вещество, обладающее антиоксидантной, геропротекторной и противоишемической активностью, и способ его получения

Формула изобретения

1. Фармацевтически приемлемые соли 2,4,6-триметил-3-гидроксипиридина с низшими дикарбоновыми кислотами, общей формулы 1а-г, обладающие антиоксидантной активностью,

при X, равном простой связи (соединение 1а, оксалат, C₈H₁₁NO·C₂H ₂O₄) при X, равном СН₂ (соединение 1б, малонат, C₈H₁₁NO·C₃ H₄O₄); при X, равном СН₂СН ₂ (соединение 1в, сукцинат, С₈Н₁₁ NO·С₄Н₆O₄); при X, равном группе СН₂СН(ОН), (соединение 1г, малат, C₈ H₁₁NO·C₄H₆O₅ ).

2. Фармацевтически приемлемая соль формулы 1в, как указано в п.1, обладающая геропротекторной и противоишемической активностями.

3. Способ получения солей по п.1, заключающийся в том, что осуществляют взаимодействие эквимолекулярных количеств 2,4,6-триметил-3-гидроксипиридина с дикарбоновой кислотой в растворе низшего спирта при кипячении с последующей обработкой реакционной массы органическим растворителем и, при необходимости, выдержкой в течение 2-5 ч при 10-15°С.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к новым биологически активным соединениям, конкретно к солям 2,4,6-триметил-3-гидроксипиридина с низшими дикарбоновыми кислотами (соединения общей формулы 1 - соединения а-г), обладающими антиоксидантным, геропротекторным и противоишемическим действием. Соединения «а-г» проявляют антиоксидантную активность в отношении процесса перекисного окисления липидов, что свойственно всем производным 3-оксипиридина. Это свойство позволяет предполагать, что соединения «а-г», как и их аналоги, эмоксипин (гидрохлорид 2-метил-6-этил-3-гидроксипиридина) и мексидол (сукцинат 2-метил-6-этил-3-гидроксипиридина), могут быть применены в качестве лечебных средств в офтальмологии, а именно при субконъюктивальных и внутриглазных кровоизлияниях в любые отделы и ткани глаза, ангиоретинопатиях различной этиологии, включая диабетическую, хориоретинальных дистрофиях, тромбозе центральной вены сетчатки и ее ветвей, осложненной миопии, дистрофических кератитах, для защиты и лечения роговицы и сетчатки при воздействии света высокой эффективности, после операций с отслойкой сетчатки. Кроме того, наличие у соединения «в» выраженного противоишемического действия предполагает возможность применения в кардиологии для лечения ишемической болезни сердца и атеросклероза.

Соединение «в» также оказалось активным ингибитором фотоиндуцированного перекисного окисления липидов, сенсибилизированного «старческим пигментом» - липофусциновыми гранулами, выделенными из глаз пожилых людей. Это свидетельствует о том, что это соединение способно нейтрализовать токсическую активность липофусциновых гранул, накапливающихся в пожилом возрасте, т.е. проявлять геропротекторное действие. Исходя из этого можно предполагать, что соединение «в» может быть использовано для инактивации токсического действия липофусцина. Липофусцин, как сейчас общепринято, является основным фактором, приводящим к развитию старческой макулярной дегенерации сетчатки. Старческая макулярная дегенерация сетчатки относится к наиболее распространенным глазным заболеваниям, развивающимся у людей в возрасте свыше 60 лет. Согласно статистическим данным эта болезнь сетчатки, приводящая к полной слепоте, поражает почти 30% американцев в возрасте свыше 65 лет и процент заболевших быстро увеличивается с возрастом.

Известно средство антиоксидантной защиты сред и тканей глаза, которое представляет собой биорастворимый полимер с гидрофильной пластифицирующей добавкой и содержит в качестве лекарственного средства эмоксипин и пиридоксина гидрохлорид (RU 2070010, 1993).

