способ размножения маклеи сердцевидной (macleaya cordata (willd) r.br.) (варианты)

Формула изобретения

1. Способ размножения маклеи сердцевидной in vitro, включающий вычленение эксплантов из листьев растения, культивирование их на питательных средах до образования побегов и последующую высадку полученных растений-регенерантов на твердый субстрат, при этом культивирование листовых эксплантов проводят на модифицированной среде Мурасиге и Скуга, содержащей 1 мг/л аскорбиновой кислоты и 10 мг/л гидролизата казеина.

2. Способ размножения маклеи сердцевидной in vitro, включающий вычленение эксплантов из черешков растений, культивирование их на питательных средах до образования побегов и последующую высадку полученных растений-регенерантов на твердый субстрат, при этом культивирование черешковых эксплантов проводят на модифицированной среде Мурасиге и Скуга, содержащей 3 мг/л аскорбиновой кислоты.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам размножения растений.

Известна разработка методов культивирования тканей копеечника забытого, включающая стерилизацию семян, проращивание их на питательной среде, включающей 0,1 мг/л индолилмасляной кислоты до получения пробирочных растений (см.: Н.С.Ляпкова, Н.В.Хадеева, С.С.Шаин, А.Н.Майсурян. «Разработка методов культивирования тканей копеечника in vitro», журнал «Биотехнология», 1999, №1, с. 55-61).

Известна разработка способов культивирования эфедры односемянной, включающая посадку семян и органов на питательную среду, получение каллусной культуры, морфогенного каллуса и растений-регенерантов (см.: Н.А.Величко. «Культивирование эфедры односемянной в условиях in vitro», журнал «Биотехнология», 2002, №5, с. 59-64).

Однако указанными способами культивирования не удается получить каллусную культуру маклеи сердцевидной (М. cordata (willd.) R.Br.), поскольку выполнение предлагаемых стадий культивирования приводит к некрозу ткани экспланта маклеи сердцевидной.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ микроразмножения женьшеня. Способ включает вычленение цветочных бутонов, культивирование их на питательной среде до образования зрелых эмбриоидов, посадку их на питательную среду для полного укоренения, высадку полученных растений-регенерантов на твердый субстрат. При этом цветочные бутоны вычленяют из соцветий, индуцированных предварительно при культивировании спящих почек корневища на питательной среде Мурасиге и Скуга (МС), содержащей в своем составе 0,5 мг/л - 6-БАП и 0,5 мг/л ГК₃, а для получения укорененных растений-регенерантов эмбриоиды пересаживают на питательную среду Мурасиге и Скуга с половинным содержанием макроэлементов дополнительно - 4,0 мг/л - 6-БАП и 0,5 мг/л ГК ₃(см.: а.с.СССР №1824114, кл. А 01 Н 4/00, опубл. 30.06.93).

Однако при использовании данного способа так же происходит некроз ткани маклеи сердцевидной. Задачей предлагаемого способа является получение каллусной культуры и растения маклеи сердцевидной (Macleaya cordata (willd.) R. Br.).

Поставленная задача достигается с помощью предлагаемого способа размножения маклеи сердцевидной, включающего вычленение эксплантов, культивирование их на питательных средах до образования побегов, последующую высадку полученных растений-регенерантов на твердый субстрат, причем экспланты вычленяют из листьев или черешков, при этом культивирование проводят на модифицированных средах Мурасиге и Скуга, включающих аскорбиновую кислоту 1-3 мг/л и гидролизат казеина - 10 мг/л.

Сущность предлагаемого способа.

Способ состоит в том, что осуществляют получение эксплантов из исходного материала, стерилизацию их, введение в культуру на среде Мурасиге и Скуга, содержащей цитокинин кинетин и ауксин 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), а также аскорбиновую кислоту и гидролизат казеина, размножение каллусной культуры, получение побегов на твердой питательной среде с последующей высадкой в теплицу для адаптации к нестерильным условиям. При этом в качестве исходного материала используют листья или черешки растений. Введение эксплантов в культуру осуществляют на среде Мурасиге и Скуга при содержании кинетина 0,5-1 мг/л, 2,4-Д - 2-4 мг/л, при этом адаптацию полученных растений в нестерильных условиях проводят в теплицах.

