной мочи на содержание цитокинов, отличающийся тем, что определяют содержание интерлейкина-8 (ИЛ-8), интерлейкина-10 (ИЛ-10) и фактора некроза опухоли альфа (ФНО-) при первичном обследовании и через 6 месяцев и при уменьшении содержания ИЛ-10 более чем в 1,3 раза и повышении содержания ФНО- более чем в 1,4 раза по сравнению с первоначальным значением на фоне постоянной концентрации ИЛ-8 диагностируют рефлюкс-нефропатию у больных с пузырно-мочеточечниковым рефлюксом.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к способам диагностики рефлюкс-нефропатии (РН), и может быть использовано в нефроурологии и педиатрии для раннего выявления формирования нефросклероза у больных с пузырно-мочеточниковым рефлюксом.

Одно из ведущих мест в структуре нефропатий у детей и взрослых принадлежит пиелонефриту, частой причиной которого является пузырно-мочеточниковый рефлюкс (ПМР) (Папаян А., Савенкова Н.// Клиническая нефрология детского возраста.- С.-Петербург, СОТИС, 1997, с.458-532). Нарушение уродинамики в сочетании с инфицированием мочи, в результате чего возникает воспалительный процесс в почках, приводит к деструкции паренхимы органа и сморщиванию почки, т.е. развитию рефлюкс-нефропатии (Dillon M., Chulananda G.ll Reflux Nephropathy, JASN 1998, 9, р.2377-83).

Известен способ диагностики РН, основанный на рентгенологической оценке степени поражения функционирующей паренхимы.

Для оценки анатомо-функционального состояния почек внутривенно вводят рентгеноконтрастные йодсодержащие вещества. После введения указанных препаратов производится серия рентгеновских снимков, по которым судят о степени и распространенности поражения паренхимы почек (Рентгенодиагностика в медицине// Руководство для врачей в 2-х томах под ред. Босина В.Ф. и Филиппкина М.А., M.: Медицина, 1998, т.2, с.13-46).

Известен способ радиологической диагностики РН, заключающийся во внутривенном введении больному радиофармпрепарата, меченного радиоактивным технецием (изотоп m-99), и последующем подсчете радиоактивности ткани почки гамма-камерой, сопряженной с компьютером. На основании интенсивности и равномерности накопления радиофармпрепарата почкой судят о степени и распространенности поражения органа (Piepzs A.// Radionuclide studies in paediatric nephrourology, Europ Journal ofRadiol 2002, 43, р. 146-153).

Недостатками этих способов (особенно при выполнении экскреторной урографии) являются инвазивность и значительная лучевая нагрузка на человека, в частности на растущий организм ребенка. Эти недостатки не позволяют использовать указанные диагностические процедуры для длительного динамического наблюдения за функциональным состоянием почек.

Известен способ диагностики РН путем ультразвукового сканирования почек с цветной допплерографией почечных сосудов. При РН отмечается уменьшение размеров почек, фрагментарное истончение почечной паренхимы, нарушение кортико-медуллярной дифференцировки и деформация контура почки. Определяется неравномерное повышение эхогенности паренхимы, преимущественно в зоне ее истончения. В этих же местах выявляется обеднение интраренального сосудистого рисунка. Обнаруженные изменения почечной ткани расцениваются как рефлюкс-нефропатия (Ольхова Е.Б., Крылова Е.М., Ефремова И.И. Возможности ультразвуковой оценки состояния почек при рефлюкс-нефропатии у детей, Эхография; 2001, т.2, 1, 61-7).

Недостатком этого способа является значительная доля субъективизма при интерпретации полученных данных и малая чувствительность у больных с большой массой тела. Это затрудняет обследование лиц подросткового возраста и взрослых.

Установлено участие ряда цитокинов в развитии нефропатий у детей (Rovin B.//Chemokines as therapeutic targets in renal inflammation.-Am J Kidney Dis 1999;34(4), p.761-767).

Цитокины представляют собой биологически активные соединения, способствующие возникновению воспалительной реакции, влияющие на процессы клеточной пролиферации и осуществляющие эндогенную иммунорегуляцию. Наиболее значимыми являются интерлейкины (ИЛ): ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10 и фактор некроза опухоли- (ФНО-).

ИЛ-8 представляет собой низкомолекулярный цитокин воспаления, принадлежит к семейству хемокинов и продуцируется под воздействием бактериальных эндотоксинов и цитокинов, в основном, ФНО- и ИЛ-1. Он активирует нейтрофилы и моноциты, вызывает их хемотаксис в очаг воспаления.