Известна биологически активная пищевая добавка «глутапирон», обладающая в том числе геропротекторным действием, которая в качестве активного вещества содержит соли 2-(2,6-диметил-3,5-диэтоксикарбонил-1,4-дигидропиридин-4-карбоксамидо) глутаровой кислоты (RU 95116403, 1995).

Известно использование дикалиевой соли N-(3-хлоро-1,4-нафтохинонил)-2-глутаминовой кислоты в качестве вещества, проявляющего в том числе противоишемическую активность.

Наиболее близким аналогом к изобретению является сукцинат 2-метил-6-этил-3-гидроксипиридина (мексидол) (М.Д.Машковский, «Лекарственные средства», ч.II, 1993, М.: Медицина, с.216), обладающий антиоксидантным и мембранопротекторным действием, который получают нагреванием спиртового раствора 2-метил-6-этил-3-гидроксипиридина с янтарной кислотой в течение 1 ч (А.с. СССР 509047, 1973 г.).

Задачей изобретения является разработка и создание новых веществ, производных 3-гидроксипиридинового ряда, проявляющих антиоксидантные, геропротекторные и противоишемические свойства и не проявляющие раздражающего действия на ткани глаза.

Сущность изобретения достигается новыми соединениями - фармацевтически приемлемыми солями 2,4,6-триметил-3-гидроксипиридина с низшими дикарбоновыми кислотами, общей формулы 1a-г, обладающими антиоксидантной активностью:

при X, равном простой связи (соединение Ia, оксалат, С9Н11 NO·С2Н2О 4); при X, равном СН2 (соединение Iб, малонат, С9Н11 NO·С3H4O 4); при X, равном CH2CH 2 (соединение Iв, сукцинат, C9H 11NO·C4H6 O4); при X, равном группе СН 2СН(ОН), соединение 1 г, малат, С 9H11NO·C4 Н6O5)

Кроме того, фармацевтически приемлемая соль формулы 1в обладает также геропротекторной и противоишемической активностями.

Задача изобретения решается также способом получения солей 2,4,6-триметил-3-гидроксипиридина, обладающих антиоксидантной, геропротекторной и противоишемической активностями, который включает взаимодействие эквимолекулярных количеств 2,4,6-триметил-3-гидроксипиридина с дикарбоновой кислотой в растворе низшего спирта при кипячении с последующей обработкой реакционной массы органическим растворителем и, при необходимости, выдержкой в течение 2-5 ч при 10-15°С.

Пример 1. Получение органических солей 2,4,6-триметил-3-оксипиридина

А) Получение оксалата 2,4,6-триметил-3-оксипиридина (Ia).

В колбу с магнитной мешалкой и обратным холодильником загружают 0.8 г (0.00583 моль) основания 2,4,6-триметил-3-оксипиридина, 0.525 г (0.00583 моль) безводной щавелевой кислоты и 10 мл метанола. При работающей мешалке реакционную смесь нагревают до кипения и кипятят в течение 0.5 часа. Затем нагревание прекращают, растворитель отгоняют в вакууме, добавляют к реакционной массе 5 мл ацетона, растирают в течение 5-10 мин стеклянной палочкой. Образовавшийся кристаллический осадок отделяют фильтрованием, промывают на фильтре ацетоном, сушат в вакууме. Получают 1.1 г (83% от теории) соли. Т. пл. 140-142°С. Найдено, %: С 53.4, Н 5.9. Вычислено, %: С 52.9, Н 5.8. ЯМР¹H Bruker WM-400 (400 МГц) (DMSO-d ₆): 2,20 (3Н, с, СН₃); 2,34 (3Н, с, СН₃ ); 2,37 (3Н, с, СН₃); 7,05 м.д. (1Н, с, СН).

Б). Получение малоната 2,4,6-триметил-3-оксипиридина (Iб).

