способ определения групп крови у свиней

Формула изобретения

Способ определения групп крови у свиней, включающий взятие образцов крови у животных, получение суспензии эритроцитов путем смешивания образцов крови с физиологическим раствором и последующего центрифугирования, постановку реакции с использованием 96-луночных пластиковых плоскодонных планшетов, в которые вносят суспензии эритроцитов и иммуноспецифические сыворотки, встряхивание планшетов, помещение их в термостат на инкубацию и читку реакции, отличающийся тем, что встряхивание планшетов осуществляют с помощью планшетного фотометра, а перед помещением планшетов в термостат у образцов также с помощью планшетного фотометра определяют степень поглощения видимого света с длиной волны 630-650 нм, после чего осуществляют инкубацию образцов в термостате при температуре 37°С в течение 40 мин, а затем образцы дополнительно встряхивают и инкубируют еще в течение 1,5-2,0 ч, после чего у образцов с помощью планшетного фотометра также определяют степень поглощения видимого света с длиной волны 630-650 нм, при этом читку реакции осуществляют путем вычитания показателей степени поглощения видимого света образцами после инкубации из показателей степени поглощения видимого света образцами до инкубации, а полученные значения переводят в баллы серологического теста.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к иммуногенетике, в частности к способам тестирования свиней по эритроцитарным антигенам или группам крови. Контроль происхождения (отцовства) племенных животных в РФ является обязательным условием для ведения селекционной работы (Ст.19 Закона РФ «О племенном животноводстве»). Государственной программой "Генетическая экспертиза племенной продукции (материала) в Российской Федерации" (приказ Минсельхоза РФ №291 от 19 мая 1998 года) в качестве обязательного мероприятия предусмотрено проведение генетического тестирования и использование полученных данных в племенной работе. Начало использования генетических маркеров при разведении сельскохозяйственных животных дала наука иммуногенетика, а именно исследование групп крови (эритроцитарных антигенов). Анализ систем групп крови и сегодня остается основным методом генетического контроля происхождения животных. Определение групп крови у свиней проводят, используя серологические реакции агглютинации и гемолиза с применением иммуноспецифических сывороток.

Известен способ определения групп крови свиней с использованием реакции полной агглютинации (Тихонов В.Н. Изучение групп крови животных. Новосибирск. - 1965. - 64 с). Для проведения реакций используют 2,5% раствор отмытых эритроцитов, который помещают в иммунологические стеклянные пробирки, смешивают с сывороткой в соотношении 1:2 и инкубируют при 37°С в течение 30 мин. Затем образцы встряхивают и инкубируют еще 30 мин, после чего проводят визуальную читку реакций. Известен способ определения групп крови свиней посредством реакции агглютинации с проведением двух независимых читок реакций (Безенко С.П. Методические рекомендации по определению происхождения свиней на основе анализа наследования антигенов эритроцитов. Дубровицы. - 1974. - 26 с). Для этого в иммунологические пробирки отмеривают 0,1 мл сыворотки, к ней приливают 0,05 мл 2%-ной суспензии эритроцитов. Эти компоненты тщательно перемешивают в течение 2-3 мин, инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 40 мин, после чего проводят первую читку реакций. Затем образцы встряхивают, инкубируют еще в течение 2-х часов, после чего проводят вторую читку реакций. При этом второе чтение желательно проводить другому лаборанту. Данные методики определения групп крови у свиней характеризуются большой трудоемкостью, высокой себестоимостью и относительно низкой производительностью, так как они основаны на мануальной системе пробоподготовки, визуализации и документации результатов исследований, характеризуются большим расходом реагентов, что отражается на стоимости тестирования одной головы свиней.

Известен способ определения групп крови овец с проведением реакций в 96-луночных планшетах, используемый в качестве прототипа. Сущность способа заключается в отборе проб крови животных, ее трехкратном центрифугировании на макроцентрифуге в течение 5 минут при 2,5-3 тыс.об/мин с целью подготовки суспензии эритроцитов и постановки реакции, включающей раскапывание сыворотки, ее смешивание с суспензией эритроцитов и последующее инкубирование компонентов в течение 30-40 минут при температуре 37°С. Процесс завершают читкой реакции (Сыворотки иммуноспецифические для определения групп крови овец и коз. ТУ 9389-003-00498254-00. Введены с 2001 г. ОКП 93 8900. Группа Р-31. - 9 с). Однако данный способ предусматривает мануальную пробоподготовку и визуализацию результатов, что делает его трудоемким и низкопроизводительным.