Пример 1. Размножение маклеи сердцевидной из листовых эксплантов.

Способ осуществляют на листовых эксплантах. Заготовленные побеги с листьями не рекомендуется хранить продолжительное время, а приступать к посадке эксплантов. В течение этого короткого промежутка времени побеги хранят при температуре 3-4°С.

Из листьев делают высечки диаметром 1 см. Перед посадкой экспланты стерилизуют, для чего их помещают в стерильный бокс и на 30-40 секунд, заливают 70% этанолом, затем на 7-15 минут (в зависимости от возраста листьев) помещают в 8%-ный раствор хлорамина, который отмывают в течение 15 минут в трех порциях стерильной дистиллированной воды. После этого с помощью стерильных пинцета и скальпеля удаляют концы сегментов исходного материала, где клетки могут быть повреждены.

Выделенные таким образом экспланты надсекают в нескольких местах скальпелем и помещают на питательную среду Мурасиге и Скуга (табл.1), содержащую (мг/л): мезоинозит - 100; никотиновая кислота - 1,0; тиамин - 0,5; пиридоксин - 0,5; кинетин - 0,5; 2,4-Д - 2,0; 6-бензиламинопурин - 0,5; аскорбиновая кислота - 1,0; гидролизат казеина 10. рН среды после автоклавирования 5,8.

Сроки каллусообразования и константа каллусообразования, рассчитанная по формуле Э.Люка (Люк Э., Ягер М. Консерванты в пищевой промышленности. - Санкт-Петербург, 1998) показаны в таблицах 2 и 3.

К=ln(Z₀/Z _t)/t;

где К - константа скорости каллусобразования;

Z₀ - количество каллусов на начальном этапе каллусообразования;

Z_t - количество каллусов на завершающем этапе;

t - количество дней от начала до завершения каллусообразования.

Показатели таблиц свидетельствуют о том, что наилучший результат получают при использовании в технологии получения каллуса маклеи сердцевидной на листовых эксплантах 2-го варианта питательных сред (представленного в примере).

В дальнейшем для индукции каллусогенеза на листовых эксплантах используют среду Мурасиге и Скуга №1 (табл.4).

Пробирки с высаженными эксплантами помещают в культуральную темновую комнату при температуре воздуха 25-27°С.

Через 12-15 дней у 50% высаженных эксплантов наблюдается начало каллусообразования, а через 20-25 дней на всех эксплантах образуется каллус. По прошествии 2-3 недель во избежание старения каллуса его пассируют на модифицированную среду Мурасиге и Скуга с тем же содержанием макро-, микроэлементов и витаминов, но с уменьшенным содержанием фитогормонов (табл.1, №4), мг/л: кинетин - 0,2; 2,4-Д - 1,0. рН 5,7-5,8. Размер пассируемого каллуса 0,1×0,1 см. Через 5-7 дней после пассажа наблюдается начало роста перенесенного каллуса.

В течение месяца каллус переносится на регенерационную среду Potato II, содержащую, мг/л: тиамин - 1,0; картофельный экстракт 20% (табл.4).

Каллус на регенерационной среде выращивается при температуре воздуха 25-27°С, фотопериоде 16 часов, освещенности 4000-6000 лк, относительной влажности воздуха 70-75%. В течение 1-1,5 месяцев отмечается развитие побегов из каллуса.