В колбу с магнитной мешалкой и обратным холодильником загружают 0.8 г (0.00583 моль) основания 2,4,6-триметил-3-оксипиридина, 0.607 г (0.00583 моль) малоновой кислоты и 10 мл этанола. При работающей мешалке реакционную смесь нагревают до кипения и кипятят в течение 0.5 часа. Затем нагревание прекращают, растворитель отгоняют в вакууме, добавляют к реакционной массе 5 мл ацетона, выдерживают 3 часа при 10-15°С. Образовавшийся осадок растирают, отделяют фильтрованием, промывают на фильтре ацетоном, сушат в вакууме. Получают 1.2 г (85.3% от теории) соли. Т. пл. 118-120°С. Найдено, %: С 55.0, Н 6.5. Вычислено, %: С 54.8, Н 6.3. ЯМР ¹H Bruker WM-400 (400 МГц) (DMSO-d₆): 2,16 (3Н, с, СН₃); 2,30 (3Н, с, СН₃); 2,33 (3Н, с, СН₃); 3,11 (2Н, с, СН₂); 6,93 м.д. (1Н, с, СН).

В) Получение сукцината 2,4,6-триметил-3-оксипиридина (Iв).

В колбу с магнитной мешалкой и обратным холодильником загружают 3.4 г (0.025 моль) основания 2,4,6-триметил-3-оксипиридина, 2.93 г (0.025 моль) янтарной кислоты и 50 мл изопропанола. При работающей мешалке реакционную смесь нагревают до кипения и кипятят в течение 0.5 часа. Затем нагревание прекращают и постепенно добавляют к реакционной массе 30 мл ацетона, выдерживают 3 часа при 10-15°С. Образовавшийся осадок отделяют фильтрованием, промывают на фильтре ацетоном, сушат в вакууме. Получают 5.6 г (88.5% от теории) соли. Т. пл. 128-129°С. Найдено, %: С 56.5, Н 6.9. Вычислено, %: С 56.5, Н 6.7. ЯМР ¹H (ДМСО-d₆): 2.12 (3Н, с, СН₃), 2.26 (3Н, с, СН₃), 2.31 (3Н, с, СН₃), 2.42 (4Н, с, СН₃), 6.79 (1Н, с, СН-Ру), 10.57 (уш.с, СООН).

Г) Получение малата 2,4,6-триметил-3-оксипиридина (г).

В колбу с магнитной мешалкой и обратным холодильником загружают 0.8 г (0.00583 моль) основания 2,4,6-триметил-3-оксипиридина, 0.782 г (0.00583 моль) яблочной кислоты и 10 мл метанола. При работающей мешалке реакционную смесь нагревают до кипения и кипятят в течение 0.5 часа. Затем растворитель удаляют в вакууме. Маслообразный остаток дважды промывают ацетоном при перемешивании, растворитель удаляют декантацией. Полученную массу вакуумируют и выдерживают в течение часа при остаточном давлении 0.5 мм рт.ст., затем оставляют для кристаллизации на 48-72 ч. Получают белое твердое соединение с т.пл.70-75°С. Выход 1.12 г (70.8% от теоретического). Найдено, %: С 53.5, Н 6.4. Вычислено: 53.1. Н 6.3. ЯМР¹ H Bruker WM-400 (400 МГц) (DMSO-d₆): 2,12 (3Н, с, СН₃); 2,26 (3Н, с, СН₃); 2,30 (3Н, с, СН ₃); 3,11 (2Н, с, СН₃); 2,41 (1Н, дублет дубл. J² _HAHB=15,7 Гц; J³ _HACH =5,4 Гц СН_AН_B); 2,58 (1Н, дублет дубл. J² _HAHB=15,7 Гц; J³ _HACH =7,4 Гц СН_AH_B); 4,2 м.д. (1Н, дублет дубл. J³ _CHHA=5,4 Гц; J³ _CHHB =7,4 (1Н, с, СН-Ру).

Пример 2. Геропротекторное действие соединения 1 на примере ингибирования фотоиндуцированной липофусциновыми гранулами человека пероксидации липосом.

