способ получения коклюшного диагностического реагента

Формула изобретения

Способ получения коклюшного диагностического реагента для серологической идентификации бактериальных культур, выделяемых от больных с подозрением на коклюш, включающий использование сыворотки кроликов, гипериммунизированных инактивированными, а затем живыми коклюшными микробами, обработанной методом адсорбции паракоклюшными микробами, отличающийся тем, что сначала из специфической гипериммунной сыворотки кролика с помощью аффинного сорбента на основе геля гидроксида алюминия выделяют противококлюшные антитела и затем проводят их адсорбцию паракоклюшными микробами, адсорбированными на геле гидроокиси алюминия методом истощающей иммуноадсорбции, перемешивают их со стафилококковой суспензией, содержащей белок А, осаждают центрифугированием, ресуспендируют в ЗФР pH 7,2-7,4 и в виде 2%-ной суспензии используют в качестве диагностического реагента в реакции коагглютинации.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской микробиологии и иммунологии, в частности к способам получения коклюшных диагностических препаратов для лабораторной диагностики коклюша.

Известен способ получения диагностического препарата - сыворотки диагностической коклюшной поливалентной для серологической идентификации коклюшных бактерий в реакции агглютинации (РА), которую получают из крови ослов или кроликов, гипериммунизированных инактивированными, а затем живыми коклюшными микробами (Инструкция по применению сыворотки диагностической коклюшной поливалентной сухой для реакции агглютинации, утв. 01.06.2000).

Наиболее близким аналогом является способ получения препарата - адсорбированной диагностической сыворотки к агглютиногенам 1, 2, 3 для серологической идентификация коклюшных бактерий в PA - (Инструкция по применению сывороток диагностических коклюшных к агглютиногенам 1, 2, 3 и паракоклюшных к агглютиногену 14, адсорбированных, сухих, для РА, утв. 1994). При этом диагностический препарат, содержащий противококлюшные антитела, получают методом адсорбции паракоклюшными микробами сыворотки крови ослов или кроликов, гипериммунизированных инактивированными, а затем живыми коклюшными микробами.

Диагностические препараты, приготовленные известными способами, могут быть использованы для лабораторной диагностики коклюша только при условии, если в тестируемом материале содержится не менее 20-50 МОЕ (международных оптических единиц по стеклянному стандарту мутности) бактериальной культуры. При меньших концентрациях учет результатов реакции затруднен или невозможен.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение чувствительности анализа.

Сущность предлагаемого изобретения состоит в том, что при получении коклюшного диагностического реагента для серологической идентификации в реакции коагглютинации культур, выделяемых от больных с подозрением на коклюш, используют специфическую гипериммунную сыворотку кролика, из которой выделяют противококлюшные антитела, применяя аффинный сорбент, представляющий собой коклюшную суспензию, адсорбированную на геле гидроксида алюминия, полученные антитела подвергают дополнительной очистке паракоклюшными микробами, адсорбированными на геле гидроксида алюминия, и последующей сенсибилизации стафилококковыми клетками, содержащими белок А.

Реакция коагглютинации (РКОА) - это экспрессный метод микросероанализа с применением стафилококков-носителей белка А, обладающего высоким авидитетом к Fc-фрагментам IgG многих млекопитающих. РКОА привлекает к себе внимание простотой выполнения и при наличии высокоактивных диагностических реагентов позволяет быстро получить результат (в течение нескольких секунд или минут).

При использовании РКОА визуализация результатов реакции обеспечивается за счет образования видимых агглютинатов, которые формируются из клеточной основы (стафилококковых клеток) диагностических реагентов в присутствии гомологичного антигена. Поэтому концентрация взвеси испытуемой культуры при анализе с помощью коагглютинационного диагностикума может быть значительно ниже, чем для РА с диагностической сывороткой. Такая особенность РКОА с предлагаемым диагностикумом позволяет провести анализ даже при очень скудном, незначительном росте испытуемой культуры при ее минимальной концентрации в исследуемой пробе 0,05 МОЕ. Это имеет важное значение, учитывая, что коклюшный микроб очень требователен к составу питательной среды и очень трудно культивируется в искусственных условиях.

Причинно-следственная связь между техническим результатом и существенными признаками заключается в следующем.

Применение для сенсибилизации стафилококковых клеток, содержащих белок А, специфических антител, полученных с помощью аффинного сорбента на основе геля гидроксида алюминия и дополнительной очистки методом истощающей иммуносорбции с целью удаления перекрестие реагирующих антител, позволяет получить коклюшный диагностический реагент высокой степени специфичности и чувствительности.

При использовании коагглютинационных диагностикумов оптимизируются условия прохождения реакции антиген - антитело. Fab-фрагменты иммуноглобулиновой молекулы, фиксированной на белке А золотистого стафилококка за счет Fc-фрагмента, приобретают благоприятную пространственную ориентацию для связывания гомологичного антигена.

