набор для количественного определения общего простатспецифического антигена в сыворотке крови человека методом одностадийного твердофазного иммуноферментного анализа

Формула изобретения

Набор реагентов для количественного определения простатспецифического антигена в сыворотке крови, содержащий носитель с иммобилизованными первыми моноклональными антителами, конъюгат вторых мышиных моноклональных антител с пероксидазой, калибровочные пробы ПСА (0; 2,5; 5,0; 10,0 и 30,0 нг/мл ПСА) в трис-буфере с 1%-ным бычьим сывороточным альбумином, отличающийся тем, что в качестве первых антител используют мышиные моноклональные антитела, продуцируемые штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus L №РККК(П)660Д, а в качестве вторых антител используют мышиные моноклональные антитела, продуцируемые штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus L №РККК(П)661Д, реакция идет в одну стадию с 1 ч инкубацией и детекция может проводиться на любом фотометре вертикального сканирования.

Описание изобретения к патенту

Набор предназначен для количественного определения концентрации общего специфического антигена предстательной железы (ПСА) в сыворотке крови. Результаты определения содержания ПСА в сыворотке используются в клинической практике для скрининга и контроля за лечением заболеваний простаты, для прогноза развития рака предстательной железы.

Набор содержит планшет с иммобилизованными моноклональными антителами, шесть калибровочных проб ( содержащих 0; 1; 2,5; 5; 10 и 30 нг/мл (ПСА), конъюгат мышиных моноклональных антител с пероксидазой хрена, реагенты для энзиматической реакции (краситель тетраметилбензидин, цитратный буфер с перекисью водорода и стоп-реагент серную кислоту). На носитель иммобилизованы мышиные моноклональные антитела, продуцируемые штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus L. №РККК(П)660Д. Конъюгат содержит мышиные моноклональные антитела, продуцируемые штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus. Musculus L №РККК(П)661Д. В качестве калибровочных проб используется ПСА с 1%-ным сывороточным альбумином.

Использование набора позволяет выявить 100% больных со злокачественными опухолями простаты среди пациентов клиник онкологического профиля (5 таблиц).

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для диагностики рака простаты, контроля эффективности проводимого лечения опухолей простаты, в скрининговых программах для выявления группы риска среди мужского населения, прогноза развития опухолевого процесса и обнаружения рецидивов.

Прототипом данного технического решения может служить набор фирмы Hoffman La Roche, предназначенный для количественного измерения концентрации ПСА в сыворотке и плазме крови человека методом иммуноферментного анализа на анализаторе COBAS CORE ( Cancer Res., v.51, 222-226 (1991).

В состав набора входят шарики полистироловые, покрытые мышиными мка к ПСА человека, конъюгат Fab фрагмента вторых анти-ПСА мка с пероксидазой хрена в буфере со стабилизатором и консервантом, калибраторы 0 и 25 нг/мл ПСА, контрольная сыворотка, содержащая известное количество ПСА в трис-буфере с белковым стабилизатором и консервантом, буфер для разведения образцов с белковым стабилизатором и консервантом. Для проведения ферментативной реакции набор комплектуется с субстратным раствором ТМБ (тетраметилбензидином). Определение может проводиться только на полностью автоматизированном анализаторе COBAS CORE. На другом оборудовании этот набор не может быть использован. Поэтому набор не является универсальным и не может быть использован в лабораториях, где нет автоматизированного анализатора COBAS CORE.

Цель изобретения заключается в устранении указанных недостатков.

Поставленная цель достигается использованием пары высокоспецифических мышиных мка, продуцируемых штаммами гибридных культивируемых клеток мышей Mus.musculus L №РККК(П)660 Д и №РККК(П)661Д, а в качестве твердой фазы использованием планшетов полистироловых, которые позволяют производить детекцию на любом фотометре горизонтального сканирования.

Набор содержит планшет с иммобилизованными моноклональными антителами, шесть калибровочных проб (содержащих 0; 1; 2,5; 5; 10 и 30 нг/мл ПСА), конъюгат мышиных моноклональных антител с пероксидазой хрена, контрольную сыворотку с известным содержанием ПСА, реагенты для энзиматической реакции (краситель тетраметилбензидин и цитратный буфер с перекисью водорода, стоп-реагент серную кислоту). На носитель иммобилизованы мышиные моноклональные антитела, продуцируемые штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus L. № РККК/ П/ 660Д. Конъюгат содержит мышиные моноклональные антитела, продуцируемые штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus. Musculus L №РККК(П)661 Д. В качестве калибровочных проб используется ПСА в 1%-ным сывороточном альбумине. Для проведения ферментативной реакции используется субстратный буфер с перекисью водорода, ТМБ (тетраметилбензидин) и стоп-реагентсерная кислота.

Проведение анализа.

Освободить планшет от упаковки. В лунки планшета внести по 50 мкл каждой калибровочной пробы, содержащей 0; 1; 2,5; 5; 10; 30 нг/ мл ПСА, в другие лунки внести в повторностях по 50 мкл образцов проб сыворотки и 50 мкл контрольной сыворотки с известным содержанием ПСА. Добавить во все лунки по 100 мкл рабочего раствора конъюгата и инкубировать при температуре 37°С в течение 1 ч. По окончании инкубации промыть лунки 4 раза рабочим раствором для промывания планшета. Добавить во все лунки по 100 мкл проявляющего раствора, инкубировать 15 мин при 37°С, остановить реакцию добавлением во все лунки по 100 мкл 4,8%-ной серной кислоты. Измерить оптическую плотность в лунках на фотометре вертикального сканирования при длине волны 450 нм.

Основные характеристики набора приведены в таблице 1.

Пример 1. Сыворотки 10 доноров-женщин исследовали на присутствие ПСА, определяемого с помощью данного набора. Ни в одном из случаев не наблюдали положительный результат. Сыворотки 40 доноров-мужчин исследовали на присутствие антигена ПСА, определяемого с помощью данного набора. Среднее значение ПСА в сыворотке по этой группе составило (0,46±0,06) нг/мл.

Пример 2. Образцы 14 сывороток от пациентов с опухолями других, чем рак простаты, локализаций (рак прямой кишки, рак желудка, рак печени, рак ободочной кишки, рак толстой кишки, рак легкого, рак поджелудочной железы). Среднее значение по этой группе составляло (1,1±0,3) нг/мл ПСА.

Пример 3. Сыворотки 11 пациентов с аденокарциномой предстательной железы, подтвержденной гистологически, исследовали с помощью данного набора. Среднее значение ПСА по данной группе было (155,1±6,5) нг/мл.

Пример 4. Сыворотки 8 пациентов с аденомой предстательной железы, подтвержденной гистологически, исследовали с помощью данного набора. Среднее значение ПСА по этой группе составило (17,4±6,5) нг /мл. Результаты экспериментов представлены в таблицах 2-5. Из таблиц видно, что с помощью данного набора можно выявить пациентов с опухолями простаты.