Задача изобретения заключалась в разработке более эффективного способа определения групп крови свиней.

Технический результат изобретения заключается в повышении объективности оценки групп крови свиней, одновременно - в сокращении количества используемых реагентов и снижении трудозатрат на тестирование животных.

Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ, включающий тестирование свиней по эритроцитарным антигенам с применением мультисканирвания, включающий взятие крови животных, ее центрифугирование, то есть подготовку суспензии эритроцитов, постановку реакции, а именно раскапывание, смешивание и инкубирование компонентов и, наконец, читку реакции, отличающейся тем, что для постановки реакции используют 96-луночные пластиковые плоскодонные плашки, которые обрабатывают дезактивирующим раствором, затем помещают в термостат и выдерживают 20-40 минут при температуре 37°С, после чего дезактивирующий раствор сливают, а плашки высушивают; подготовку суспензии эритроцитов осуществляют путем смешивания образцов крови и физраствора с последующим центрифугированием в микропробирках на микроцентрифуге двухкратно при 7000 об/мин; раскапывание и смешивание компонентов (суспензии эритроцитов и сыворотки реагента) осуществляют с помощью 8-канального дозатора переменного объема, а встряхивание - с помощью планшетного фотометра; читку реакции производят также на планшетном фотометре путем определения числовых значений степени поглощения света образцами при длине волны 630-650 нм, причем для интерпретации результатов анализа числовые значения степени поглощения света образцами после проведения реакции (матрица В) вычитают из числовых значений степени поглощения света образцами до проведения реакции (матрица А), а полученные значения переводят в баллы серологического теста.

Пример. Контрольное использование предложенного способа тестирования свиней по эритроцитарным антигенам проводили на свиньях породы йоркшир канадской селекции ЗАО «Агроиндустрия» Орловской области.

1) Отбор крови свиней в объеме 3-5 мл осуществляли из ушной вены в пробирки с антикоагулянтом в соотношении 1:4;

2) 96-луночные пластиковые плоскодонные плашки обрабатывали дезактивирующим раствором (фосфатно-солевой буфер + 10% бычьего альбумина) с целью дезактивации адсорбирующих свойств поверхности лунки, помещали их в термостат, где выдерживали 20-40 минут при температуре 37°С, после чего дезактивирующий раствор сливали, а плашки высушивали;

3) 0,4 мл крови помещали в 2,0 мл пластиковые пробирки, смешивали с 1,6 мл физраствора, после чего центрифугировали на центрифуге ТЭТА 10 при 7000 об/мин в течение 3 мин;

4) надосадочную жидкость сливали, в пробирки добавляли новый физраствор в объеме 1,6 мл, все смешивали и вновь центрифугировали в том же режиме;

5) для получения 2,5% суспензии эритроцитов из осадка, полученного при центрифугировании, дозатором отбирали 0,02 мл и смешали с 0,78 мл физраствора;

6) раскапывание производили с помощью 8-канальных дозаторов переменного объема в 96-луночный плоскодонный планшет. Первоначально раскапывали сыворотку в объеме 0,05 мл, а затем и суспензию эритроцитов в объеме 0,05 мл. Планшеты встряхивали с помощью планшетного фотометра DYNEX MRX Revelation;

7) определяли степень поглощения образцами видимого света с длиной волны 630-650 нм до начала реакций с использованием планшетного фотометра DYNEX MRX Revelation в режиме агглютинации (матрица А), таблица 1;

