способ получения аффинного адсорбента для фракционирования целлюлолитических ферментов

Формула изобретения

1. Способ получения аффинного адсорбента для фракционирования целлюлолитических ферментов, предусматривающий получение брушита из кальция хлорида, путем обработки его гидрофосфатом натрия, фильтрование брушита, его 4-кратную промывку водой и суспендирование в дистиллированной воде, отличающийся тем, что суспензию брушита обрабатывают раствором Na-КМЦ при массовом соотношении от 2:1 до 1:1, перемешивают в течение 10 мин, после чего добавляют 40%-ный раствор гидроксида натрия до установления рН 13, с последующим кипячением смеси в течение 1 ч до осаждения целевого продукта, отделением его и высушиванием.

2. Способ получения аффинного адсорбента для фракционирования целлюлолитических ферментов, отличающийся тем, что кристаллический гидроксиапатит суспендируют в дистиллированной воде, активируют раствором ортофосфорной кислоты при рН от 4,0 до 4,5, перемешивают в течение 10 мин, обрабатывают раствором Na-КМЦ при массовом соотношении 2:1 до 1:1, перемешивают в течение 10 мин, после чего добавляют 40%-ный раствор гидроксида натрия до установления рН 13, с последующим кипячением смеси в течение 1 ч до осаждения целевого продукта, отделением его и высушиванием.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии ферментных препаратов, может быть использовано для очистки и фракционирования целлюлолитических ферментов и касается способа получения аффинного адсорбента на основе гидроксиапатита.

Известен способ получения гидроксиапатита (прототип), включающий стадию получения брушита (СаНРО ₄) путем медленного сливания 0.5М растворов CaCl ₂ и Na₂HPO₄ (по 2 л), фильтрование брушита, его 4-кратную промывку тремя литрами воды, обработку суспензии брушита в 3 л воды 100 мл 40%-ного NaOH при кипячении в течение 1 часа (нагрев 45 мин) при постоянном медленном перемешивании, отделение гидроксиапатита от очень мутного супернатанта фильтрованием, 4-кратную промывку гидроксиапатита тремя литрами воды, 2-кратную обработку 0.01М фосфатным буфером (рН 6.8) при нагревании до 100°C и 2-кратную обработку 0.001М фосфатным буфером (рН 6.8) при кипячении в течение 15 мин (Справочник биохимика: Пер. с англ. / Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. - М.: Мир, 1991. - С.463).

Недостатками адсорбента, получаемого по данному способу, является низкая избирательность адсорбции целлюлолитических ферментов. Поэтому при фракционировании экзо- и эндоглюканаз на колонках необходимо использовать ступенчатый или линейный градиент концентрации буфера, а при разделении экзо- и эндоглюканаз с помощью адсорбции в объеме - ступенчатую промывку адсорбента, что усложняет процесс фракционирования.

Технический результат настоящего изобретения заключается в получении аффинного адсорбента на основе гидроксиапатита с высокой избирательностью адсорбции экзоглюканаз.

Технический результат достигается путем химического присоединения к поверхности гидроксиапатита субстрата целлюлолитических ферментов, например натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы.

Способ осуществляют следующим образом. Проводят стадию получения брушита путем медленного сливания растворов CaCl₂ и Na₂HPO ₄ аналогично тому, как это описано в прототипе. Для получения аффинного адсорбента к суспензии брушита добавляют раствор натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ) в пропорции от 2:1 до 1:1 по сухому веществу, доводят рН среды до 13.0 раствором гидроксида натрия и нагревают реакционную смесь в кипящей водяной бане в течение 1 часа при постоянном медленном перемешивании.

Для получения аффинного гидроксиапатита (адсорбента) может быть использован кристаллический гидроксиапатит. В этом случае предварительно проводят его активацию путем обработки орто-фосфорной кислотой при рН среды от 4.0 до 4.5.

При нагревании брушита в сильнощелочной среде в присутствии Na-КМЦ происходит образование гидроксиапатита, при этом гидроксильные группы Na-КМЦ включаются в его кристаллическую решетку. Это приводит к присоединению Na-КМЦ к поверхности гидроксиапатита. Поперечная сшивка частиц гидроксиапатита полимерными цепями Na-КМЦ способствует образованию ограниченно набухающего в воде материала.

