способ выявления вируснейтрализующих антител при вирусной диарее - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота
Классы МПК: | C12N5/00 Недифференцированные клетки человека, животных или растений, например, клеточные линии; ткани; культивирование или сохранение их; питательные среды для них A61K39/00 Лекарственные препараты, содержащие антигены или антитела |
Автор(ы): | Глотов А.Г. (RU), Глотова Т.И. (RU) |
Патентообладатель(и): | Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Сибирского отделения Россельхозакадемии (ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН) (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2003-08-11 публикация патента:
10.07.2005 |
Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к способам серологической диагностики инфекционных заболеваний крупного рогатого скота, в частности вирусной диареи - болезни слизистых (ВД КРС), а также оценке напряженности иммунитета у вакцинированных животных. Сущность изобретения состоит в том, что разработан способ, включающий выращивание перевиваемой линии культуры клеток КСТ (коронарные сосуды эмбриона коровы) в питательной среде Игла MEM с 20 мг/мл канамицина и 10% лошадиной сыворотки. Двукратные разведения инактивированных испытуемых проб сыворотки от животных (56°С, 30 минут) смешивают в равном объеме (0,05 мл) со 100 ТЦД50/0,1мл вируса и инкубируют 1 час при 37°С в CO2 инкубаторе. По окончании инкубации добавляют 0,1 мл суспензии культуры клеток КСТ в питательной среде Игла MEM, содержащей 20 мг/мл канамицина и 5% (2,5% конечная концентрация) лошадиной сыворотки. Концентрация клеток в культуре составляет 3,5×105. Учет реакции проводят через 3 дня по мере наступления цитопатогенного действия вируса в контрольных лунках, содержащих рабочую дозу вируса. Технический результат - расширение арсенала диагностических иммунологических способов для ветеринарных целей. 1 з.п.ф-лы, 2 табл.
Формула изобретения
1. Способ выявления вируснейтрализующих антител при вирусной диарее слизистых оболочек крупного рогатого скота, включающий реакцию нейтрализации антителами сыворотки крови животного цитотоксического действия вируса в культуре клеток, отличающийся тем, что реакцию проводят микрометодом с использованием перевиваемой линии культуры клеток коронарных сосудов эмбриона коровы (КСТ)), предварительно выращенной в питательной среде Игла MEM с 20 мг/мл канамицина и 10% сыворотки крови лошади, при этом инкубируют исследуемую сыворотку животных и 100 ТЦЦ 50/0,1 мл вируса при 37°С СО 2-инкубаторе, добавляют 0,1 мл суспензии культуры клеток КСТ в концентрации 3,5×10 в питательной среде Игла, содержащей 20 мг/мл канамицина и 5% (2,5% конечная концентрация) сыворотки крови лошади соответственно, а учет реакции проводят через 3 дня.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакцию проводят в микропланшетах для культур клеток.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к ветеринарии, а именно к ветеринарной вирусологии, и может быть использовано в лабораторной практике для серологической диагностики инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных, в частности для выявления вируснейтрализующих антител к вирусу вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВД КРС).
До настоящего времени основным способом диагностики ВД КРС является длительная процедура, основанная на постановке реакции нейтрализации в первично трипсинизированных культурах клеток макрометодом.
Сущность метода заключается в специфическом действии нейтрализующих антител сыворотки крови подавлять способность вируса вызывать цитопатическое действие в культуре клеток.
Ее проводят в первично трипсинизированных культурах клеток ПЭК (почка эмбриона коровы) или ТБ (тестикулы бычка) по общепринятой методике. В качестве ростовой добавки для культуры клеток используется сыворотка крупного рогатого скота в количестве 10%. Культуры клеток получаются путем трипсинизации органов телят (почки, тестикулы).
Компоненты реакции: исследуемые пробы сыворотки, питательная среда и вирус используются в объеме не менее 1 мл. Реакция ставится макрометодом в биологических пробирках объемом 15 см3. В качестве рабочей дозы используют 100-400 ТЦД50/мл вируса. Рабочее разведение вируса и испытуемых проб сыворотки смешивают непосредственно перед реакцией, и после инкубации в течение одного часа вносят в сформировавшийся монослой культуры клеток.
Результаты реакции учитываются на 5-7 дни по мере наступления цитопатического действия вируса в контрольных пробирках (Сюрин В.Н. и др. Диагностика вирусных болезней животных: Справочник. - М.: Агропромиздат, 1991. - 528 с).
К недостаткам данного способа относятся:
1. Возможность контаминации нормальной сыворотки и первично трипсинизированных культур клеток КРС антителами к вирусу, а также самим вирусом (цитопатогенными и нецитопатогенными вариантами), что искажает результаты реакции и требует поиска серонегативных к вирусу животных-доноров.
