штамм дрожжей pichia pastoris 2-2 - продуцент тромбоцитарного фактора роста человека (pdgf-bb) и способ получения тромбоцитарного фактора роста человека
Классы МПК: | C12N1/19 модифицированные введением чужеродного генетического материала C12N15/12 гены, кодирующие животные белки C12P21/02 с известной последовательностью из двух или более аминокислотных остатков, например глутатиона |
Автор(ы): | Игонин Антон Алексеевич (RU), Пальцева Екатерина Михайловна (RU), Уваров Валентин Юрьевич (RU), Иванов Алексей Алексеевич (RU), Соловьев Валерий Владимирович (RU), Акатов Владимир Семенович (RU), Прусакова Ольга Вадимовна (RU), Белецкий Игорь Петрович (RU) |
Патентообладатель(и): | Общество с ограниченной ответственностью "БиоГениус" (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2005-06-02 публикация патента:
27.12.2006 |
Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к получению препарата на основе тромбоцитарного фактора роста человека (PDGF-BB), и может быть использовано в терапевтических, ветеринарных целях, в диагностике, для получения реагентов, для культивирования тканей. Штамм Pichia pastoris 2-2 - продуцент тромбоцитарного фактора роста человека используют в способе получения PDGF-BB. Изобретение позволяет получать димерную форму PDGF-BB с чистотой свыше 95% и удельной активностью в 3-5 ED50 /нг, в сочетании с высоким уровнем экспрессии в дрожжах (до 0.1 г/л культуры). 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 11 ил.
(56) (продолжение):
CLASS="b560m"Opin. Biol. Ther., 2002, v.2, n.2, p.211-218. CRAIG S. et al., Characterization of the structure and conformation of platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) and proteinase-resistant mutants of PDGF-BB expressed in Saccharomyces cerevisiae, Biochem. J., 1992, v.281, Pt 1, p.67-72. RU 2180687 C1, 20.03.2002.
Формула изобретения
1. Штамм дрожжей Pichia pastoris 2-2 - продуцент человеческого рекомбинантного тромбоцитарного фактора роста (PDGF-BB).
2. Способ получения человеческого рекомбинантного тромбоцитарного фактора роста (PDGF-BB) в клетках дрожжей Pichia pastoris, включающий культивирование штамма дрожжей Pichia pastoris по п.1 в условиях, обеспечивающих экспрессию белка PDGF-BB в культуральную среду, извлечение белка PDGF-BB из культуральной среды и его очистку.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что очистку PDGF-BB проводят путем концентрирования и ионообменной хроматографии на КМ-сефарозе.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что после концентрирования проводят тепловую денатурацию путем кратковременного прогревания препарата PDGF-BB на водяной бане при 100°С.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что после ионообменной хроматографии дополнительно проводят аффинную колоночную хроматографию на металлохелатном сорбенте.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к области биотехнологии и генетической инженерии и может быть использовано при производстве препаратов на основе человеческого тромбоцитарного фактора роста (PDGF-BB).
Тромбоцитарный фактор роста человека представляет собой сильноосновной белок с подвижностью в ПААГ-SDS, соответствующей молекулярной массе 28-39 kDa. Белок состоит из двух идентичных полипептидных цепей (В-цепь), соединенных дисульфидными связями. Синтез и процессинг PDGF-BB осуществляется в мегакариоцитах - клетках костного мозга, предшественниках тромбоцитов - и запасается в альфа-гранулах кровяных пластинок. Пока тромбоцитарный фактор роста находится внутри тромбоцитов, он недоступен для других клеток, однако при взаимодействии с тромбином происходит активация кровяных пластинок с последующим высвобождением содержимого в сыворотку. Кровяные пластинки являются главным источником тромбоцитарного фактора роста в организме, но вместе с тем показано, что некоторые другие клетки, в основном клетки мезенхимального происхождения, также могут синтезировать и секретировать этот фактор (Heldin С.Н., Westermark В. 1999, 79(4): 1283-1316). Секретируемый PDGF-BB индуцирует направленное перемещение (хемотаксис) лейкоцитов полиморфноядерных нейтрофилов (осуществляющих защиту от гноеродных бактерий), гранулоцитов, макрофагов. Для стимуляции их направленного движений достаточно внешней концентрации PDGF 1-2 нг/мл (Siegbahn A. Et al., J.Clin. Invest., 1990, 85(3):916-920). Далее в процесс вовлекаются клетки соединительной ткани, ответственные за образование рубца: стимулируются пролиферация фибробластов и их направленное перемещение, а также синтез и секреция белков внеклеточного матрикса.