По истечении этого времени приступают к пересадке растеньиц. Коэффициент составляет 1:20. В течение 1-2 месяцев укореняется 64% растений. Асептические растения размножают черенкованием: развившиеся растения разрезают, оставляя на каждом отрезке 1 лист и почку в его пазухе. Этот микрочеренок помещают в пробирку со средой Мурасиге и Скуга №3 (табл.4) включающую, мг/л: тиамин - 1,6; пиридоксин - 1,0; кинетин - 0,5; аскорбиновая кислота - 3,0; гиббереллин 2,0; аденин 0,5. Для наилучшего укоренения черенковых побегов в среду добавляют индолил-3-уксусную или индолил-3-масляную кислоту в концентрации 1-2 мг/л.

Перенос растений из пробирок осуществляется в рулоны, заполненные торфом. Для этого целлофановую ленту размером 15×40 см надрезают в нескольких местах по центру. Ленту заполняют торфом, слой которого равен 0,5-1 см. На субстрат выкладывают растения маклеи через каждые 4-5 см. Ленту сворачивают в рулон и устанавливают в поддон глубиной 2-3 см. Полив производят 1% раствором индолил-3-уксусной или индолил-3-масляной кислотой.

После того как происходит адаптация растений и появляется 1-2 новых листа, растения высаживают в вегетационные сосуды диаметром 9 см. При высоте растений 10-15 см их пересаживают в теплицу. Экстремальные условия исключают путем проветривания теплицы и поливов. Условия произрастания растений в теплице максимально приближают к естественным условиям. Высадку растений в открытый грунт производят при прогревании почвы до 12-14°С.

Пример 2. Размножение маклеи сердцевиной из черешковых эксплантов.

Способ осуществляют на черешковых эксплантах, отличающийся составом питательной средой для начального культивирования.

Из черешков маклеи сердцевидной делают высечки длиной 1 см. Перед посадкой экспланты стерилизуют, как описано в примере 1. У стерильных эксплантов удаляют концы сегментов исходного материала, где клетки могут быть повреждены.

Выделенные таким образом экспланты помещают на питательную среды Мурасиге и Скуга (табл.1), содержащую (мг/л): мезо-инозит - 100; никотиновая кислота - 1,0; тиамин - 10,0; пиридоксин - 1,0; кинетин - 1,0; 2,4-Д - 4,0; аскорбиновая кислота - 3,0. рН среды после автоклавирования 5,8.

Сроки каллусообразования и константа каллусообразования, рассчитывали по формуле Э.Люка, приведенной в примере 1.

Показатели таблиц 2 и 3 свидетельствуют о том, что наилучший результат получают при использовании в технологии получения каллуса на черешковых эксплантов маклеи сердцевидной 3 варианта питательной среды.

В дальнейшем для индукции каллусогенеза на черешковых эксплантах используют среду Мурасиге и Скуга №2 (табл.4).

Последующие приемы культивирования каллусной культуры и растения маклеи сердцевидной из черешковых эксплантов аналогичны приемам культивирования каллусной культуры из листовых эксплантов.

Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными способами имеет следующие преимущества:

- возможность получения каллусной культуры и растения маклеи сердцевидной вне зависимости от погодных и климатических условий;

- использование для размножения вегетативных органов маклеи сердцевидной;

- низкая себестоимость.

Таблица 1 Состав питательных сред для образования первичного каллуса маклеи сердцевидной (минеральная основа МС), мг/л
Компоненты среды	Варианты сред
	МС+ vit В5+ 2,4-Д	МС+ vit C + гидр. Казеина +2,4-Д + кинетин	MC+vit B5+vit С+2,4-Д + кенетин	МС+2,4-Д + кинетин
1	2	3	4	5
Макросоли
NH4NO3	1650	1650	1650	1650
KNO 3	1900	1900	1900	1900
КН2PO4	170	170	170	170
CaCl2·2Н2O	440	440	440	440
MgSO 4·7H20	370
Микроэлементы
MnSO4·4H 2O	22,3	22,3	22,3	22,3
Н3ВО 3	6,2	6,2	6,2	6,2
ZnSO4·7H2O	8,6	8,6	8,6	8,6
KI	0,83	0,83	0,83	0,83
CuSO4·5H2O	0,025	0,025	0,025	0,025
Na2MoO4·2H 2O	0,25	0,25	0,25	0,25
CoCl2·6H 2O	0,025	0,025	0,025	0,025
Железо
FeSO4·7H2O	27,8	27,8	27,8	27,8
Na2ЭДТА·2H2O	37,3	37,3	37,3	37,3
Органические добавки
Мезоинозит	100,0	100,0	100,0	100,0
Никотиновая кислота	1,0	1,0	1,0	0,5
Тиамин HCl	10,0	0,5	10,0	1,0
Пиридоксин HCl	1,0	0,5	1,0	0,5
Аскорбиновая кислота	0,5	1,0	3,0	0
Гидролизат казеина	-	10	-	-
Фитогормоны
Кинетин	0	0,5	1,0	0,2
6-БАП	0	0,5	0	0
2,4-Д	2,0	2,0	4,0	2,0
Углеводы
Сахароза	20000	20000	20000	20000
Субстрат
Агар-агар	7000	7000	7000	7000