Таблица 1
Степень поглощения света образцами до начала реакции (матрица А)
Образцы крови	Иммуноспецифические сыворотки
	Ар	Ва	Bb	Da	Еа	Ed	Eb	Ее	Eg	Ef	Fa	Fb	La	Lb
1	1.092	1.139	1.083	1.091	1.056	1.116	1.045	1.061	1.061	0.973	1.031	1.079	1.117	1.108
2	0.847	0.914	0.843	0.867	0.874	0.890	0.911	0.847	0.903	0.980	0.844	0.944	0.914	1.017
3	0.877	0.889	0.832	0.813	0.841	1.076	0.766	0.810	0.824	1.160	0.827	0.852	0.880	0.877
4	1.110	1.063	1.060	1.023	1.035	1.092	0.984	1.046	1.021	1.058	1.006	1.053	1.011	1.125
5	1.233	1.192	1.185	1.133	1.161	1.168	1.115	1.108	1.140	1.288	1.103	1.173	1.163	1.191
6	0.925	1.025	1.098	1.024	1.056	1.101	1.009	0.997	1.035	1.078	0.992	1.065	1.057	1.172
7	1.212	1.658	1.093	1.157	1.163	1.193	1.154	1.129	1.121	1.121	1.113	1.169	1.162	1.194
8	1.036	0.942	1.020	0.992	1.023	1.077	0.000	1.008	1.050	0.991	0.972	0.986	1.030	1.260

8) затем планшет помещали в термостат и проводили инкубацию реакций при температуре 37°С в течение 40 мин, после чего еще раз его встряхивали и инкубировали еще в течение 1,5-2,0 часов;

9) определяли степень поглощения образцами видимого света с длиной волны 630-650 нм после проведения реакций с использованием планшетного фотометра DYNEX MRX Revelation в режиме агглютинации (матрица В), таблица 2;

Таблица 2
Степень поглощения света образцами после проведения реакции (матрица В)
Образцы крови	Иммуноспецифические сыворотки
	Ар	Ва	Bb	Da	Еа	Ed	Eb	Ее	Eg	Ef	Fa	Fb	La	Lb
1	1.127	0.919	1.101	0.953	1.103	1.038	0.926	1.042	0.971	0.944	1.109	0.819	1.028	1.034
2	0.815	0.659	0.849	0.618	0.872	0.725	0.734	0.782	0.726	0.976	0.858	0.635	0.874	0.822
3	0.886	0.702	0.778	0.633	0.812	0.926	0.643	0.748	0.742	1.149	0.810	0.632	0.824	0.816
4	1.084	0.773	1.017	0.750	1.008	0.989	0.969	0.930	0.881	0.987	1.017	0.726	1.003	0.960
5	1.225	0.959	1.168	0.905	1.145	1.035	0.993	1.112	0.986	1.158	1.109	0.909	1.148	1.116
6	0.776	0.702	1.052	0.725	1.012	1.029	0.989	0.848	0.778	1.024	1.001	0.754	1.025	0.887
7	1.175	1.362	1.091	1.139	1.155	1.101	1.098	1.023	0.887	1.105	1.126	0.892	1.162	1.016
8	1.048	0.819	1.027	0.998	1.018	0.963	0.865	0.898	0.934	0.936	0.984	0.858	1.033	0.962

10) для идентификации результатов реакций проводили вычитание результатов степени поглощения света средой до (матрица А) и после проведения реакций (матрица В). То есть из значений таблицы 1 вычитали значения таблицы 2. При наличии реакции агглютинации наблюдали более существенные различия в изменении степени поглощения света средой, чем в случае ее отсутствия;

Таблица 3
Разница значении
Образцы крови	Иммуноспецифические сыворотки
	Ар	Ва	Bb	Da	Еа	Ed	Eb	Ее	Eg	Ef	Fa	Fb	La	Lb
1	-0.035	0.220	-0.018	0.138	-0.047	0.078	0.119	0.019	0.090	0.029	-0.078	0.260	0.089	0.074
2	0.032	0.255	-0.006	0.249	0.002	0.165	0.177	0.065	0.177	0.004	-0.014	0.309	0.040	0.195
3	-0.009	0.187	0.054	0.180	0.029	0.150	0.123	0.062	0.082	0.011	0.017	0.220	0.056	0.061
4	0.026	0.290	0.043	0.273	0.027	0.103	0.015	0.116	0.140	0.071	-0.011	0.327	0.008	0.165
5	0.008	0.233	0.017	0.228	0.016	0.133	0.122	-0.004	0.154	0.130	-0.006	0.264	0.015	0.075
6	0.149	0.323	0.046	0.299	0.044	0.072	0.020	0.149	0.257	0.054	-0.009	0.311	0.032	0.285
7	0.037	0.296	0.002	0.018	0.008	0.092	0.056	0.106	0.234	0.016	-0.013	0.277	0.000	0.178
8	-0.012	0.123	-0.007	-0.006	0.005	0.114	-0.865	0.110	0.116	0.055	-0.012	0.128	-0.003	0.298

