средство для коррекции дефицита лактазы

Формула изобретения

1. Средство для коррекции дефицита лактазы, представляющее собой высокоочищенный фермент лактазу, отличающееся тем, что лактаза выделена из культуральной жидкости грибного продуцента Penicilium canescens, обладает активностью не менее 10000 ед./г и стабильна в широком диапазоне рН (от 2,5 до 7,0) и температур (от 4 до 60°С).

2. Средство по п.1, отличающееся тем, что способно эффективно расщеплять молочный сахар на смесь легкоусвояемых моносахаридов: глюкозу и галактозу, как при пероральном применении, так и при предварительной обработке молока и молочных продуктов перед употреблением.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к лекарственным средствам, применяемым для лечения и профилактики заболеваний, связанных с нарушениями пищеварения у лиц, страдающих непереносимостью лактозы.

Известно (1), что пищеварительная система человека содержит целый набор ферментов, предназначенных для расщепления сложных компонентов пищи на простые молекулы, в виде которых они всасываются в кишечнике человека. В частности, в верхнем отделе тонкого кишечника человека синтезируется фермент лактаза, который расщепляет дисахарид лактозу, содержащийся в молоке и молочных продуктах на эквимолярные количества глюкозы и галактозы, которые легко усваиваются организмом (2).

Лактозная непереносимость (гиполактазия), обусловленная снижением выработки или отсутствием в слизистой оболочке кишечника фермента лактазы, встречается как у детей, так и у взрослых. Неспособность расщепить лактозу на глюкозу и галактозу после употребления молока или молочных продуктов проявляется тошнотой, рвотой, вздутием и болями в животе, диареей. В то же время исключение из рациона человека молока и молочных продуктов приводит к определенным нарушениям регулирующих систем организма (особенно в грудничковом возрасте) (2, 3).

Лактозная непереносимость у человека может быть преодолена несколькими путями:

- получением низколактозного или полностью безлактозного молока путем предварительного гидролиза лактозы в молоке с помощью ферментных препаратов,

- применением лекарственных препаратов, содержащих экзогенный фермент лактазу микробного происхождения.

Первый путь - получение безлактозного молока, был внедрен еще в начале 80-х годов рядом фирм ("Snam Progetti", Италия; "Gist-Brocades", Нидерланды). Недостатком этого способа является то, что он может быть использован только для обработки цельного молока и малопригоден для обработки кисломолочных продуктов (творога, сырков, йогуртов и т.д.), т.к. приводит к изменению их консистенции, внешнего вида и, в ряде случаев, вкусовых качеств.

Второй путь - это использование лекарственных препаратов, содержащих фермент лактазу микробного происхождения. Эти препараты предназначены для перорального приема людьми, у которых лактаза практически не вырабатывается или вырабатывается недостаточно в собственном кишечнике.

Выпускаемые лекарственные препараты, содержащие лактазу, можно условно поделить на две группы:

- препараты, содержащие лактазу, синтезируемую дрожжами и бактериями с оптимумом действия в нейтральной и слабощелочной зоне рН;

- препараты, содержащие лактазу, синтезируемую микроскопическими грибами с оптимумом действия в кислой зоне рН.

К первой группе относятся препараты "Lact-Aid", выпускаемый фирмой "Sugar Lo Co. Pleantvi" (USA), "Максилакт" (фирма "Gist Brocades", Нидерланды), "Лактейд" (фирма "Sugar Lo"), "Lactozym" (фирма "Novozymes"). Все эти препараты, содержащие дрожжевые лактазы, проявляют активность в довольно узком диапазоне рН (6,0-7,0) и не действует при рН ниже 6,0, что ограничивает сферу их использования (4). Эти препараты используются в основном для обработки цельного молока перед употреблением и малоэффективны в отношении лактозы кисломолочных продуктов.