Таблица 2 Сроки образования каллуса на питательных средах
Экспланты	Варианты сред
	1	2	3	4
	MC+vit В5+2,4-Д	MC+vitC+гидр. казеина +2,4-Д + кинетин	MC+vitB5+ vitC +2,4-Д +кинетин	МС + 2,4-Д+ +кинетин
	Количество дней
Листовые	25-35	12-20	15-25	20-35
Черешковые	20-30	15-25	10-20	20-35

Таблица 3 Константа скорости каллусообразования, в зависимости от среды
Вид экспланта	Варианты сред
	1	2	3	4
	MC+vit B5+2.4-Д	MC+vit С + гидр. казеина +2.4-Д + кинетин	MC+vit B5+vit C+ +2.4-Д+ +кинетин	МС+ 2.4-Д+ +кинетин
	Константа скорости
Листовые	0,02	0,03	0,02	0,02
Черешковые	0,02	0,02	0,03	0,02

Таблица 4 Состав питательных сред, используемых в работе
Компоненты среды	Количество, мг/л (мл/л)
	Мурасиге и Скуга(1)	Мурасиге и Скуга(2)	Мурасиге и Скуга(3)	Potato II
1	2	3	4	5
Макросоли
NH4 NO3	1650	1650	1320	850
KNO3	1900	1900	1520	900
КН 2PO4	170	170	136	100
CaCl2 ·2H2О	440	440	352	200
MgSO4 ·7H2O	370	370	296	200
Микроэлементы
MnSO4·4H 2O	22,3	22,3	44,6	-
Н3ВО 3	6,2	6,2	12,4	-
ZnSO4·7H2O	8,6	8,6	17,2	-
KI	0,83	0,83	1,66	-
CuSO 4·5H2O	0,025	0,025	0,05	-
Na 2MoO4·2H2 O	0,25	0,25	0,5	-
CoCl 2·6H2O	0,025	0,025	0,05	-
Железо
FeSO4·7H 2O	27,8	27,8	27,8	27,8
Na2ЭДТА·2Н 2O	37,3	37,3	37,3	37,3
Органические добавки
Мезоинозит	100,0	100,0	100,0	-
Никотиновая кислота	1,0	1,0	-	-
Тиамин HCl	1,0	10,0	1,6	1,0
Пиридоксин HCl	1,0	1,0	1,0	-
Аскорбиновая кислота	1,0	3,0	3,0	-
Аденин	-	-	0,5	-
Фитогормоны
ИУК (ИМК)	-	-	2,0	-
Кинетин	0,5	1,0	0,5	-
6-БАП	0,5	0,5	-	-
Гиббереллин (ГК3)	-	-	2,0	-
2,4-Д	2,0	4,0	-
Углеводы
Сахароза	30000	20000	20000	30000
Субстрат
Агар-агар	7000	7000	7000	7000
Гидролизат казеина	100	-	-	-
Картофельный экстракт	-	-	-	400
рН после автоклавирования	5,8	5,8	5,8	5,8