11) полученные цифровые значения переводили в баллы серологического теста:

Таблица 4
Пределы разницы значений	Баллы
от -1 до 0,025	0
от 0,025 до 0,04	1
от 0,04 до 0,055	2
от 0,055 до 0,1	3
от 0,1 до 1	4

«0» - эритроциты свободно взвешены, жидкость красная (р-я отсутствует);

«1» - агглютинация эритроцитов слабо заметна, жидкость мутная;

«2» - эритроциты в виде мелких комочков, жидкость мутная;

«3» - эритроциты в виде комочков разной величины, жидкость слегка мутная;

«4» - эритроциты соединены в один комок, жидкость прозрачная;

12) в конечном итоге получаем таблицу 4 с результатами реакции агглютинации в баллах серологического теста;

Таблица 5
Серологический тест свиней породы йоркшир по группам крови
Образцы крови	Иммуноспецифические сыворотки
	Ар	Ва	Bb	Da	Еа	Ed	Eb	Ее	Eg	Ef	Fa	Fb	La	Lb
1	0	4	0	4	0	3	4	0	3	1	0	4	3	3
2	1	4	0	4	0	4	4	3	4	0	0	4	2	4
3	0	4	2	4	1	4	4	3	3	0	0	4	3	3
4	1	4	2	4	1	4	0	4	4	3	0	4	0	4
5	0	4	0	4	0	4	4	0	4	4	0	4	0	3
6	4	4	2	4	2	3	0	4	4	0	0	4	1	4
7	1	4	0	0	0	3	4	4	4	0	0	4	0	4
8	0	4	0	0	0	4	4	4	4	3	0	4	0	4

13) по результатам серологического теста определяем группы крови свиней. При этом использовали общепризнанную методику Безенко С.П. «Методические рекомендации по определению происхождения свиней на основе анализа наследования антигенов эритроцитов». Дубровицы. - 1974.

Таблица 6
Группы крови свиней
Образцы крови	Система групп крови
	А	В	D	Е	F	L
1	-/-	а/а	а/-	dbg/dbg	b/b	a/b
2	-/-	а/а	а/-	dbg/deg	b/b	b/b
3	-/-	a/a	а/-	dbg/deg	b/b	a/b
4	-/-	а/а	а/-	deg/def	b/b	b/b
5	-/-	а/а	а/-	dbg/dbf	b/b	b/b
6	-/р	а/а	а/-	deg/deg	b/b	b/b
7	-/-	а/а	b/b	dbg/deg	b/b	b/b
8	-/-	а/а	b/b	dbg/def	b/b	b/b

Проведенное нами контрольное тестирование свиней по разработанному способу показало полное совпадение данных с результатами, полученными с использованием традиционного метода.

На чтение одной плашки (96 проб) в стандартной методике необходимо затратить не менее 10-15 минут в зависимости от лаборанта, его опыта и профессиональной подготовки, в предлагаемой нами методике на это необходимо затратить 1,5-2 минуты, что почти в 10 раз быстрее. Лабораториям иногда приходиться тестировать до 100 голов в день по 17-20 сывороток на голову, то есть до 2000 проб в день. При стандартной методике на это потребуется 1,5-2 часа, в новой методике на это уйдет примерно 15-20 минут.

Предложенный способ характеризуется меньшей трудоемкостью, более высокой производительностью и объективной идентификацией результатов реакций за счет мультисканирования на основе планшетного фотометра.

Способ также позволяет сократить количество используемых реагентов, по сравнению с прототипом, в 2 раза; в прототипе использовали 0,1 мл сыворотки, в предложенном способе - 0,05 мл.

Данное изобретение может быть использовано в разведении свиней, в частности в оценке достоверности происхождения и маркерной селекции.