Липосомы приготавливали из метанольного раствора кардиолипина (исходная концентрация 5 мг/мл) путем выпаривания метанола и солюбилизации кардиолипина в фосфатном буфере. Смесь, содержащую суспензию липосом и липофусциновых гранул, выделенных из ткани ретинального пигментного эпителия глаза человека, подвергали облучению интенсивным синим светом при постоянном перемешивании. Через 20, 40, 60 и 90 мин определяли концентрацию продуктов пероксидации липидов (ТБК-активных продуктов). Опытная проба содержала либо 2 мМ раствор соединения «в», либо 2 мМ раствор мексидола. Результаты эксперимента приведены в таблице 1.

Таблица 1 Ингибирующее действие соединения «в» (в сравнении с мексидолом) на индуцированную липофусцином фотопероксидацию кардиолипина
Время облучения, мин	Концентрация ТБК-активных продуктов, нмоль/мг липида			Ингибирование, %
	Контроль	Соединение «в»	Мексидол	Соединение «в»	Мексидол
0	1,83	1.83	1,83	0	0
20	3,0	2,42	2,84	20	5
40	3,5	2,53	3,5	28	0
60	4,52	2,85	4,5	40	0
90	5,38	3,28	5,0	40	7

Результаты свидетельствуют о защитном эффекте соединения «в» в отношении фототоксического действия старческого пигмента - липофусциновых гранул глаза человека. Мексидол в этих условиях практически не оказывал ингибирующего действия.

Пример 3. Антиоксидантное действие соединения 1 на индуцированную аскорбатом пероксидацию фоторецепторных клеток глаза свиньи.

Наружные сегменты фоторецепторных клеток получали из сетчаток глаза свиньи по стандартной методике, используя методы дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Смесь, содержащую натрий-фосфатный буфер (рН 7.3), 10⁸ сегментов/мл наружных сегментов фоторецепторных клеток, 0.5 мМ аскорбиновую кислоту и 17 мМ соединения 1в, инкубировали в темноте при постоянном перемешивании в течение 15 и 30 минут. Затем процесс останавливали 15% трихлоруксусной кислотой и определяли концентрацию ТБК-активных продуктов. Контролем служили пробы без добавления соединения «в». Полученные результаты представлены в таблице 2а.

Таблица 2а Ингибирующее действие соединения «в» на аскорбатиндуцированную пероксидацию наружных сегментов фоторецепторных клеток.
Время реакции, мин	Концентрация ТБК-активных продуктов, относит. единицы		Ингибирование, %
	контроль	Соединение «в»
0	1	1	-
15	4,37	2,70	49,6
30	7,04	5,09	32,3

Сравнение антиоксидантной активности соединений «а», «б», «в» и «г» приведены в таблице 2б. В этих экспериментах проведено сравнение скорости аскорбатиндуцированной пероксидации наружных сегментов фоторецепторных клеток глаза свиньи, измеренное по накоплению ТБК-активных продуктов, в присутствии различных солей соединения I.

Таблица 2б Сравнение ингибирующего действия соединений «а», «б», «в», «г» на аскорбатиндуцированную пероксидацию наружных сегментов фото-рецепторных клеток.
Соединение I, концентрация в мМ	Скорость накопления ТБК-активных продуктов за 30 мин реакции, нмоль/мг	Ингибирование, %
Контроль, 0 мМ	0,77	-
Соединение «а», 44 мМ	0	100
Соединение «б», 44 мМ	0,23	70
Соединение «в», 43 мМ	0,05	93,5
Соединение «г», 43 мМ	0,1	87

Результаты свидетельствуют о том, что все соли соединения I проявляют выраженную антиоксидантную активность в отношении темновой пероксидации фоторецепторных клеток глаза.

Пример 4. Определение антирадикальной активности соединения 1в в сравнение с мексидолом.

Эффективность производных 3-гидроксипиридина как ингибиторов свободно радикальных реакций была оценена хемилюминесцентным методом посредством измерения констант скорости их реакции с перекисными радикалами этилбензола k₇.