Ко второй группе относятся лекарственные препараты на основе лактаз, синтезируемых микроскопическими грибами. Эти лактазы активны в кислой зоне рН (3,5-5,0) и, следовательно, эффективны для гидролиза лактозы кисломолочных продуктов и менее эффективны при гидролизе лактозы цельного молока. Так, фирмой "Fermentation Industries Kingstree" (США) получена лактаза из Aspergillus niger и выпущена в продажу в виде порошка под названием "Lactrase-N"; фирма "Шварц Фарма" производит препарат "Лактразу" в капсульной форме на основе лактазы из Aspergillus orysae (5, 6, 7).

Анализ препаратов, применяемых при непереносимости лактозы, показал, что для эффективного гидролиза лактозы молока и кисломолочных продуктов необходимо использовать, по крайней мере, два вида препаратов с оптимумом действия в различных зонах рН.

Ближайшим аналогом предполагаемого изобретения является патент US № 6,410,018 В1 Eisenhardt с соавт., в котором описана композиция для гидролиза лактозы, состоящая из двух лактаз микробного происхождения с оптимумами действия в кислой и нейтральной зоне рН (8). Это, по мнению авторов, позволяет наиболее полно осуществлять гидролиз лактозы при употреблении молока и молочных продуктов за счет того, что один фермент работает в кислой среде желудка, а другой в кишечнике человека при нейтральном и слабощелочном значении рН.

Недостатком заявленной композиции является сложность и многостадийность ее приготовления. В состав предложенной смеси входят два ферментных препарата, полученных из различных продуцентов по различным технологиям. Фермент, имеющий оптимум действия в нейтральной и слабощелочной зоне рН, покрывается кислотоустойчивой оболочкой, затем добавляется лактаза, действующая в кислой среде желудка, и смесь заключается в кислоторастворимую оболочку. Процесс приготовления указанной композиции продолжителен по времени и требует дополнительных материальных затрат.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание универсального средства для гидролиза лактозы, способного эффективно работать как в кислой, так и в нейтральной зоне рН.

Технический результат был достигнут получением высокоочищенного фермента лактазы, выделенного из культуральной жидкости микроскопического гриба Pen. canescens, обладающего высокой ферментативной активностью (не менее 10000 ед./г) и специфичностью действия. Очищенная лактаза ( -галактозидаза, К.Ф.3.2.1.23) имеет молекулярную массу 120-130 kD, изоэлектрическую точку pI 6,7, проявляет активность и стабильность в широком диапазоне рН (2,5-7,0) и температур (4-55°С) (фиг.1, 2). Фермент подвергается незначительному смешанному типу ингибирования продуктами гидролиза лактозы, что позволяет использовать его в процессе длительного гидролиза молочного сахара.

Указанные свойства делают фермент универсальным для работы при повышенной температуре (37°С), при комнатной температуре и температуре 4°С как в кислой, так и в нейтральной зоне рН.

Изучение специфического действия препарата лактазы было проведено на наиболее часто употребляемых человеком в пищу продуктах (молоке, кефире, твороге, йогурте). Обработку молока и молочных продуктов проводили следующими дозами фермента: 500, 1000, 2000 и 4000 ед. на 100 г продукта. Процесс вели при температуре 20°С в течение шести часов, при температуре 4°С в течение 12 часов и при 37°С в течение 2-х часов с добавлением желудочного сока, имитируя внутреннюю среду организма.

В ходе исследований была выбрана оптимальная доза фермента, обеспечивающая необходимую степень гидролиза молочного сахара (лактозы). Она составила 2000 ед. на 100 г кисломолочных продуктов и 4000 ед. на 100 г цельного молока. Эти концентрации фермента и были использованы для проведения дальнейшей работы.

При выборе дозы лактазы для предварительной обработки молока и молочных продуктов перед употреблением учитывали тот факт, что для большинства людей, страдающих гиполактазией, некоторое количество лактозы в сутки вполне приемлемо. Употребление ими в среднем 250 г молочных продуктов со степенью гидролиза лактозы 60-70% в несколько приемов не приводит к проявлению симптомов непереносимости лактозы. Гидролиз лактозы на 90% и более необходим только в случае исключительной непереносимости лактозы (7, 9).

