способ определения чувствительности гидробионтов daphnia magna straus к токсическому действию водорастворимых химических веществ

Формула изобретения

Способ определения чувствительности дафний к токсическому действию водорастворимых химических веществ, включающий регистрацию гибели дафний под действием химических веществ, отличающийся тем, что фиксируют время гибели в минутах при изменяющихся по логарифмической шкале с интервалом 0,1 концентрациях (С) в моль/л исследуемого вещества с последующим построением графической зависимости усредненного времени гибели по оси ординат масштабом 1 деление - 1 мин от величины, обратной концентрации (1/С) исследуемого вещества по оси абсцисс, при этом масштаб пропорционален увеличению log на 0,1, и расчетом чувствительности дафний к токсическому действию (tg ) по формуле

tg =Т_L(min):1/К_L= Т_L(min)· K_L, (I)

где - угол наклона участка прямой на графике к оси абсцисс,

Т_L(min) - время наступления гибели в минутах, определяемое по точке ипотетического пересечения отрезка прямой с осью ординат,

K_L - константа летальности в моль/л определяется как концентрация химического вещества, при которой время гибели дафний равно 2Т_L(min).

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, в частности токсикологии, а именно к способам оценки токсического действия химических веществ.

В токсикологических исследованиях основными понятиями являются “доза”, когда установленное количество химического вещества проникает непосредственно в организм (путем введения внутривенно, внутримышечно, подкожно, per os и т. д.), и “концентрация”, когда химическое вещество в определенном количестве находится в окружающей организм среде (вода, воздух), но точное количество, проникшее в организм, не известно. Токсическое действие химического вещества, как правило, оценивается по “летальному” действию (т. е. по факту гибели организма). Дозы или концентрации ксенобиотика, вызывающие гибель, обозначаются как LD или LC с индексом внизу, показывающим процент смертельной реакции. Стандартным способом определения токсического действия вещества является способ регистрации 50% (средней) гибели организмов, взятых в опыт (LD₅₀, LC₅₀). (Методы определения токсичности и опасности химических веществ. Под редакц. И.В.Саноцкого, М., Медицина, 1970). Этот подход основан на введении животным возрастающих доз химического вещества (или пребывание организма в среде с возрастающей концентрацией вещества) с последующей фиксацией гибели через выбранный промежуток времени (Лойт А.О., Савченков М.Ф. Профилактическая токсикология. Руководство для токсикологов-экспериментаторов, - Иркутск: Изд-во Иркут. ун-та, 1996, с.73-79). Наиболее близким к заявляемому объекту является способ определения токсического действия водорастворимых химических веществ на дафниях (Тонкопий В.Д., Загребин А.О., Шерстнева П.А., Космачев А.Б. Журнал эволюц. биохим. и физиол. - 1994, T.30. № 3, с.386-391).

Основным недостатком этого способа определения токсического действия химического вещества является то, что метод не учитывает токсикокинетических различий действия веществ и оценивает их эффект - дозу или концентрацию, при которой происходит гибель 50% особей, в одной условно выбранной временной точке, через 1 сутки после интоксикации. При значительных различиях в токсикокинетике веществ такой метод сравнения их токсического действия не является вполне адекватным.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа определения чувствительности дафний к воздействию водорастворимых химических веществ в опытах in vivo, который позволяет на основании регистрации времени гибели гидробионтов Daphnia magna Straus в различных концентрациях водных растворов химического вещества оценить динамику развития его токсического действия.

Для решения поставленной задачи определяют время гибели дафний под влиянием каждой из логарифмически возрастающих концентраций исследуемого химического вещества. На основании полученных значений среднего времени гибели особей (T_L, мин), при заданных концентрациях химического вещества ([С], М), из графика (см. чертеж) зависимости времени гибели гидробионтов Daphnia magna Straus от величины обратной молярной концентрации исследуемого вещества, определяют минимальное время гибели дафний (Т_L(min)), константу летальности (К_L) и тангенс угла наклона графика к оси абсцисс (tg ). Исследуемые концентрации токсиканта изменяются по логарифмической шкале с интервалом 0,1. Объем раствора, приходящегося на одну дафнию, - не менее 20 мл. Реальное время гибели особей для каждой концентрации химического вещества определяется визуально.

