способ получения флуоресцирующего антивидового конъюгата против ig g человека или животного для реакции непрямой иммунофлуоресценции

Формула изобретения

Способ получения антивидового флуоресцирующего конъюгата для реакции непрямой иммунофлуоресценции, включающий получение иммунной сыворотки крови продуцента, выделение из нее специфических иммуноглобулинов, конъюгацию с ФИТЦ с последующей очисткой от несвязавшегося ФИТЦ с помощью сефадекса G-50 и лиофилизацию, отличающийся тем, что проводят гипериммунизацию лошади иммуноглобулином G человека или другого животного, очищенным с помощью ионобменной хроматографии, отделяют сыворотку, проводят ферментолиз, затем смешивают со специфическим иммуносорбентом при постоянном перемешивании в течение 30±5 мин и температуре воздуха 22±2°С и полученные F(аb)₂ фрагменты иммуноглобулинов против IgG человека или другого животного конъюгируют с ФИТЦ из расчета 30 мг ФИТЦ на 1 г белка при постоянном перемешивании в течение 19±1 час и при температуре 2-8°С.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к области биотехнологии диагностических препаратов, и может быть использовано при производстве медицинских иммунобиологических препаратов, предназначенных для выявления специфических антител и антигенов в биологических субстратах.

Известен способ приготовления антител диагностических против Ig G (H+L) человека, животных и птиц, меченных пероксидазой хрена, полученных на основе иммуноглобулиновой фракции, выделенной из антисывороток, иммунизированных кроликов, баранов или коз фракцией Ig G, приготовленной из соответствующей нормальной сыворотки человека, кролика, мыши, лошади, барана, быка, собаки, морской свинки, крысы, козы, осла, свиньи, кошки, хомячка или курицы. Иммуноглобулиновую фракцию ковалентно связывают с ферментом - пероксидазой хрена, стабилизируют лиофильным высушиванием (ФС 42-3818-98) Антитела диагностические, против Ig G (H+L) человека, животных и птиц, меченные пероксидазой, сухие (антивидовые конъюгаты). Данный способ приготовления антивидового конъюгата предназначается и используется для проведения иммуноферментного анализа.

Недостатком является то, что данный способ требует большого количества животных, не позволяет получать исходное сырье в больших объемах.

Известен способ приготовления иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих антивидовых против иммуноглобулинов человека или другого животного на основе специфических иммуноглобулинов, выделенных методом солевого осаждения сернокислым аммонием из сывороток кроликов, ослов, баранов, иммунизированных Ig человека или другого животного, затем конъюгированных с флуоресцеин-5-изотиоцианатом и стабилизированных лиофильным высушиванием (Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие антивидовые против иммуноглобулинов человека и различных животных (обезьяны, лошади, барана, быка, осла, козы, свиньи, кролика, крысы, морской свинки, хомяка, мыши, собаки, кошки, курицы), сухие ФС 42-417 ВС-93).

Недостатком является то, что данный метод приготовления не обеспечивает достаточно высокой чувствительности и специфичности получаемых препаратов, требует большого количества животных, не позволяет получить исходное сырье в больших объемах.

Техническим результатом изобретения является повышение чувствительности и специфичности антивидового флуоресцирующего конъюгата для реакции непрямой иммунофлуоресценции и увеличение объемов получаемой иммунной сыворотки.

Сущность изобретения заключается в том, что гипериммунизацию лошади проводят Ig G человека или другого животного, очищенным с помощью ионообменной хроматографии, отделяют сыворотку, проводят ферментолиз, затем смешивают со специфическим иммуносорбентом при постоянном перемешивании в течение 30±5 мин и температуре воздуха 22±2°С и полученные F(аb)₂-фрагменты иммуноглобулинов против Ig G человека или другого животного конъюгируют с ФИТЦ из расчета 30 мг ФИТЦ на 1 г белка при постоянном перемешивании в течение 19±1 час и при температуре от 2 до 8°С.

Причинно-следственная связь между существенными признаками и техническим результатом заключается в следующем.

Гипериммунизация лошади Ig G человека или другого животного, очищенным с помощью ионообменной хроматографии, обеспечивает получение большего объема крови, чем у кролика в 266 раз, у осла в 2,6 раза, у барана в 8 раз, что позволяет значительно увеличить объем получаемой иммунной сыворотки. Использование для конъюгации аффинно-очищенных F(аb)₂-фрагментов иммуноглобулинов против Ig G человека или другого животного, приготовленных из ферментированной иммунной сыворотки с применением специфического иммуносорбента, позволяет повысить активность и специфичность антивидового конъюгата за счет исключения неспецифической Fc-рецепции и значительно снизить свечение фона при проведении реакции.

