способ прогнозирования сочетанного поражения органов цистным эхинококкозом у детей

Формула изобретения

Способ прогнозирования сочетанного поражения органов цистным эхинококкозом у детей, характеризующийся тем, что из лимфоцитов периферической венозной крови выделяют ДНК, проводят генотипирование полиморфизма гена, кодирующего фермент глютатион-S-трансферазу класса mu M1 методом полимеразной цепной реакции и при обнаружении делеционного генотипа GSTM1 0/0 прогнозируют риск развития сочетанного эхинококкоза и резидуальных кист после хирургического лечения у обследуемого.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к детской хирургии, и может быть использовано при прогнозировании риска сочетанного поражения органов и развития резидуальных кист после хирургического лечения у больных цистным эхинококкозом детей.

При заболевании человека эхинококкозом тяжесть патологического процесса зависит от количества паразитирующих в нем ларвоцист (Каримов Ш.И.//Хирургия эхинококкоза: Международный симпозиум., Хива, 1994, с.1-6). Сочетанный эхинококкоз у детей встречается нередко, и разнообразие клинических проявлений этой патологии является причиной поздней диагностики. При множественном и сочетанием поражении эхинококкозом хирургическое вмешательство становится более травматичным, чаще приводит к серьезным осложнениям.

Особенностью цистного эхинококкоза как паразитарного заболевания является возможность неоднократного развития, в том числе развития после хирургического лечения. В настоящее время достоверно установить природу (рецидивный, резидуальный, реинвазивный) развившихся и выявленных после операции кист достаточно трудно (Ахмедов И.Г., Османов А.О.//Хирургия, 2002, №9, с.28). Пути профилактики каждого из этих форм различны. При эхинококкозе рецидивные кисты могут развиться из протосколексов, из-за обсеменения до и во время операции. В связи с отсутствием стойкого иммунитета при эхинококкозе возможно повторное заражение больного с развитием кист (реинвазивных кист) в любые сроки после операции. При сочетанием поражении эхинококкозом разные кисты развиваются неравномерно, поэтому трудно гарантировать отсутствие более мелких, не выявляемых при инструментальном обследовании кист (резидуальных кист).

По серологическим реакциям диагностировать полное выздоровление после хирургического лечения не всегда представляется возможным, ошибочные результаты отмечаются в 5-12% случаев (Тимошин А.Д.// Анналы хирургии, 2000, №5, с.69). Снижение титров серологических реакций можно регистрировать не ранее чем через 1,5 года (до 5-7 лет) после операции, так как при эхинококкозе наблюдается длительное персистирование антител в крови (Ахмедов И.Г. Автореф. дис... канд. мед. наук, Махачкала, 1998). Важен тот факт, что период между этапами операций при сочетанием эхинококкозе не должен превышать 2-3 недель, поскольку после оперативного вмешательства оставшиеся кисты начинают бурно расти, особенно первые 2-3 месяца (Гаджимирзаев Г.А. и др.// Мат. Междунар. конф. «Проблемы эхинококкоза», Махачкала, 2000, с.41).

Авторами в научно-медицинской и патентной литературе не обнаружено сведений об известности способа прогнозирования сочетанного эхинококкоза у детей. В этой связи особую актуальность представляет определение прогностических критериев.

Известен способ выявления эхинококкоза по серологическим реакциям с чувствительностью 54-86% (ИФА, РЛА, РНГА и другие (Лейкина Е.С., Яроцкий Л.С., Озерецковская Н.Н.//Мед. паразитол. - М. - 1987. - №2. - С.3-7; Старкова Т.В., Калачев В.Н. //Современное состояние и перспективы оздоровления от эхинококкоза и цистицеркоза: Тез.докл.конф., г.Караганда. 1990. - С.145; Зорихина В.И., Баллад Н.Е. Эхинококкозы. - М.: ИМПиТМ. - 1990. - С.49)), инструментальными методами с информативностью при выявлении кист до 1 см в 73-80% (УЗИ, КТ и другие (Геллер Ю.И. Эхинококкозы. - М.: Медицина. - 1989. - 209 с.)). Чувствительность, специфичность, разрешающая способность этих исследований недостаточна для выявления ранних стадий развития мелких ларвоцист (Ахмедов И.Г., Османов А.О./УХирургия, 2002, №9, с.28).