В настоящее время препараты тромбоцитарного фактора роста человека (Becaplermin = 0.01% Regranex gel) применяются для ранозаживления (Nagai & Embil, Expert. Opin. Biol. Ther., 2002, Feb; 2 (2):211-218). Ограничительным моментом использования препаратов, содержащих PDGF-BB, является их высокая цена, обусловленная дорогостоящими технологиями. Поэтому разработка оптимальных методов получения тромбоцитарного фактора роста является приоритетной задачей в настоящее время. Важными проблемами при создании эффективного способа получения PDGF-BB являются недостаточно высокий уровень экспрессии биологически активного белка и низкая степень димеризации синтезируемых полипептидных В-цепей. На решение этих задач и направлено предложенное изобретение.
Предшествующий уровень техники
Как уже было сказано, молекула тромбоцитарного фактора роста человека состоит из двух идентичных полипептидных цепей (В-цепей), соединенных дисульфидными связями. Как было установлено, PDGF-B-цепь подвергается протеолитическому процессингу в процессе созревания, образуя конечный продукт, состоящий из 109 аминокислот. В настоящее время известны способы получения тромбоцитарного фактора роста человека в бактериальных и дрожжевых экспрессионных системах. В клетках E.coli удалось достичь высоких уровней экспрессии белка - предшественника PDGF-BB, однако в указанных бактериальных клетках отсутствуют протеазы, участвующие в процессе созревания белка. Поэтому для получения зрелой формы белка тромбоцитарного фактора роста появляется необходимость в проведении дополнительных стадий способа, что приводит к значительному повышению стоимости конечного продукта. В клетках дрожжей, в отличие от E.coli, имеются протеазы, способные расщеплять рекомбинантный белок и приводить, таким образом, к появлению зрелого белка. Поэтому использование клеток дрожжей для экспрессии и секреции PDGF-BB вполне оправдано. В настоящий момент предложены способы получения рекомбинантных аналогов PDGF в клетках дрожжей S.cereviside (патенты US 4766073, опубл. 23.08.1989, и US 4845075, опубл. 04.07.1989). В патенте US 4766073 описывается способ получения в дрожжах рекомбинантного димерного белка, гомологичного А- и В- цепям PDGF. В патентном документе US 4845075 раскрывается получение в дрожжевых клетках димерного полипептида, гомологичного PDGF-BB. Вместе с тем было обнаружено, что в дрожжевых системах протеазы могут расщеплять рекомбинантный PDGF-B не только в нужных сайтах, обусловливающих созревание белка, но и в других участках аминокислотной последовательности. В связи с чем встают проблемы оптимизации кодонов и возможности использования укороченных последовательностей В-цепи. Кроме того, уровни экспрессии рекомбинантных белков в дрожжах заметно ниже, чем в клетках E.coli. В связи с этим возникает необходимость разработать стратегию, обеспечивающую высокий уровень экспрессии биологически активной зрелой формы белка человеческого тромбоцитарного фактора роста.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение направлено на создание штамма Pichia pastoris - суперпродуцента тромбоцитарного фактора роста человека и на способ получения рекомбинантного PDGF-BB с использованием этого штамма. Использование для гетерологичной экспрессии метилотрофных дрожжей Pichia pastoris представляет особый интерес. Достоинствами этих дрожжей является накопление значительной биомассы при культивировании на недорогих минеральных питательных средах и более высокий уровень синтеза рекомбинантных белков (Sreekrishna К. et al., J.Basic.Microbiol, 1988, v.28, р.265-278).
Задачей настоящего изобретения является разработка эффективного способа получения зрелой димерной формы PDGF-BB с высоким выходом во внеклеточную среду в дрожжевой экспрессионной системе.
Технический результат состоит в получении устойчивого штамма Р.pastoris 2-2 - суперпродуцента димерной формы PDGF-BB и в создании высокоэффективного, упрощенного способа получения PDGF-BBC чистотой свыше 95% и удельной активностью в 3-5 ED50/НГ.