ПРИМЕР 1. Ig G человека получали из нормальной сыворотки крови человека методом спиртового осаждения по Кону, затем выделенную фракцию подвергали очистке методом ионообменной хроматографии на сефадексе ДЕАЕ А-50. Полученный Ig G смешивали с гелем гидрооксида алюминия в соотношении 1:1 и использовали для гипериммунизации лошадей. Для создания грунд - иммунитета вводили 20 мг белка подкожно в область шеи, через 30 дней - 200 мг белка внутримышечно в две точки крупа. На 7-11-е сутки после последней инъекции у лошади проводили забор крови, контролировали накопление в сыворотке специфических антител в реакции преципитации. При уровне специфических титров антител в сыворотке крови лошади, выявляемых в реакции преципитации, 1:16 и выше, проводили забор крови у лошади в количестве 7-8 л, через сутки повторно 5-7 л. Сыворотку отделяли, подвергали ферментолизу пепсином при рН 3,2±0,05, при температуре 22±2°С в течение 30 мин и последующей сорбции - элюции на специфическом иммуносорбенте, в котором в качестве инертного носителя использовали цианбромированную сефарозу 4В, а специфическим лигандом служил Ig G человека, очищенный ионообменной хроматографией на сефадексе ДЕАЕ А-50 batch-методом.

Ферментированную гипериммунную сыворотку лошади против Ig G человека смешивали со специфическим иммуносорбентом при постоянном перемешивании в течение 30±5 мин и температуре воздуха (22±2)°С, затем истощенный ферментат отделяли от иммуносорбента на воронке Бюхнера. Аффинно-очищенные F(аb) ₂-фрагменты иммуноглобулинов элюировали и конъюгировали с ФИТЦ из расчета 30 мг ФИТЦ на 1 г белка. Конъюгацию вели при постоянном перемешивании в течение (19±1) час при температуре от 2 до 8°С. Полученный препарат освобождали от несвязавшегося ФИТЦ на колонке с сефадексом G-50, элюирующим раствором служил фосфатный солевой буферный раствор рН 7,2±0,2, затем препарат разливали в ампулы по 0,5 мл и лиофилизировали в сублимационных установках. Рабочий вакуум в течение цикла должен быть не более 13,33 Па. Температура конденсатора в начале высушивания - не выше минус 50°С, в течение цикла - не выше минус 47°С. Начальная температура материала в период сублимации - минус (45±10)°С. Конечная температура досушивания (20±2)°С. По окончании процесса высушивания кассеты с препаратом немедленно закрывали крышками, помещали в эксикатор с сухим силикагелем и герметизировали запайкой.

Препарат использовали в постановке реакции непрямой иммунофлуоресценции в качестве манифестирующего реагента для выявления иммуноглобулинов класса G человека при определении специфических антител в сыворотках и идентификации антигенов различной природы в биологических субстратах.

ПРИМЕР 2. Получение антивидового флуоресцирующего конъюгата против Ig G барана. Способ осуществляли так, как указано в примере 1, но в качестве иммуногена использовали очищенный Ig G барана, а аффинно-очищенные F(аb)₂-фрагменты иммуноглобулинов против Ig G барана получали на иммуносорбенте со специфическим лигандом - очищенным иммуноглобулином барана.

ПРИМЕР 3. Получение антивидового флуоресцирующего конъюгата против Ig G кролика. Способ осуществляли так, как указано в примере 1, но в качестве исходного материала использовали аффинно-очищенные F(аb)₂-фрагменты иммуноглобулинов против Ig G кролика, ферментированные, аффинно-очищенные на иммуносорбенте, выделенные из антисывороток, полученных при иммунизации лошадей нормальным Ig G кролика, а в качестве лиганда для специфического иммуносорбента - очищенный гамма-глобулин кролика.

ПРИМЕР 4. Получение антивидового флуоресцирующего конъюгата против Ig G морской свинки. Способ осуществляли так, как указано в примере 1, но в качестве иммуногена использовали очищенный Ig G морской свинки, а аффинно-очищенные F(аb)₂-фрагменты иммуноглобулинов против Ig G морской свинки получали на иммуносорбенте со специфическим лигандом - очищенным иммуноглобулином морской свинки.

Сравнительная оценка практического выхода иммунной сыворотки в зависимости от вида продуцента представлена в таблице 1. Как видно из материалов таблицы 1, использование лошадей как продуцентов иммунной сыворотки обеспечивает получение большего объема крови, чем у кролика в 266 раз, у осла в 2,6 раза, у барана в 8 раз, позволяет значительно увеличить объем получаемой иммунной сыворотки.

Оценку специфичности и чувствительности антивидового флуоресцирующего конъюгата на основе аффинно-очищенных F(аb)₂-фрагментов иммуноглобулинов против Ig G человека или другого животного проводили в РНИФ в сравнении с антивидовым конъюгатом, приготовленным на основе иммуноглобулиновой фракции с использованием сывороток больных различными формами хламидиозов, сифилиса, в качестве тест-антигенов использовали тканевую культуру Treponema pallidum, овокультуры C.psittaci, C.trachomatis, C.pecomm, a также соскобы из цервикса и уретры больных урогенитальными формами хламидийной инфекции (таблица 2). Данные, представленные в таблице 2, свидетельствуют о наиболее высокой интенсивности специфического свечения конъюгата, приготовленного на основе аффинно-очищенных F(аb)₂ -фрагментов иммуноглобулинов против Ig G человека или другого животного при отсутствии неспецифического свечения фона.

Предложенный способ позволил повысить чувствительность и специфичность антивидового флуоресцирующего конъюгата для реакции непрямой иммунофлуоресценции, увеличить объем получаемой исходной иммунной сыворотки и тем самым обеспечить экономичность производства и улучшение качества целевого продукта.