Разработанные в настоящее время клинические, иммунологические, инструментальные методы диагностики и прогнозирования сочетанного поражения органов эхинококкозом имеют следующие недостатки:

- отсутствие диагностических маркеров болезни на ранних этапах развития патологии из-за разнообразия клинических проявлений;

- недостаточно эффективные инструментальные методы при выявлении мелких кист;

- недостаточно чувствительные серологические реакции;

Инвазия эхинококком сопровождается не только локальным поражением органов, но и, как правило, явлениями тяжелого эндотоксикоза (А.Т.Пулатов //Детская хирургия, 2004, №5, с.28). На человека, пораженного гельминтозом и проживающего в регионе с высокой техногенной нагрузкой, оказывают совместное влияние химические загрязнения и токсины гельминта. В зависимости от особенностей генома различные индивидуумы могут сохранять устойчивость или обнаруживать повышенную чувствительность к повреждающим агентам. Гены, детерминирующие реакцию организма на экотоксины, кодируют белки, определяющие метаболизм (детоксикацию) ксенобиотиков. Считается, что гены, контролирующие синтез ферментов детоксикации глютатион-S-трансфераз (особенно ген GSTM1, кодирующий глютатион-S-трансферазу класса mu), выступают в качестве модификаторов и факторов риска при заболеваниях, связанных с неблагоприятным действием факторов внешней среды (B.C.Баранов, Е.В.Баранова, Т.Э.Иващенко, М.В.Асеев. Геном человека и «гены предрасположенности», 2000). Таким образом, в условиях повышенной нагрузки на систему антиоксидантной защиты лица со сниженной активностью глютатион-S-трансфераз более подвержены влиянию ксенобиотиков. Вследствие воздействия неблагоприятных факторов внешней среды возникает ослабление иммунной системы. Диссеминация эхинококковых кист (при множественном и сочетанном поражении) является показателем выраженности иммунных нарушений у больных (Ахмедов И.Г., Османов А.О.//Хирургия, 2002, №9, с.28).

Нами выявлено, что среди детей, больных сочетанным эхинококкозом, значительна доля лиц носителей делеционного генотипа гена GSTM1. Таким образом, генотипирование детей, больных цистным эхинококкозом на выявление делеционного генотипа GSTM1 0/0, дает возможность прогнозировать риск сочетанного эхинококкоза и развитие резидуальных кист после хирургического лечения. Метод может быть использован в дополнение к известным способам диагностики для улучшения результатов. Он доступен по реактивам и оборудованию.

Техническим результатом изобретения является получение критериев прогнозирования риска развития сочетанного эхинококкоза и резидуальных кист после хирургического лечения у детей на основе выявления молекулярно-генетических маркеров.

Способ осуществляется следующим образом.

Материалом для исследования служат образцы ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической венозной крови человека. Для выделения ДНК используют стандартный метод фенольно-хлороформной экстракции, описанный Mathew C.C. (The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology / Ed.J.M.Walker. - New York., London. - 1984. - Vol.2. - P.31-34).

1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивают и переливают в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляют 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трисHCl (рН 7,6).

2. Смесь центрифугируют 20 мин при 4000 об/мин.

3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА, рН 8.0, суспензируют.

4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация - 10 мг/ мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 38°С.

Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке.

1. Для депротеинизании к лизату добавляют 0.5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1 М трисHCl до рН 7,8.

2. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин. в течение 10 мин.

3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и неденатурированные белки.

4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем - хлороформом.

5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола.

6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной Н₂О; раствор хранят при t-20°C.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации нужного фрагмента.

Анализ полиморфных локусов гена GSTM1 проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) на термоциклере в автоматическом режиме с использованием локусспецифических олигонуклеотидных праймеров 5 GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3 и 5 GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3 (Ivaschenko Т.Е., Sideleva O.G., Baranov V.S. Glutathione-S-transferase micro and theta gene polymorphisms as new risk factors of atopic bronchial asthma // J. Mol. Med. - 2002. - Vol.80. N.I - P.27-37).

Схема ПЦР следующая. Реакционная смесь содержит 2,5 мкл 10 х ПЦР-буфера (60 мМ Tris-HCl рН 8.5), 1,5 мМ MgCl ₂, 25 мМ KCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанол; 0.1% тритон Х-100), 1 мкл смеси 5 мМ каждого dNTP, no 1 мкл соответствующих праймеров, примерно 200 нг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы с добавлением деионизированной воды до объема 25 мкл. Продукты амплификации анализируют электрофоретически в ПААГ после окрашивания гелей бромистым этидием с последующей визуализацией ДНК-фрагментов в УФ-свете. Анализ генотипа GSTM1 О/О выполняется в стандартных условиях по ранее описанной методике (El-Zein R., Zwischenberger J.B., Wood Т.О., Abdel-Rahman S.Z., Brekelbaum C., Au W.W. Combined genetic polymorphism and risk for development of lung cancer //Mutat. Res. - 1997. - Vol.381. - N 2 - P. 189-200; Seidegard J., Pero R.W., Markowitz M.M., Roush G., Miller D.G., Beattie E.J., Seidegard, J., Pero R.W., Miller D.G., Beattie E.J.A glutathione transferase in human leukocytes as a marker for the susceptibility to lung cancer// Carcinogenesis. -1986. - Vol.7. - P.751-753). При отсутствии генотипа GSTM1 0/0 формируются фрагменты размером 271 пн, при наличии генотипа GSTM1 0/0 фрагмент отсутствует. При обнаружении генотипа GSTM1 0/0 прогнозируют риск развития сочетанного поражения органов эхинококкозом и резидуальных кист после хирургического лечения.