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

В конические колбочки вместимостью 200 мл помещали по 100 г биосубстрата и добавляли фермент с суммарной лактазной активностью 2000 ед. и 4000 ед. Содержимое колбочек тщательно перемешивали и оставляли при температуре 20°С. В контрольном опыте субстрат выдерживали без добавления фермента. Для изучения сравнительного действия полученного фермента с зарубежными аналогами использовали импортный препарат Лактразу в виде капсул с той же активностью. Аналогично готовили пробы для обработки молока в холодильнике (4°С) в течение 12 часов.

Определение образующейся в ходе гидролиза глюкозы проводили по методу Kurz G., Beutler H.O. (10, 11, 12).

Результаты опытов по предварительной обработке молока и молочных продуктов, а также сравнительные данные действия препарата с действием импортного аналога Лактразы представлены в табл.1.

Как видно из табл.1, степень гидролиза лактозы в молоке ферментом с активностью 2000 ед. при температуре 20°С через 6 часов достигает значения 58%, а при использовании 4000 ед. - 65%. Такой же глубины гидролиза можно достичь при обработке молока соответствующими дозами при 4°С за 12 часов.

В кефире, йогурте и твороге гидролиз лактозы происходит быстрее и более глубоко по сравнению с молоком за счет того, что кисломолочные продукты имеют рН среды 4,0-4,5, близкий к оптимуму действия предлагаемого средства (4,0-4,5). За 6 часов обработки при комнатной температуре (20°С) или в течение 12 часов при 4°С степень гидролиза лактозы в кефире и йогурте достигает 85 или 89-91% в зависимости от дозы вносимого препарата. Лактоза в твороге гидролизуется на 97-100% после часа обработки при комнатной температуре (20°С) и на 100% через 12 часов при 4°С.

Из табл.1 также видно, что специфическая активность предлагаемого средства выше, чем у импортного препарата Лактраза фирмы "Шварц Фарма", как при гидролизе лактозы в молоке (на 10-15%), так и при гидролизе лактозы в кисломолочных продуктах (на 5-10%).

Пример 2.

Для изучения специфической активности препарата лактазы в условиях, имитирующих внутреннюю среду организма, в конические колбочки вместимостью 200 мл помещали по 100 г биосубстрата, вносили фермент с суммарной активностью лактазы 2000 ед. и 4000 ед. и добавляли по 10 мл натурального желудочного сока "Эквин" (10% от массы субстрата) (1). Содержимое колбочек перемешивали и помещали в термостат при температуре 37°С на 2 часа, периодически встряхивая. В контрольный опыт фермент не добавляли. В качестве сравнения использовали препарат Лактразу в тех же дозах.

Время обработки ограничили двумя часами, т.к. из литературных данных известно (13), что первые клинические симптомы лактазной недостаточности возникают уже через 1,5-2 ч после употребления молока и других молочных продуктов. Пробы отбирали через каждые 30 минут. В них определяли содержание глюкозы и рассчитывали степень гидролиза лактозы.

Данные по изучению специфической активности предлагаемого средства в условиях, имитирующих среду организма, представлены в табл.2.

В условиях, приближенных к условиям организма (37°С, в присутствии желудочного сока), скорость гидролиза лактозы увеличивалась за счет сдвига температуры в зону оптимальных значений действия фермента. В зависимости от дозы вносимого препарата лактоза молока гидролизовалась на 59% или 75% за 2 часа. За это же время степень гидролиза лактозы в кефире и йогурте достигала соответственно 87 и 91%, а в твороге уже за 1 час было прогидролизовано 94-100% лактозы.

Сравнительный анализ специфического действия предлагаемого средства и Лактразы показал, что предлагаемое средство на 5-15% эффективнее, особенно в отношении лактозы молока.

Таким образом, разработанное средство для коррекции дефицита лактазы обладает высокой специфической активностью в отношении лактозы молока и молочных продуктов, превращая молочный сахар в смесь легкоусвояемых сахаров: глюкозу и галактозу, делая тем самым молочные продукты доступными для людей, страдающих лактазной недостаточностью.

Фармакокинетические исследования, проведенные на 60 беспородных крысах-самцах, показали, что ферментативная активность лактазы в плазме крови подопытных животных не выявляется и основная масса лактазной активности (до 75%) обнаруживается в фекалиях.