Измерения интенсивности хемилюминесценции (ХЛ) проводили на установке СНК-7, разработанной и изготовленной в ИХФ РАН СССР. В качестве приемника света использовали фотоумножитель ФЭУ-38. Стационарная концентрация радикалов в процессе окисления кумола обеспечивалась инициатором азо-бис-изобутиронитрилом.

Для усиления свечения ХЛ использовали активатор хелат Eu (тристеноил трифторацетонат европия с 1,10-фенатролином), что позволило проводить измерения при низких значениях скорости инициирования радикалов (W₁=10^-8·10^-9 моль/л.с) и, следовательно, малых добавках препарата. Навеску исследуемых образцов растворяли в подходящем растворителе (хлорбензоле или ацетонитриле), затем небольшое количество приготовленного раствора (0,1-0,25 мл) вводили в реакционную смесь (5-6 мл), помещенную в термостатируемый реакционный сосуд ХЛ-установки, и регистрировали изменение интенсивности свечения. Полученные результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3 Антирадикальная активность р-оксипроизводных азотистых гетероциклов относительно перекисных радикалов этилбензола
Соединение	К7×10-4 л/моль × с
Мексидол	4,5
Соединение Iв	9,5

Сравнительная оценка по антирадикальной активности соединения 1 и мексидола показала, что первый проявляет в два раза более высокую антирадикальную активность.

Пример 5. Исследование влияния соединения «в» на размеры зон ишемии некроза при острой ишемии миокарда.

Эксперименты поставлены на нелинейных крысах самцах массой 250-300 г, наркотизированных этаминалом натрия (40 мг/кг внутрибрюшинно). У животных, переведенных на управляемое дыхание, моделировали инфаркт миокарда перевязкой нисходящей ветви левой коронарной артерии на уровне нижнего края ушка предсердия.

Размеры зоны некроза и зоны ишемии определяли через 4 часа после окклюзии коронарной артерии дифференциальным индикаторным методом, принцип которого основан на раздельном количественном определении синьки Эванса (индикатор зоны ишемии) и красного формазана (индикатор зоны некроза).

Таблица 4 Противоишемическая активность соединения «в» в сравнении с другими производными 3-оксипиридина (через 4 часа после окклюзии коронарной артерии у крыс).

Условия опыта	Доза, мг/кг	Число животных	Отношение зоны некроза к общей массе миокарда (%)	Отношение зоны некроза к зоне ишемии (%)
Контроль	-	17	22±2.0	68±4.3
Соединение 1	16	7	4±2.3	11±3.3
Эмоксипин	26	8	9±2.4	32±4.6
Мексидол	26	8	8±1.4	46±5.6
Никорандил	12	8	10±1.6	42±5.4

Видно, что соединение «в» проявляет значительно более высокую противоишемическую активность по сравнению с другими 3-оксипиридинами.

Пример 6. Исследование местно раздражающего действия соединения «в» на ткани глаза.

Экспериментальные исследования выполнены на шести кроликах. Всем животным однократно произведены инстилляции 1% раствора соединения 1 в правый глаз и 1% раствора эмоксипина в левый глаз. Через 1 минуту после закапывания капель проводили осмотр переднего отрезка глаза методом фокального освещения при помощи лупы в 20Д. Результаты показали, что:

На правых глазах животных реакции со стороны конъюнктивы век и глазного яблока роговой оболочки не обнаружено.

На левых глазах 4 животных наблюдалась выраженная конъюнктивальная инъекция глазного яблока и гиперемия конъюнктивы нижнего века, у двух остальных животных имела место умеренная конъюнктивальная инъекция глаза.

Результаты, таким образом, показывают, что заявляемое соединение I обладает антиоксидантной, геропротекторой и противоишемической активностями и не проявляют местнораздражающего действия на ткани глаза.

Сравнительная оценка антиоксидантных, антирадикальных геропротекторных и противоишемических свойств соединения «в» и широко используемых в медицинской практике препаратов мексидола и эмоксипина свидетельствует о значительно большей эффективности и меньшей токсичности предлагаемого препарата, а также о перспективности его применения в офтальмологической и кардиологической практике и других областях медицины.