Нами были исследованы дети (N=72), больные цистным эхинококкозом, проживающие в промышленных и сельскохозяйственных районах Республики Башкортостан. Контрольную группу составили практически здоровые лица. Группы обследованных пациентов и контроля были сопоставимы по возрасту, полу и месту жительства. Установлено, что у больных эхинококкозом частота встречаемости гомозигот по делеционному аллелю гена глютатион-S-трансферазы M1 составляет 32,9%. В контрольной группе практически здоровых индивидов этот показатель равнялся - 42,8%.

При изучении распределения частот генотипов гена GSTM1 у больных эхинококкозом в зависимости от количества паразитирующих кист установлено, что среди исследованных пациентов с генотипом GSTM1 0/0 больные сочетанным поражением наблюдаются в 50,0% случаев (все они были жителями промышленных районов). У остальных 50% пациентов существующие методы исследований не позволили выявить, или исключить, наличие мелких кист. Доля пациентов с сочетанным эхинококкозом и нормальным генотипом составляла 18,8%. Причем все они поступили из тех сельскохозяйственных районов, где наблюдалось значительное обсеменение почвы яйцами эхинококка. Поэтому у этих больных сочетанный эхинококкоз может быть обусловлен повторным заражением (реинвазивные кисты), так как известно, что к эхинококкозу нет устойчивого иммунитета (Ахмедов И.Г., Османов А.О.//Хирургия, 2002, №9, с.28).

Статистический анализ результатов выявил достоверные различия между группами ( ²=6,13; р=0,01).

Для количественной оценки относительного риска развития сочетанного эхинококкоза для вышеуказанного генетического маркера мы вычислили показатель соотношения шансов (odds ratio - OR). Для этого использовали формулу, предложенную Бландом (Bland, J.M. The odds ratio / J.M.Bland, D.G.Altman // Br. Med. J. - 2000. - Vol.320. - P.1468):

OR=(a×d)/(b×c)

где a - число лиц с наличием, b - с отсутствием маркера (генотипа GSTM1 0/0) среди больных сочетанным эхинококкозом; c и d - число лиц соответственно с наличием и отсутствием маркера среди больных солитарным эхинококкозом. Повышенный риск развития констатировали при OR>1.

Показатель относительного риска развития сочетанного поражения эхинококкозом для больных с генотипом GSTM1 0/0 оказался равным OR=4,33.

Пример 1. Больная З., 5 лет, поступила в хирургическое отделение с жалобами на боли в животе. После госпитализации и обследования выставлен диагноз: эхинококковая киста печени. Проведено исследование по предложенной методике. Установлено: является носителем делеционного генотипа GSTM1 0/0. В отношении развития резидуальных кист прогноз неблагоприятный.

Через 1 год после операции по поводу эхинококковой кисты печени поступает в клинику с жалобами на боли в груди, сухой кашель. Данные ультразвукового исследования органов грудной полости выявили жидкостное образование с четкими ровными контурами, размерами 91×62 мм, с толстой гиперэхогенной капсулой. После обследования выставлен диагноз: эхинококковая киста левого легкого.

Пример 2. Больная С., 7 лет, поступила в хирургическое отделение в 1999 г. с жалобами на боли в животе. После госпитализации и обследования выставлен диагноз: эхинококковая киста правой доли печени. Данные ультразвукового исследования выявили в правой доле (6-7 сегментах) жидкостное образование овальной формы с четкими ровными контурами 68×33 мм и анэхогенным ободком различной толщины. Перед операцией проведено исследование по предложенной методике. Установлено: является носителем нормального генотипа гена GSTM1. В отношении развития резидуальных кист прогноз благоприятный.

В 2004 г. поступила на контрольное исследование. Данные ультразвукового исследования выявили в правой доле печени остаточную полость размерами 17×5 мм. Признаков развивающейся кисты эхинококка у пациентки не обнаружено.