Подобрать "модельное" животное для испытаний разработанного средства "in vivo" не представляется возможным, так как подобная патология у животных не выявляется. Чистые линии животных с данной патологией не выведены. Учитывая отсутствие модельных лабораторных животных, имеющих данную патологию, результаты фармакокинетики, свидетельствующие об отсутствии специфической активности лактазы в плазме крови подопытных животных, а также имеющийся опыт использования в заместительной терапии импортных препаратов на основе микробных лактаз, испытания предлагаемого лекарственного средства "in vivo" не проводились.

Доклинические токсикологические исследования предлагаемого средства проведены ООО "ТОКСОФАРМ" на экспериментальной базе лаборатории фармакологии и химиотерапии ГУ НИИНА им. Г.Ф.Гаузе РАМН в соответствии с "Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ", 2000 г. (14). Изучение острой токсичности предлагаемого средства, проведенное на здоровых беспородных крысах-самцах и мышах-самцах SHK показало, что препарат относится к малотоксичным веществам: показатель острой токсичности (ЛД₅₀) у мышей находился на уровне 3250 мг/кг; МПД (ЛД ₁₀) - 1710 мг/кг; у крыс ЛД₅₀ составляла 2970 мг/кг; МПД - 1563 мг/кг. При изучении хронической токсичности на здоровых беспородных крысах-самцах было установлено, что введение препарата лактазы внутрь испытуемым животным в терапевтической, 2-кратной и 5-кратной дозах не приводило к нарушению функционального состояния организма подопытных животных и не вызывало изменений показателей периферической крови, биохимических показателей крови, морфологической структуры тканей и органов. Препарат не обладает аллергизирующими, анафилактогенными и иммунотоксическими свойствами, не влияет на основные звенья гуморального и клеточного иммунитета, не оказывает тератогенный и эмбриотоксический эффекты.

На основе представленной в Минздрав РФ документации было получено разрешение на проведение клинических испытаний препарата.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гальперин С.И. Физиология человека и животных, М., 1970.

2. Валенкевич Л.Н. // Клиническая медицина, 1996, № 8.

3. Коршунов М.Ф., Даркина Е.Е. // Педиатрия, 1997, № 3.

4. Coughlin R.W., Charles M. - In: Immobilized Enzymes for Food Processing / Ed.W.Pitcher - Florida: USA, CRC Press, 1980, p.153-173; Itoh Т., Suzuki M., Adachi S/ - Agric. Biol. Chem., 1982, v.46, N4, p.899-904.

5. Green M.L. // Milk Industry, 1980, v.82, N 3, p.25-31.

6. Collins M.S., Di Palma Y.A., Pierson W.P. et al. // Gastroenterology - 1986 - vol.90 - p.1377-1378.

7. Di Palma Y.A., Collins M.S. // J. Clin. Gastroenterol. - 1989 - vol.11, № 3 - p.290-293.

8. Патент США № 6,410,018 В1 от 25 июня 2002 г.

9. Moskovitz M., Curtis C., Gavaler Y. // Am.J. Gastroenterol. - 1987 - vol.82, № 7 - р.632-635/

10. Kurz G. & Wallenfels K. Methoden der enzymatischen Analyse (Bergmeyer H.U., Hrsg.) 3.Aufl., Bd.2, S.1225-1229 and S.1324-1327, Verlag Chemie, Weinheim, and (1974) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U., ed.) 2nd., vol.3, pp.1180-1184 and pp.1279-1282, Verlag Chemie, Weinheim, Academic Press, Inc. New York and London.

11. Beutler H.O. Methoden der enzymatischen Analyse (Bergmeyer H.U., ed.), 3rd ed., Vol.VI, pp.104-112, Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach/Florida, Basel.

12. Methods of Biochemical Analysis and Food Analysis. Instruction for the Analysis of Foodstuffs in Research, Production and Official Control. Boehringer Mannheim GmbH, 1989, p.86-88.

13. Козловский А.А. // Мед. Новости, 2001 г., № 1.

14. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Москва, 2000 г.