Пример 1. К 1470.6 см³ 0.5М раствора CaCl₂ медленно приливают при перемешивании 1470.6 см³ 0.5М раствора Na ₂HPO₄ (стехиометрический выход брушита 100 г). Брушит отфильтровывают, проводят его 4-кратную промывку тремя литрами воды и суспендируют в 1.0 дм³ дистиллированной воды. К суспензии брушита приливают 500 см ³ раствора Na-КМЦ с массовой концентрацией 100 г/дм ³, перемешивают в течение 10 минут, после чего добавляют 40%-ный раствор гидроксида натрия до установления рН среды 13.0. Смесь помещают в кипящую водяную баню и выдерживают в течение 1 часа до осаждения целевого продукта и получения прозрачной надосадочной жидкости. Образовавшуюся массу отделяют от раствора центрифугированием или фильтрованием, высушивают при 110°C и размалывают.

Пример 2. Аналогично примеру 1, добавляя к суспензии брушита 1000 см³ раствора Na-КМЦ с массовой концентрацией 100 г/дм³.

Пример 3. К суспензии 100 г гидроксиапатита (фракция от 100 до 250 мкм) в 1000 см³ дистиллированной воды приливают раствор ортофосфорной кислоты до установления рН среды от 4.0 до 4.5 и перемешивают в течение 10 минут для активации гидроксиапатита. Далее приливают 500 см раствора Na-КМЦ с массовой концентрацией 100 г/дм³, перемешивают в течение 10 минут, после чего добавляют 40%-ный раствор гидроксида натрия до установления рН среды 13.0. Смесь помещают в кипящую водяную баню и выдерживают в течение 1 часа до осаждения целевого продукта и получения прозрачной надосадочной жидкости. Образовавшуюся массу отделяют от раствора центрифугированием или фильтрованием, высушивают при 110°C и размалывают.

Пример 4. Аналогично примеру 3, добавляя к суспензии гидроксиапатита после активации 1000 см³ раствора Na-КМЦ с массовой концентрацией 100 г/дм³.

Емкость адсорбентов по эндо- и экзоглюканазам определяют адсорбцией в объеме. Для этого порцию раствора ферментного препарата Целловиридин Г20х после диафильтрации против 2000 дм³ 0.01М ацетатного буфера обрабатывают навеской адсорбента при перемешивании в течение 30 мин и 4°C. Адсорбент отфильтровывают и определяют активности ферментов в растворах. Емкость адсорбентов по эндо- и экзоглюканазам рассчитывают по разности суммарных активностей растворов до и после обработки.

Единица эндоглюканазной активности соответствует количеству фермента, приводящему к снижению относительной вязкости 0.3%-ного раствора Na-КМЦ, равному 1 мин^-1 , при рН 4.5 и 30°C.

Единица экзоглюканазной активности соответствует количеству фермента, приводящему к расщеплению хроматографической бумаги с образованием 1 мг глюкозы за 1 час при рН 4.5 и 50°C. Характеристики адсорбентов, полученных по примерам 1-4, приведены в таблице 1.

Таблица 1
Пример	Выход, % от массы адсорбента	Насыпная плотность, г/см3	Набухаемость*, см3 /г	Фильтрующие свойства**, мл/см 2×час	Емкость по эндоглюканазе, ед/г	Емкость по экзоглюканазе, ед/г
1.	124.3	0.89	5.85	76.6	-	212.3
2.	142.3	0.9	9.78	62.7	-	238.0
3.	117.3	0.77	8.67	47.5	-	243.8
4.	133.7	0.78	12.97	44.0	-	271.5
прототип	-	0.77	1.43	5.6	4432.0	206.3
* - в дистиллированной воде при рН 6.0; ** - скорость свободного истечения 0.01М ацетатного буфера рН 4.7 через слой адсорбента площадью 1 см2 и высотой 1 см (мл/см2×час).