Поставленная задача решается путем создания ДНК-конструкции, pGAPZA-PDGFbb, следующего состава:
5' - P-SP-PDGFb-AP-6xHis - 3', где
Р - промоторная последовательность гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы или гена алкоголь оксидазы;
SP - нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнальный пептид Saccharomyces cerevisiae, -фактор;
PDGFb - нуклеотидная последовательность гена тромбоцитарного фактора роста-b человека;
АР - синтетическая последовательность, кодирующая пептид, способствующий димеризации полипептидов;
6xHis - последовательность, кодирующая 6 остатков гистидина, формирующих металл-связывающий сайт, которую используют для получения штамма Р.pastoris 2-2 суперпродуцента PDGF-BB.
Последовательность PDGFB получали путем реакции обратной транскрипции и последующей ПЦР. В качестве матрицы использовали мРНК человеческих диплоидных фибробластов. Амплифицированный фрагмент клонировали в вектор pUC 128 и секвенировали (фиг.1). кДНК PDGF-B в pUC128 использовали для последующего клонирования в дрожжевые экспрессионные вектора рР1С9К и pGAPZA, несущие синтетическую последовательность, кодирующую домен димеризации полипептидов (АР), и последовательность, кодирующую 6 остатков гистидина (6xHis) (фиг.2). Затем отбирались конструкции, кодирующие аминокислотную последовательность зрелого белка и отличающиеся присутствием или отсутствием AP-6xHis доменов в составе конечного продукта. Для получения штамма-продуцента PDGF-BB созданными ДНК-конструкциями трансформировали компетентные клетки штаммов Pichia pastories X33 (дикий тип), GS115 (his4 генотип) и КМ71 (his4, aox1:arg4 генотип) и проводили их тестирование на способность к эффективной экспрессии зрелой димерной формы PDGF-BB.
Контроль экспрессии тромбоцитарного фактора роста человека осуществляли путем электрофоретического разделения белков в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) с последующим переносом их на нитроцеллюлозную мембрану (Western blot) и селективным окрашиванием рекомбинантного белка с помощью антител к PDGF-BB (фиг.3). По результатам тестирования был отобран штамм Pichia pastoris 2-2 - суперпродуцент PDGF-BB, который экспрессировал в культуральную среду тромбоцитарный фактор роста с образованием димерной формы, при этом выход белка составлял 70-100 мкг/л.
Полученный штамм Pichia pastoris 2-2 - продуцент человеческого рекомбинантного тромбоцитарного фактора роста человека характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки. Клетки округлой, слегка овальной формы, размером около 5 мкм, часть клеток имеет на поверхности почки или соединена с дочерними клетками.
Культуральные признаки.
Клетки хорошо растут на полной органической среде YEPD - 2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы или 1% глицерина.
Кроме того, клетки хорошо растут на минеральной среде SC: 1,34% Yeast Nitrogen Base ("Difco", США), 2% глюкозы (1% глицерина, 0,5% метанола), а также на других синтетических средах для дрожжей.
При росте на твердых средах клетки образуют гладкие, круглые колонии с матовой поверхностью, белого цвета, край ровный.
При росте в жидких средах образуют интенсивную ровную суспензию. Культура имеет характерный запах метилотрофных дрожжей.
Время удвоения числа клеток в процессе их роста в суспензии в среде YPD составляет 2 часа. Культура клеток в среде YPD без подпитки вырастает до плотности 35-40 OD600.
Физиолого-биохимические признаки.
Клетки растут в пределах от 4 до 37°C. Оптимальной температурой выращивания является 28-30°C. Температуры выше 32°C неблагоприятны для продуктивности. При росте в аэробных условиях клетки незначительно защелачивают среду. Оптимум рН для роста составляет 4,5-7,0.
В качестве источника углерода клетки могут использовать многие простые соединения, такие как: глюкоза, глицерин, метанол.
В качестве источника азота клетки могут использовать минеральные соли в аммонийной форме, аминокислоты, мочевину.
Клетки способны к аэробному и анаэробному росту. Продуктивность зависит от содержания кислорода в среде.
В качестве источника углерода клетки могут использовать многие простые соединения, такие как: глюкоза, глицерин, метанол.
Клетки способны к аэробному и анаэробному росту.
Полученные клетки штамма дрожжей Pichia pastoris 2-2 продуцируют PDGF-BB в количестве 70-100 мкг/л культуральной среды.