ИЛ-10 относится к группе противовоспалительных факторов и может рассматриваться как антагонист ряда цитокинов. Подавляет секрецию активированными моноцитами ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-.

ФНО- (лимфотоксин) представляет собой полипептид, продуцируемый моноцитами/макрофагами, эндотелием, в особых случаях - активированными Т-лимфоцитами. Оказывает цитотоксическое, иммуномодулирующее и противовоспалительное действие. В результате высвобождения ФНО- повышается проницаемость капилляров, повреждается эндотелий сосудов и возникает внутрисосудистый тромбоз.

Для оценки выраженности воспалительной реакции и интенсивности процессов клеточной пролиферации особую ценность представляют методы комплексного определения способности клеток продуцировать про- и противовоспалительные цитокины.

Известен способ диагностики пиелонефрита у детей путем определения в моче интерлейкина-6 и фактора некроза опухоли -. Иммуноферментным методом больным в дебюте заболевания и через б недель после него определяли концентрацию в моче указанных биологически активных соединений. Стандартизованные по креатинину мочи показатели сравнивались с таковыми у больных с лихорадкой другого происхождения и у здоровых детей. При этом было выявлено достоверное повышение содержания цитокинов в моче в острой фазе процесса (Tullus К. et al.//Soluble receptors to tumor necrosis factor and interleukine-6 in urine during acute pyelonephritis.-Acta Paediatr 1997; 86:1198-1202). Однако при этом не изучался комплекс взаимосвязанных про- и противовоспалительных интерлейкинов в динамике развития процесса в почечной паренхиме. В исследование не были включены дети с нарушениями уродинамики. Кроме этого, указанный интервал между первым и вторым обследованием не достаточен для начала процесса сморщивания почек.

Учитывая вышесказанное, данный способ не может быть использован для диагностики РН.

Задачей данного изобретения является разработка неинвазивного информативного способа ранней диагностики рефлюкс-нефропатии у больных до появления рентгенологических, радиологических и эхографических признаков поражения почек.

Поставленная задача достигается тем, что определяют содержание ИЛ-8, ИЛ-10 и ФНО- в суточной моче дважды: при первичном обследовании (при дебюте заболевания) и через 6 месяцев. При этом снижение содержания интерлейкина-10 более чем в 1,3 раза, повышение содержания ФНО- более чем в 1,4 раза по сравнению с первоначальным значением на фоне постоянной величины ИЛ-8 свидетельствуют о развитии рефлюкс-нефропатии у больных с пузырно-мочеточниковым рефлюксом.

Существенным отличием заявляемого способа от известных является то, что в качестве диагностического критерия используется степень изменений провоспалительных и противоспалительных интерлейкинов и фактора некроза опухоли, указывающих на развитие склеротических процессов в почечной паренхиме вследствие дисбаланса этих регуляторов.

В качестве исследуемого материала используют суточную мочу, в которой иммуноферментным методом определяют содержания ИЛ-8, ИЛ-10 и ФНО-.

Способ осуществляется следующим образом.

Сбор мочи проводится на общем режиме в течение суток; забор образцов, по 15 мл каждый, осуществляется из общего объема после измерения суточного диуреза. Образцы мочи хранятся при -20°С до проведения анализа.

Для измерения уровней изучаемых цитокинов использовались наборы для иммуноферментного анализа: “CYTELISA- IL-8”, “CYTELISA- IL-10” и “CYTELISA- TNF-” (CYTIMMUNE, USA). Применение их основано на “сэндвич”-методе твердофазного энзимсвязанного иммуносорбентного анализа (ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay), принцип которого заключается в качественном и количественном определении изучаемого антигена путем его послойного связывания со специфичными к нему моноклональными антителами, фиксированными на поверхности лунок 96-местной планшетки. После добавления к ним изучаемых образцов или стандартов исследуемый антиген связывается с иммобилизованными антителами. После удаления методом отмывания не связавшихся протеинов в лунки добавляются поликлональные антитела, связанные с энзимом. Они наслаиваются на иммобилизованный в ходе первой инкубации антиген по принципу “сэндвича”. После этого их излишек отмывается и в лунки добавляется раствор хромогенного субстрата, который, прореагировав с энзимом, дает характерное окрашивание. По интенсивности последнего оценивается содержание в пробе исследуемого антигена.

Примеры осуществления.

