способ определения токсичности химических веществ

Формула изобретения

Способ определения токсичности химических веществ, включающий введение лабораторным животным токсического агента, забой животных, приготовление гомогената ткани печени с последующим определением активности фермента, отличающийся тем, что определяют активность фермента лецитин: холестеринацил-трансферазы и по снижению уровня активности фермента в течение 30-180 мин после введения вещества по сравнению с контролем судят о токсичности вещества.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, преимущественное применение найдет в биохимии и токсикологии и может быть использовано для определения токсичности лекарственных препаратов и химических веществ.

Известен способ определения токсичности биологически активных веществ путем введения испытуемых веществ группе подопытных животных и выявления среднесмертельной дозы препарата [1].

Однако известный способ не позволяет точно определить предельно допустимую концентрацию химических веществ.

Известен способ определения токсичности химических веществ путем введения лабораторным животным (мышам) одновременно гидрокортизона и токсического агента с последующим определением активности тирозинаминотрансферазы печени черта 4-8 часов после введения [2].

Недостатком известного способа является его продолжительность, т.e. не менее 8 часов эксперимента, а также сочетанное введение химических веществ.

Наиболее близким к заявляемому является способ определения токсичности химических веществ [3]. Сущность известного прототипа заключается в определении в гомогенате тканей печени лабораторных животных активности фермента ацилазы (N - ацил - DL - аминокислота - аминогидролазы К.Ф. 3.5.1.14.) через 2-4 часа после введения животным токсического вещества. О токсичности вещества судят по достоверному снижению уровня активности фермента по сравнению с контролем.

Целью изобретения является сокращение времени исследования токсичности химических веществ.

Для достижения поставленной цели проводится:

1. Введение токсического агента лабораторным животным.

2. Экспозиция, обеспечивающая развитие токсического действия (30-90 минут).

3. Забой животных, извлечение печени и приготовление гомогената ее тканей.

4. Определение активности фермента лецитин: холестерин ацилтрансферазы (ЛХАТ, К.Ф. 2.3.1.43) в тканях печени по следующей методике: через 30 минут после инкубации рабочей смеси с 0,1 мл исследуемой жидкости при 37°С из нее хлороформ - этанолом экстрагировали липиды, пробы наносили на пластинки Siluphol (Чехия) размером 8×100 мм и проводили одномерную восходящую хроматографию до фронта 80 мм. В качестве контроля использовали экстракт рабочего раствора, инкубированный в тех же условиях без добавления исследуемой жидкости. Для определения ферментативной активности пластинку разрезали пополам (0-50 мм, где остаются субстраты и 50-100 мм, куда продвигаются при хроматографировании эфиры холестерина), счищали носитель с липидами в 2 пробирки, содержащие по 5 мм 10% раствора фосфорномолибденовой кислоты, и нагревали до 80°С в водяной бане. Активность ЛХАТ рассчитывали по формуле:

где Е₀ и Е₁ - экстинции, пропорциональные содержанию липидов в начальной и конечной половинках пластинки;

5000 - пересчетный коэффициент.

Р - концентрация белка в гомогенате.

Пример 1. Группе беспородных белых мышей самцов массой 18-20 г внутрибрюшинно вводился эндотоксин (фирма "Sigma", США S.eridens) в дозе 10 мг/кг веса. Контрольной группе животных вводился физиологический раствор. Опытная группа состояла из 50 животных. Контрольная - 35. Затем животные забивались через 30, 60, 90, 120, 180 минут соответственно. У животных бралась печень, приготовлялся гомогенат тканей органа, в котором определялась активность фермента ацилазы [3] и ЛХАТ по описанной выше методике. Статистическая обработка проводилась по методам вариационной статистики с учетом коэффициента Стьюдента. Результаты эксперимента отражены в табл. №1, 2.

Пример 2. Группе беспородных белых мышей самцов массой 21-23 г внутрибрюшинно вводился тетрахлорметан (ТХМ) в растворе в дозах 1 мл/кг, 4 мл/кг веса. Контрольной группе вводился физиологический раствор. Опытная группа состояла из 50 животных на каждую дозировку вводимого вещества. Затем животные забивались, из печени их готовился тканевой гомогенат, в котором определяли активность ферментов ЛХАТ и ацилазы. Статистическая обработка проводилась аналогичным образом. Данные эксперимента приведены в таблицах №1, 2.

Сущность заключается в использовании другого информативного теста, что и позволяет сократить время исследования токсичности химических веществ, оценить опасность данного вещества на организм и определить степень влияния исследуемого агента на ткани печени и в целом на живой организм.

Данный способ может быть использован в медицине (токсикологии, фармакологии).

Литература:

1. Саноцкий И.В. "Методы определения токсичности и опасности химических веществ", М., 1970.

2. Авторское свидетельство СССР №1163264, МКИ³ G 01 N 33/48; 23.06.85.

3. Авторское свидетельство СССР №1686376, МКИ³ G 01 N 33/68, 23.10.91.

Таблица №1. Активность ЛХАТ печени при токсическом воздействии.
Вещество	30 мин	60 мин	90 мин	120 мин	180 мин
	n=10	n=10	n=10	n=10	n=10
Эндотоксин	10,18+0,3*	8.68+0,17*	7.82+0,2*	7.29+0,24*	6.87+0,31*
ТХМ в дозе:
1 мл/кг	10.71+0,27*	9.07+0.15*	8.17+0,2*	6.37+0,31*	5.92+0,33*
4 мл/кг	9.82+0,29*	8,14+0,19*	7.32+0,27*	5.97+0,38*	5.47+0.41*
Контроль	n=7	n=7	n=7	n=7	n=7
	14.25+0,3	14.06+0,4	14.41+0,22	14,32+0,31	14.17+0,6
n - число животных в эксперименте (группе). Активность фермента ЛХАТ выражалась в мк Кат/г белка.
* - р<0.05.

Таблица №2. Активность ацилазы печени при токсическом воздействии.
Вещество	30 мин	60 мин	90 мин	120 мин	180 мин
	n=10	n=10	n=10	n=10	n=10
Эндотоксин	3.14+0,33	3.11+0,35	2.83+0,46	1.21+0,24*	1.93+0,18*
ТХМ в дозе:
1 мл/кг	3.17+0,44	2.93+0,37	2.51+0,4	1.21+0,23*	1.295+0,26*
4 мл/кг	3.23+0.31	2.89+0,25	2.74+0,37	1.19+0,25*	1,41+0,33*
Контроль	n=7	n=7	n=7	n=7	n=7
	3,5+0,29	3,2+0,31	3.0+0,42	2,9+0,44	3,3+0,25
n - число животных в эксперименте (группе). Активность фермента ацилазы выражалась в ЕД фермента/мг белка.
* - р<0.05.