Полученный штамм хранится в коллекции ООО «Биогениус»
Согласно изобретению штамм дрожжей Pichia pastoris 2-2, трансформированный вышеописанной ДНК-конструкцией, использовали в способе получения человеческого рекомбинантного тромбоцитарного фактора роста. Предложенный способ предусматривает стадию культивирования штамма дрожжей Pichia pastoris 2-2 в условиях, обеспечивающих экспрессию белка PDGF-BB в культуральную среду. Клетки из выросших на селективной среде колоний переносили в колбы и культивировали в 5 мл среды YPD на качалке (250 rpm) в течение 3 суток до OD600 30-35. После этого клетки осаждали центрифугированием при 3000 g 10 мин. Супернатант отбирали и 10 мкл смешивали с sample-буфером и проводили электрофорез в SDS-PAAG для анализа экспрессии PDGF-BB. Затем производили извлечение белка PDGF-BB из культуральной среды и его очистку известными способами (концетрирование, аффинной хроматографией и т.п.). Для упрощения выделения и очистки рекомбинантного белка в его состав были введены гексагистидиновые последовательности, позволяющие очистить его в одну стадию с помощью аффинной хроматографии на металлохелатном сорбенте (фиг.4). Полученный PDGF-BB очищали путем концентрирования и проведения колоночной хроматографии - ионообменной на КМ-сефарозе и/или аффинной хроматографии на металлохелатном сорбенте. Аффинную храмотографию проводили с сорбентом на основе нитрилуксусной кислоты, заряженным ионами Ni 2+ (смола His-bind (Novagen Inc., USA)), который используется для связывания белков, имеющих рядом расположенные гистидиновые остатки. Для увеличения времени жизни (работоспособности) ионообменной и/или аффинной смолы, а также повышения степени очистки, в процесс очистки PDGF-BB после концентрирования включают стадию тепловой денатурации белка путем прогревания концентрированного препарата PDGF-BB на водяной бане при 100°С в течение 2-х минут (фиг.5). Активность полученной рекомбинантной формы PDGF-BB проверяли несколькими способами (Raines E.W., Ross R.J. Biol. Chem., 1982, 257(9):5154-5160) (фиг.6). В первом варианте клетки высевали в 96 луночные планшеты (плотность посева 10 тыс./см2 ) в среде с 10% сыворотки, культивировали 5 сут до истощения ростфакторов в среде, затем добавляли образцы, либо 10% сыворотки. Через 20 ч сменяли среду на свежую с 5% FCS и 14С-тимидином, еще через 2 ч клетки фиксировали ТХУ и определяли радиоактивность образцов. Другой способ заключался в том, что клетки высевали в 96 луночные планшеты (плотность посева 10 тыс./см2 , OD 0.15-0.2) в среде с 10% сыворотки, через сутки делали замену среды на свежую с различным содержанием сыворотки, культивировали 2 суток, фиксировали и окрашивали кристаллическим фиолетовым, заливали 1% раствором ДМСО и фотометрировали (570 нм). Для оценки хемотаксической активности культуру гладкомышечных клеток, полученную из аорты крысы линии Wistar, высевали на девитализированные стенки аорты свиньи, предварительно инкубированные в среде ДМЕ с 2% супернатанта культуры трансформированных дрожжевых клеток Pichia pastoris, продуцирующих PDGF ВВ. После культивирования ткани с посеянными клетками окрашивали смесью красителей Hoechst 33342 и этидиум бромид, и на люминесцентном микроскопе оценивали число живых клеток, мигрировавших в тканевой матрикс.
Таким образом, согласно изобретению, созданная ДНК-конструкция в составе штамма Pichia pastoris 2-2 позволяет получать димерную форму рекомбинантого PDGF-BB с чистотой выше 95% и удельной активностью в 3-5 ED 50/нг, в сочетании с высоким уровнем экспрессии в дрожжах (до 0.1 г/л культуры). Дополнительно включение АР-и 6xHis-доменов в использованную ДНК-конструкцию привело к значительному упрощению выделения рекомбинантного белка за счет использования высокотехнологичной аффинной хроматографии на металлохелатном носителе.