2. Использование длительной и трудоемкой процедуры трипсинизации полученных внутренних органов животных.
3. Наличие гетерогенной популяции клеток в первично трипсинизированных культурах клеток.
4. Наличие больших объемов компонентов реакции и длительность постановки и учета.
5. Использование большого количества пробирок, особенно при массовых серологических исследованиях.
Наиболее близким решением, принятым за прототип, и наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому эффекту, является следующий способ ретроспективной серологической диагностики ВД КРС (Dirk Deregt, Siv Smithson and Gerry C. Kozub. A short Incubation Serum Neutralization Test for Bovine Viral Diarrhea Virus// Can. J. Vet. Res. - 1992. - 56. - 161-164).
Способ включает использование первично трипсинизированной культуры клеток почки эмбриона коровы (ПЭК), полученной из свободного от ВД стада, и 10% сыворотки крови от телят также из свободного от ВД стада. Реакция проводится микрометодом в пластиковых платах.
Учет проводится через 5 дней. Рабочая доза вируса составляет 100 ТЦД50/0,1 мл .
К недостаткам данного способа относится необходимость поиска серонегативного в отношении ВД КРС стада, получение первично трипсинизированной культуры клеток и длительность учета реакции (5 дней).
Технической задачей изобретения является постановка реакции в микропланшетах, замена первично трипсинизированной культуры клеток на перевиваемую, сыворотки крови теленка на сыворотку крови лошади, изменение объема сыворотки крови лошади (до 5%) при культивировании культуры клеток и сокращение сроков учета реакции до 3 дней.
Сущность изобретения заключается в том, что в известном способе выявления вируснейтрализующих антител к вирусу ВД КРС, согласно изобретению, реакцию нейтрализации проводят микрометодом с использованием перевиваемой линии культуры клеток КСТ (коронарные сосуды эмбриона коровы).
Сущность изобретения заключается также в том, что культуру клеток КСТ выращивают в питательной среде Игла MEM с 20 мг/мл канамицина и 10% сыворотки крови лошади.
Сущность изобретения заключается также в том, что реакцию проводят в микропланшетах для культур клеток.
Сущность изобретения заключается также в том, что после инкубации равных объемов (0,05 мл) двукратных разведений исследуемой сыворотки животных и 100 ТЦЦ50/0,1 мл вируса при 37°С в СО2-инкубаторе добавляют 0,1 мл суспензии культуры клеток КСТ в концентрации клеток 3,5×10 5 в питательной среде Игла MEM, содержащей 20 мг/мл канамицина и 5% (2,5% конечная концентрация) сыворотки крови лошади соответственно.
Сущность изобретения заключается также в том, что учет реакции проводят через 3 дня.
Учет реакции проводят по мере наступления цитопатогенного действия (ЦПД) вируса в контрольных лунках, содержащих рабочую дозу вируса - 100 ТЦД50/0,1 мл. Высшее разведение сыворотки, полностью нейтрализующее ЦПД вируса в 50% инфицированных лунок, принимается за титр сыворотки. В реакции используются контроли: отрицательный контроль - сыворотки от неинфицированного КРС. Положительный - гипериммунная моноспецифическая сыворотка кролика.
Сущность технического решения раскрыта в примерах конкретного осуществления способа.
Пример 1. Выращивание перевиваемой линии культуры клеток КСТ.
Культуру клеток КСТ выращивают в культуральных матрасах емкостью 25 см3 в питательной среде Игла MEM. Для этого суспензию клеток, ресуспендированных в среде Игла MEM, в концентрации 1,2×105 в объеме 5 мл вносят в одноразовый матрас. В качестве ростостимулирующей добавки в суспензию клеток вносят 0,5 мл сыворотки крови лошади. Смесь перемешивают и помещают в условия термостата при 37°С на 48 часов. По мере формирования монослоя клеток в матрас вносят 5 мл питательной среды Игла MEM без сыворотки крови лошади и инкубируют в течение 3-5 суток до момента постановки реакции нейтрализации.
Пример 2. Подготовка исследуемых проб сыворотки крови от животных.
Исследуемые пробы сыворотки крови от больных животных прогревают на водяной бане в течение 30 минут при 56°С. После этого готовят двукратные разведения проб сыворотки крови от 1:2 до 1:1024 на питательной среде Игла MEM и необходимый объем вируса, содержащего 100 ТЦД50/0,1 мл .