Нами обследовано 123 больных в возрасте от 3 до 14 лет с хроническим пиелонефритом на фоне пузырно-мочеточникового рефлюкса (ПМР). Все дети находились в стадии клинико-лабораторной ремиссии воспалительного процесса в почках, не страдали артериальной гипертензией и нарушением почечных функций.

Наряду с рентгенологическим обследованием детям проводилась ультразвуковая оценка состояния паренхимы почек и внутрипочечной гемодинамики.

Больные были распределены на 3 группы. В первую (n=94) вошли дети с хроническим вторичным пиелонефритом на фоне пузырно-мочеточникового рефлюкса без рентгенологических и ультразвуковых признаков нефросклероза. 2-ю группу составили пациенты с хроническим вторичным пиелонефритом на фоне пузырно-мочеточникового рефлюкса и эхографическими признаками рефлюкс-нефропатии (n=12). В 3-ю группу были объединены дети с хроническим вторичным пиелонефритом на фоне пузырно-мочеточникового рефлюкса и рентгенологическими проявлениями нефросклероза (n=17).

Больные трех групп получали регулярное противорецидивное лечение уросептиками по поводу хронического пиелонефрита и курсы физиотерапии на область мочевого пузыря и мочеточников. В момент обострения пиелонефрита назначались антибактериальные препараты, в большинстве случаев согласно результатам исследования чувствительности микрофлоры мочи к антибиотикам.

В группу сравнения (n=10) вошли больные хроническим пиелонефритом без нарушения уродинамики.

Всем детям в динамике (в начале курса лечения и через 6 месяцев) проводилось определение суточной экскреции с мочой интерлейкинов: ИЛ-8, ИЛ-10 и фактора некроза опухоли- (ФНО-).

Проведенные исследования показали, что у всех больных отмечалось значительное повышение экскреции с мочой ИЛ-8, ИЛ-10 и ФНО- по сравнению с показателями в группе сравнения (р<0,05). Через 6 месяцев у больных с ПМР выявлено нарастание концентрации ФНО- в суточной моче (в 1,4 раза и более, р<0,01), независимое от наличия или отсутствия эхографических и рентгенологических признаков формирования рефлюкс-нефропатии при постоянном уровне ИЛ-8. Однако исследования противовоспалительного интерлейкина ИЛ-10 выявили отчетливую однотипность изменений его содержания у детей 2 и 3 групп: через 6 месяцев после первого исследования: у больных с рентгенологическими и ультразвуковыми признаками рефлюкс-нефропатии было установлено достоверное (в 1,3 раза и более, р<0,05) снижение концентрации ИЛ-10 в суточной моче, в то время как у пациентов 1 группы экскреция его значительно возрастала.

Результаты проведенных исследований представлены в табл.1-3.

При контрольном ультразвуковом обследовании больных 2-й группы сохранялись эхографические признаки рефлюкс-нефропатии. Рентгеноурологическое исследование состояния почечной паренхимы у детей с ранее выявленным нефросклерозом указывало на наличие очагов деструкции в почках.

Таким образом, однонаправленное выраженное снижение суточной экскреции с мочой противовоспалительного ИЛ-10 у больных 2 и 3-й групп при отсутствии существенных изменений концентраций ИЛ-8 и повышении содержания в моче ФНО- у детей с эхографическими признаками поражения почек свидетельствует о формировании очагов инфильтрации в почечной паренхиме с последующим склерозированием и может быть использовано в качестве раннего диагностического критерия развития рефлюкс-нефропатии при пузырно-мочеточниковом рефлюксе.

Клинические примеры.

Ира Р., 5 лет (история болезни 18039-01), поступила в нефрологическое отделение Московской детской клинической больницы (МДКБ) с диагнозом: правосторонний смешанный пузырно-мочеточниковый рефлюкс 2-3 степени, хронический вторичный пиелонефрит, катарально-гранулярный цистит. Обследована впервые в связи с повышением температуры, болями в животе, амбулаторно-патологической лейкоцитурией. На урограммах признаков формирования очагов нефросклероза не выявлено. Однако при ультразвуковом исследовании обнаружены изменения эхографической структуры почек и интраренального кровотока, характерные для рефлюкс-нефропатии. При первом определении суточной экскреции с мочой цитокинов было выявлено повышение всех показателей по сравнению с контролем (ФНО--340,0 пг/мл, ИЛ-8 - 523,4 пг/мл, ИЛ-10 - 122,3 пг/мл).