Построение графика (см. чертеж) позволяет определить величины: минимального времени наступления гибели, Т_L(min), равного длине отрезка, отсекаемого продолжением прямой на оси ординат, константы летальности, K_L, равной концентрации токсиканта, при которой время гибели равно двум минимальным, и тангенс угла наклона прямой к оси абсцисс (tg =Т_L(min):1/К_L=Т_L(min)· К_L). Для правильного расчета и, в дальнейшем, сравнения между собой tg различных химических веществ необходимо при построении графика придерживаться по обеим осям единого масштаба: по оси абсцисс - изменение концентрации (моль/л) пропорционально увеличению log на 0,1, выраженное обратной величиной, по оси ординат 1 деление - 1 минута, T_L, мин.

Определение тангенса угла наклона необходимо для получения количественной характеристики чувствительности живого организма к исследуемому веществу, учитывающей одновременно и концентрацию токсиканта и динамику времени наступления эффекта (гибели животных). Поэтому tg можно назвать количественным показателем чувствительности дафний к токсическому действию химического вещества в диапазоне концентраций, соответствующему на графике прямолинейному отрезку. Тангенсы угла наклона целесообразно сравнивать в одинаковых диапазонах концентраций исследуемых веществ.

Принципиальным отличием от ранее используемого способа оценки токсического действия химических веществ (LС ₅₀) является то, что предложенный способ учитывает не только действующую концентрацию исследуемого вещества в одной произвольно выбранной временной точке, но и динамику развития эффекта гибели гидробионтов, что позволяет проводить сравнение токсического действия различных веществ в одинаковых диапазонах концентраций.

Пример.

Приводится последовательность действий при определении токсических эффектов перекиси водорода в опытах на гидробионтах Daphnia magna Straus, биообъекте, широко используемом в токсикологической практике (Международный стандарт ISO 6341-82. Качество воды. Определение угнетения подвижности Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea). - 1987). Фиксируют время гибели дафний при пребывании в растворах (моль/л) перекиси водорода в концентрациях, изменяющихся пропорционально увеличению log на 0,1, и рассчитывают величины, обратные используемым концентрациям (1/[С]) (таблица 1). На основании результатов, представленных в таблице 1, строят график зависимости среднего времени гибели дафний от концентраций перекиси водорода, представленных обратными величинами (1/[С], М) (см. чертеж). Графически определяют величины K_L, Т_L(min) и рассчитывают tg .

Значение Т_L(min) находят, продолжая прямолинейный отрезок графика до пересечения с осью ординат (Т_L(min) =1 мин), откладывают на графике по оси ординат 2Т_L(min) (2Т_L(min)=2 мин), из точки пересечения значения 2Т _L(min) с графиком опускают перпендикуляр до пересечения с осью 1/[С], в этой точке пересечения находят значение 1/K _L(1/K_L=0,32), получаем K_L=3,1 моль/л. Значение tg угла рассчитывают по формуле:

tg =T_L(min):1/K_L=Т_L(min)· K_L=1× 3,1=3,1.

Аналогичным способом определены параметры чувствительности дафний к токсическому действию карбахолина и ареколина (таблица 2).

Таблица 1
Среднее время гибели дафний при воздействии убывающих концентраций перекиси водорода (концентрации расположены по логарифмической шкале с интервалом 0,1)
Концентрация [С], (М)	1/[С]	Среднее время гибели дафний (мин)
1	1	3,46±0,2
0,8	1,3	4,22±0,2
0,63	1,6	4,72±0,5
0,5	2	5,94±0,7
0,4	2,5	7,27±0,9
0,32	3,2	8,44±0,9
0,25	4	11,5±0,8
0,2	5	15,0±1,3
0,16	6,3	17,5±1,8
0,13	8	22,5±2,1
0,1	10	29,5±2,8
0,08	13	41,5±3,7
0,063	16	49±5,4

Таблица 2
Определение чувствительности гидробионтов Daphnia magna Straus к токсическому действию перекиси водорода, карбахолина и ареколина
Химические вещества	Минимальное время гибели дафний (ТL(min) ), мин	Константа летальности (К L), М	Показатель чувствительности дафний к химическому веществу (tg )
Перекись водорода	1,0	3,1	3,1
Карбахолин	0,2	6,7· 10-3	1,3· 10-3
Ареколин	0,4	8,3· 10-3	3,3· 10- 3