На фиг.1 представлена нуклеотидная последовательность PDGF-B; на фиг.2 - физическая карта плазмиды, содержащей полученную ДНК-конструкцию; на фиг.3 - результаты анализа белков, полученных от различных штаммов; на фиг.4 - результаты электрофореза и иммунохимического анализа PDGF-BB, очищенного с помощью металло-аффинной смолы; на фиг.5 - эффект тепловой денатурации концентрированной культуральной среды, содержащей PDGF-BB; на фиг.6 - результаты электрофореза и иммунохимического анализа PDGF-BB, очищенного с помощью ионообменной хроматографии на КМ-сефарозе; на фиг.7 - результаты определения активности PDGF-BB, полученного из заявленного штамма.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Клонирование кДНК-PDGFB
Последовательность PDGFB была получена с помощью реакции обратной транскрипции и последующей ПЦР в присутствии праймеров PDGFB-1 (5'-ATA GGA ТСС ATG ААТ CGC TGC TGG GC 3') и PDGFB-2 (5'- TAT CTC GAG GGC ТСС AAG GGT CTC С 3'). В качестве матрицы использовали мРНК человеческих диплоидных фибробластов. Амплифицированный фрагмент клонировали в вектор pUC 128 (Invitrigene) и секвенировали. Полученная последовательность имела следующий состав:
GGATCCATGAATCGCTGCTGGGCGCTCTTCCTGTCTCTCTGCTGCT ACCTGCGTCTGGTCAGCGCCGAGGGGGACCCCATTCCCGAGGAGCTTTATG AGATGCTGAGTGACCACTCGATCCGCTCCTTTGATGATCTCCAACGCCTGC TGCACGGAGACCCCGGAGAGGAAGATGGGGCCGAGTTGGACCTGAACATG ACCCGCTCCCACTCTGGAGGCGAGCTGGAGAGCTTGGCTCGTGGAAGAAG GAGCCTGGGTTCCCTGACCATTGCTGAGCCGGCCATGATCGCCGAGTGCAA GACGCGCACCGAGGTGTTCGAGATCTCCCGGCGCCTCATAGACCGCACCA ACGCCAACTTCCTGGTGTGGCCGCCCTGTGTGGAGGTGCAGCGCTGCTCCG GCTGCTGCAACAACCGCAACGTGCAGTGCCGCCCCACCCAGGTGCAGCTG CGACCTGTCCAGGTGAGAAAGATCGAGATTGTGCGGAAGAAGCCAATCTT TAAGAAGGCCACGGTGACGCTGGAAGACCACCTGGCATGCAAGTGTGAGA CAGTGGCAGCTGCACGGCCTGTGACCCGAAGCCCGGGGGGTTCCCAGGAG CAGCGAGCCAAAACGCCCCAAACTCGGGTGACCATTCGGACGGTGCGAGT CCGCCGGCCCCCCAAGGGCAAGCACCGGAAATTCAAGCACACGCATGACA AGACGGCACTGAAGGAGACCCTTGGAGCCCTCGAG
(жирным шрифтом выделены последовательности праймеров)
кДНК PDGF-B в pUC 128 использовали для последующего клонирования в дрожжевые экспрессионные вектора рР1С9К и pGAPZA (Invitrogene), несущие синтетическую последовательность, кодирующую домен димеризации полипептидов (АР), и последовательность, кодирующую 6 остатков гистидина (6xHis): -CATCATCATCATCATCAT-. Были выбраны конструкции, кодирующие аминокислотную последовательность зрелого белка и отличающиеся присутствием или отсутствием AP-6xHis доменов в составе конечного продукта. Были использованы праймеры PDGFBB-1 (5'-АТА GAA TTC AGC CTG GGT ТСС СТО АСС 3'), PDGFBB-2 (5'-ATA GCG GCC GCG GTC ACT CGA GTT TGG 3') в одном случае (AP-6xHis домены) и PDGFBB-1 (5'-АТА GAA TTC AGC CTG GGT ТСС CTG АСС 3'), PDGFBBS-2 (5'-ATA GCG GCC GCC TAG GTC ACT CGA G 3') в другом (без AP-6xHis доменов).