Через 6 мес уровень ФНО-- увеличился в 1,7 раз (до 590 пг/мл), ИЛ-8 существенно не изменился (509,6 пг/мл), а ИЛ-10 значительно (в 2,9 раза) снизился (42,5 пг/мл). При контрольном ультразвуковом обследовании эхографические признаки рефлюкс-нефропатии сохранялись. Таким образом, снижение суточной экскреции ИЛ-10 при повышении ФНО- и отсутствии значимых изменений ИЛ-8 свидетельствуют о начальных этапах развития рефлюкс-нефропатии у больной без рентгенологических признаков поражения почечной паренхимы.

Таня Ш, 9 лет (история болезни 19704-01), поступила в нефрологическое отделение МДКБ с диагнозом: левосторонний смешанный пузырно-мочеточниковый рефлюкс 2-3 степени, хронический вторичный пиелонефрит, катаральный цистит. На протяжении последних лет получала противорецидивную терапию пиелонефрита, целенаправленное лечение цистита и антирефлюксную терапию. Рентгенологическое обследование не выявило признаков поражения почечной паренхимы, однако при ультразвуковом сканировании почек были обнаружены очаги неравномерного повышения эхогенности паренхимы с обеднением интраренального сосудистого рисунка в этих же местах. При первом определении суточной экскреции с мочой цитокинов было выявлено повышение всех показателей по сравнению с контролем (ФНО- - 310,0 пг/мл, ИЛ-8 - 587,4 пг/мл, ИЛ-10 - 92,8 пг/мл). Через 6 мес. уровень ФНО--увеличился в 1,6 раз (до 497,2 пг/мл), содержание ИЛ-8 существенно не изменилось (559,3 пг/мл), а ИЛ-10 уменьшилось в 1,7 раза (до 52,5 пг/мл). При контрольном ультразвуковом обследовании эхографические признаки рефлюкс-нефропатии сохранялись. На урограммах появились признаки очагового нефросклероза слева. Таким образом, выявленные закономерности изменений содержания изученных цитокинов у данной больной подтверждают развитие рефлюкс-нефропатии.

Диана И, 9 лет (история болезни 21652-00), поступила в нефрологическое отделение МДКБ с диагнозом: правосторонний смешанный пузырно-мочеточниковый рефлюкс 2 степени, хронический вторичный пиелонефрит, правосторонняя рефлюкс-нефропатия, катарально-гранулярный цистит. Из анамнеза известно, что девочка с 5 лет страдает хроническим вторичным пиелонефритом на фоне нарушения уродинамики 3 степени. Получила несколько курсов антирефлюксной терапии. При этом степень рефлюкса уменьшилась, однако рентгенологически выявлен очаговый нефросклероз справа. Реноиндекс правой почки составляет 32%. Определение суточной экскреции с мочой цитокинов выявило определенную динамику изменения показателей: через 6 мес после первого исследования уровень ФНО- увеличился с 580 до 630 пг/ мл. Концентрация ИЛ-8 в моче существенно не изменилась (537,7 и 496,4 пг/мл). Однако суточная экскреция ИЛ-10 уменьшилась почти в 5 раз (с 51,7 до 11,3 пг/мл). Следовательно, у этой больной динамика содержания цитокинов в моче соответствуют изменениям почек на урограммах и указывает на формирование нефросклероза, несмотря на уменьшение степени пузырно-мочеточникового рефлюкса.

Таким образом, установленные закономерности изменений динамики содержания провоспалительных и противовоспалительных цитокинов у больных с пузырно-мочеточниковым рефлюксом могут быть использованы в качестве раннего диагностического критерия развития и прогрессирования рефлюкс-нефропатии. Это позволяет оценивать эффективность лечения пузырно-мочеточникового рефлюкса, своевременность его коррекции и необходимо для профилактики нарушений функционального состояния почек при данной патологии, что также поможет определить тактику лечения и наблюдения больных с нарушениями уродинамики в анамнезе.

Кроме этого, способ не требует инвазивных методов получения биологического материала и не оказывает лучевой нагрузки на больного, что позволяет осуществлять динамическое наблюдение за состоянием почечной паренхимы.

Внедрение в практическое здравоохранение указанного способа ранней диагностики рефлюкс-нефропатии у детей и адекватное лечение больных с хроническим пиелонефритом на фоне пузырно-мочеточникового рефлюкса позволяют ускорить ремиссию и сократить сроки пребывания больных в стационаре в связи с обострением основного процесса, а также уменьшить число осложнений, требующих коррекции. Предупреждение развития и замедление темпов прогрессирования нефросклероза у больных детей поможет уменьшить риск развития состояний, приводящих к нетрудоспособности в старшем возрасте.