После этого равные объемы двукратных разведений испытуемых проб сыворотки крови животных и 100 ТЦД50/0,1 мл по 0,05 мл смешивают в лунках микропланшета и инкубируют в течение 1 часа при 37°С в условиях СО2-инкубатора.
Пример 3. Подготовка суспензии культуры клеток.
Культуру клеток КСТ, выращенную в пластиковых матрасах емкостью 25 см3 снимают со стекла при помощи смеси трипсина и версена в соотношении 1:9. Клетки ресуспендируют в питательной среде Игла MEM, содержащей 20 мг/мл канамицина, до концентрации 3,5×105 клеток в 1 мл и добавляют сыворотку крови лошади в объеме 5% к объему суспензии клеток (конечная концентрация 2,5%).
Пример 4. Добавление суспензии культуры клеток в микропланшеты.
По окончании времени инкубации разведений испытуемых сывороток и вируса в каждую лунку микропланшета вносят по 0,1 мл суспензии клеток. Микропланшеты закрывают крышкой и инкубируют в условиях СO2-инкубатора в течение 3 дней.
Пример 5. Учет реакции.
Реакцию учитывают через три дня после внесения суспензии культуры клеток по мере развития цитопатического действия вируса в контрольных лунках, не содержащих исследуемые сыворотки. Титром сыворотки считают предельное ее разведение, тормозящее развитие цитопатического действия вируса в 50% зараженных лунок с культурой клеток. Положительной считается сыворотка, нейтрализующая 100 ТЦД50/0,1 мл в разведении 1:2.
Ретроспективный диагноз на ВД КРС ставят при четырехкратном и более приросте титров вируснейтрализующих антител в парных пробах сыворотки крови животных, взятых с интервалом в 3-4 недели.
Пример 6. Сравнительное изучение эффективности стандартной методики постановки РН в пробирочной культуре клеток и заявляемой.
Таблица 1 Сравнительная эффективность двух вариантов реакции нейтрализации | ||||
Исследовано проб | выявлено положительных /% | Соотношение стандартный/ модифицированный метод, % | Достоверность (Р) | |
стандартный метод | модифицированный метод | |||
400 | 241/60,3 | 289/72,3 | 83,0 | <0,05 |
Из данных таблицы 1 видно, что заявляемый тест выявляет на 12% больше положительных проб, что говорит о его более высокой чувствительности.
Пример 7. Сравнительное изучение величин и разброса титров вируснейтрализующих антител, выявляемых в пробах сыворотки крови крупного рогатого скота при помощи двух методик постановки реакции.
Таблица 2.
Величина и разброс титров вируснейтрализующих антител в пробах сыворотки крови КРС, исследованных двумя вариантами реакции нейтрализации
N=400
Тест | стандартный метод (кол-во/%) | заявляемый метод (кол-во/%) |
1 | 2 | 3 |
1 | 2 | 3 |
Отриц(<1:2) | 159/39,8 | 111/27,3 |
1:2-1:16 | 200/50,0 | 223/55,8 |
1:32-1:256 | 41/10,3 | 63/15,8 |
>1:512 | 0/0 | 3/0,75 |
Из данных таблицы 2 видно, что заявляемый метод постановки РН выявил на 12,5% меньше отрицательно реагирующих животных, чем стандартный.
Частота встречаемости величин титров 1:2-1:16 была у заявляемого теста на 5,8% выше, чем у стандартного, а 1:32-1:256 выше на 5,5%. Титры антител 1:512 и выше в стандартном тесте не выявлялись, а заявляемый выявил трех животных, что составило 0,75%.
Таким образом, заявляемый способ позволяет выявлять большее количество положительных проб сыворотки крови исследуемых животных в более короткие сроки в сравнении со стандартным методом постановки реакции нейтрализации.
Заявляемый метод выявляет вируснейтрализующие антитела в более высоких титрах в сравнении со стандартным методом, а количество отрицательно реагирующих животных меньше.
Время исследования 100 проб сыворотки составляет 3 дня.
По срокам постановки диагноза модифицированный метод превосходит стандартный в 2 раза. Стоимость исследования одной пробы при помощи заявляемого метода составляет 86 рублей, при помощи стандартного - 165 рублей, что в 1,9 раза снижает затраты на проведение диагностических исследований.
Способ обеспечивает достижение цели изобретения: за счет повышения эффективности выявления вируснейтрализующих антител к вирусу ВД КРС выявляется большее количество положительно реагирующих животных.
Класс C12N5/00 Недифференцированные клетки человека, животных или растений, например, клеточные линии; ткани; культивирование или сохранение их; питательные среды для них
Класс A61K39/00 Лекарственные препараты, содержащие антигены или антитела