Пример 2. Подготовка клеток к трансформации
Были проведены культивирование и заморозка 3 штаммов клеток Pichia pastoris, дикий тип ХЗЗ, GS115 (his4 генотип), КМ71 (his4, aox1:arg4 генотип). Клетки высевали в стерильных условиях на агар в среде YPD (1%-ный дрожжевой экстракт, 2%-ный пептон, 2%-ная глюкоза, 1 мМ дитиотрейтол), культивировали при 30°С, затем пересевали в суспензию и культивировали ночь. Время удвоения числа в среде YPD всех клонов составляло 2 часа. Часть клеток суспендировали в YPD среде с добавлением 15% глицерина и замораживали при -86°С. Для получения компетентных клеток предварительно выращивали колонии клеток в чашке с агаром в YPD среде при 30°С в течение 2 дней. Затем содержимое одной колонии выращивали в 10 мл YPD среды при 30°С в течение ночи. Разбавляли суспензию в YPD до плотности ОД600 0.2 и конечного объема 10 мл и выращивали культуру до ОД600 0-8 в течение 4 часов. Суспензию клеток центрифугировали 5 мин при 500 g, выливали супернатант, суспендировали в 10 мл раствора I из указанного ниже набора для трансформации, вновь центрифугировали и суспендировали осадок в растворе I, после чего клетки были компетентны к трансформации. Аликвоты компетентных клеток по 50-200 1 разливали в стерильные пробирки объемом 1.5 мл, которые хранили при температуре -86°С до использования.
Пример 3. Трансформация компетентных клеток.
Для трансформации использовали EasyComp Transformation Kit, входящий в состав Pichia Easy Select Kit (Invitrogen).
К 50 1 компетентных клеток добавляли 3 g (в 4 1) ДНК-конструкции, 1 мл раствора II из набора, перемешивали встряхиванием, инкубировали в течение 1 часа при 30°С, перемешивая раствор каждые 15 мин. Затем раствор инкубировали 10 мин при 42°С, разделяли на 2 микропробирки по 525 1, добавляли в каждую по 1 мл среды YPD и инкубировали 60 мин при 30°С для приобретения клетками резистентности к зеоцину. После этого клетки центрифугировали 5 мин при 3000g, ресуспендировали в растворе III, добавляя его в каждую пробирку по 500 1, сливали суспензию из 2 пробирок в одну, вновь центрифугировали и ресуспендировали осадок в 150 мл раствора III. Полученную суспензию клеток рассевали в стерильную чашку (80 мм) на агаровый гель, приготовленный на среде YPD с добавлением 1М сорбитола (YPDS) и антибиотика зеоцина в конечной концентрации 100 мкг/мл. Через 3 суток получали несколько десятков колоний на чашку. Клетки из колоний, а также клетки Х33, трансформированные «пустым», т.е. не содержащим вставку вектором, переносили на чашку с MMD (minimal medium dextrose)-агаром, расчерченную на 50 пронумерованных квадратов, и культивировали чашку 2 дня при 30°C. После этого чашку с культурами использовали для выращивания клеток в суспензии и их последующего тестирования.
Пример 4. Контроль экспрессии рекомбинантного белка в полученных штаммах.
Контроль экспрессии PDGF осуществляли путем электрофоретического разделения белков в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) с последующим переносом их на нитроцеллюлозную мембрану (Western blot) и селективным окрашиванием рекомбинантного белка с помощью антител к PDGF-BB. Для этого клетки из выросших на селективной среде колоний переносили в колбы и культивировали в 5 мл среды MGY на качалке (250 rpm) в течение 1 суток до OD600 5. После этого клетки осаждали центрифугированием при 3000 g 10 мин. Для электрофореза использовали оборудование фирмы Bio-Rad и реактивы ICN. Супернатант и внутриклеточные белки (лизат клеток) смешивали с буфером для нанесения и вносили по 10 мкл в лунки концентрирующего геля. Разделение осуществлялось при напряжении 150В в течение часа. Затем гель аккуратно извлекали и осуществляли перенос белковых полос из геля на нитроцеллюлозную мембрану с помощью аппарата фирмы Bio-Rad по стандартному протоколу. После окончания переноса мембрану окрашивали с помощью антител согласно рекомендациям производителя (Amersham Biosciences). Были отобраны штаммы, для которых выявлено наличие на электрофореграммах полос, соответствующих молекулярной массе PDGF-B и окрашенных антителами к PDGF-BB, что указывает на продукцию PDGF-BB. Уровень синтеза белка PDGF-BB определяют, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка - стандарта молекулярной массы. В результате из 20 штаммов-продуцентов, согласно полученным данным (см. фиг.3), был отобран штамм Pichia pastoris 2-2, клетки которого синтезируют 70-100 мг белка на литр культуры дрожжей.
Пример 5. Очистка рекомбинантного PDGF-BB и оценка биологической активности.
1) Концентрирование. После осаждения клеток среду культивирования фильтровали через фильтр с диаметром пор 45 мкм, затем добавляли Трис-HCl рН 6.0 до конечной концентрации 20 мМ. Среду культивирования, содержащую белок PDGF-BB, концентрировали в 5-10 раз, используя концентраторы для белков с молекулярной массой более 10 кДа фирмы "Millipore".
2) Тепловая денатурация. После концентрирования препарат PDGF-ВВ нагревали на водяной бане до кипения (t=100°C) и кипятили 2 минуты, после чего центрифугировали при 4°С, 15000×g 15 минут.
3) Ионообменная хроматография на КМ-сефарозе. Колонку с КМ-сефарозой уравновешивали буфером, содержащим 20 мМ Трис-HCl рН 6.0. Препарат PDGF-BB наносили со скоростью 60 мл/час. Колонку промывали 20 мМ Трис-HCl рН 6.0; 20 мМ Трис-HCl рН 6.0, 200 мМ NaCl. Элюцию проводили 20 мМ Трис-HCl рН 6.0, 1 М NaCl и собирали фракции по 1 мл.
4) Аффинная хроматография на колонке со смолой His-bindR. Колонку с носителем промывали буфером, содержащим 50 мМ фосфат рН 8.0, 500 mM NaCl. Препарат PDGF-BB, полученный после концентрирования или ионообменной хроматографии, разбавляли в 2 раза, добавляли фосфат рН 8.0 до концентрации 50 мМ и наносили на колонку. После промывки колонки буфером нанесения балластные белки удаляли промывкой раствором 20 мМ имидазола в том же буфере. PDGF-BB элюировали раствором, содержащим 200 мМ имидазола.
5) Оценка биологиченской активности
А) Клетки высевали в 96 луночные планшеты (плотность посева 10 тыс./см2) в среде с 10% сыворотки, культивировали 5 сут до истощения ростфакторов в среде, затем добавляли образцы, либо 10% сыворотки. Через 20 ч сменяли среду на свежую с 5% FCS и 14С-тимидином, еще через 2 ч клетки фиксировали ТХУ и определяли радиоактивность образцов.
Б) Клетки высевали в 96 луночные планшеты (плотность посева 10 тыс./см2 , OD 0.15-0.2) в среде с 10% сыворотки, через сутки делали замену среды на свежую с различным содержанием сыворотки, культивировали 2 суток, фиксировали и окрашивали кристаллическим фиолетовым, заливали 1% раствором ДМСО и фотометрировали (570 нм).
В) В результате был получен припарат человеческого рекомбинантного тромбоцитарного фактора роста (PDGF ВВ) с чистотой свыше 95% и удельной активностью 3-5 ED50/нг. Для оценки хемотаксической активности культуру гладкомышечных клеток, полученную из аорты крысы линии Wistar, высевали на девитализированные стенки аорты свиньи, предварительно инкубированные в среде ДМЕ с 2% супернатанта культуры трансформированных дрожжевых клеток Pichia pastoris, продуцирующих PDGF ВВ. После культивирования ткани с посеянными клетками окрашивали смесью красителей Hoechst 33342 и этидиум бромид, и на люминесцентном микроскопе оценивали число живых клеток, мигрировавших в тканевой матрикс.
Одним из преимуществ предлагаемого способа получения рекомбинантного PDGF-BB является также высокая технологичность процесса очистки белка, обусловленная простыми процедурами выделения, относительно невысокой стоимостью используемых смол и высоким выходом активного белка в результате очистки.
Суммируя вышесказанное можно заключить, что полученный штамм дрожжей Pichia pastoris 2-2 синтезирует PDGF-BB в количестве, достаточном для его выделения в промышленном масштабе. В результате полученный высококачественный рекомбинантный PDGF-BB, может быть пригоден в качестве фармацевтического препарата для лечения дефектов мягких тканей и кожных покровов любой локализации и любого происхождения (инфекционные, травматические, ожоговые, последствия хирургического вмешательства и т.д.).
Класс C12N1/19 модифицированные введением чужеродного генетического материала
Класс C12N15/12 гены, кодирующие животные белки
Класс C12P21/02 с известной последовательностью из двух или более аминокислотных остатков, например глутатиона