Имеется достаточно много публикаций по применению РКОА для определения различных антигенов инфекционной и неинфекционной природы. Для приготовления КОА-диагностикумов используют нативные иммунные сыворотки человека и некоторых лабораторных животных, иммуноглобулины которых обладают сродством к белку А стафилококка, а также могут применяться моноклональные антитела. В предлагаемом способе для приготовления диагностического реагента используются так называемые аффинноочищенные антитела, что позволяет повысить чувствительность анализа.

Способ приготовления диагностического реагента осуществляется следующим образом.

I. Получение коклюшного гель-алюминиевого сорбента.

1 часть препарата геля алюминия гидроксида и 1,2 части коклюшной суспензии формалинизированной прогретой с содержанием микробных клеток 600 млрд в 1 мл соединяют, перемешивают и оставляют на ночь в холодильнике при температуре +4-+8°С. Сорбент соединяют с раствором 5% глутарового альдегида в соотношении 3:1. Перемешивают 1 час при комнатной температуре. Центрифугируют при 3 тыс.об/мин в течение 15 минут, надосадочную отбрасывают. Полученный осадок выдерживают 30 минут при комнатной температуре в ЗФР (рН 7,2-7,4), содержащим 0,2% БСА, и отмывают 2-3 раза тем же раствором, затем продолжают отмывать с помощью ЗФР (7,2-7,4) до полного удаления несвязавшегося белка, контролируя процесс отмывания спектрофотометрически при =280 нм. Отмытый осадок доводят до исходного объема ЗФР (рН 7,2-7,4) с 0,02% содержанием азида натрия.

II. Выделение противококлюшных антител.

Для выделения антител используют противококлюшную кроличью сыворотку, разведенную ЗФР с рН 7,2-7,4 в 1:3-1:6 в зависимости от ее титра. Соотношение разведенной сыворотки и суспензии сорбента - 1:2.

2 части суспензии гель-алюминиевого коклюшного сорбента центрифугируют при 3000 об./мин 20 минут, надосадочную жидкость сливают, осадок сорбента соединяют с разведенной сывороткой, встряхивают в течение 1 часа при комнатной температуре. Центрифугируют в том же режиме, осадок отмывают ЗФР (рН 7,2-7,4) от несвязавшегося белка, контролируя его содержание спектрофотометрически. Далее при рН 2,4-2,6 проводят элюцию антител с помощью ЗФР (рН 2,4-2,6), добавляя его к осадку сорбента в соотношении 1:1, центрифугируют при 3000 об/мин 20 минут, собирают надосадочную жидкость - первый элюат антител. К осадку сорбента добавляют 1-2 части ЗФР (рН 2,4-2,6), центрифугируют в том же режиме и собирают второй элюат. Элюцию антител повторяют далее в 1-2 частях буфера, каждый раз проверяя содержание белка (спектрофотометрически при =280 нм) в элюатах. Элюцию завершают при содержании белка в последнем элюате в количестве менее 0,3 мг/мл. Элюаты нейтрализуют ЗФР (рН 7,2-7,4) до соответствующих значений рН, фильтруют, далее отбирают по антигенной активности в реакции агглютинации на стекле по общепринятой методике.

Сорбент промывают раствором ЗФР (рН 7,2-7,4) и ресуспендируют в том же растворе с добавлением 0,02% азида натрия.

III. Перекрестное истощение элюатов антител с использованием паракоклюшного гель-алюминиевого сорбента.

1 часть элюата соединяют с 2 частями суспензии паракоклюшного гель-алюминиевого сорбента (предварительно сорбент центрифугируют при 3000 об/мин 20 минут, надосадочную жидкость сливают). Истощение проводят в течение 2 часов при комнатной температуре, периодически перемешивая. Центрифугируют в том же режиме, собирая надосадочную жидкость, содержащую очищенные противококлюшные антитела. Определяют концентрацию белка спектрофотометрически при =280 нм. Сорбент отмывают от белка с помощью ЗФР (рН 2,4-2,6) и нейтрализуют, используя ЗФР с рН 7,2-7,4, для его дальнейшего использования.

IV. Сенсибилизация стафилококковых клеток, содержащих белок А, очищенными противококлюшными антителами.

Для приготовления диагностического реагента используют 10% стафилококковую суспензию, содержащую белок А.

Подбор оптимальной концентрации антител по белку для сенсибилизации стафилококковой суспензии проводят с помощью их предварительного титрования с использованием доз 0,8-1,8 мг белка на 1 мл 10% стафилококковой суспензии при стандартных условиях. Сенсибилизация продолжается в течение 30 минут при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Сенсибилизированные клетки осаждают центрифугированием при 3000 об/мин 15-20 минут. Надосадочную жидкость сливают. Полученный осадок ресуспендируют в ЗФР с рН 7,2-7,4, содержащем 0,02% азида натрия, до получения 2% суспензии, используемой в качестве диагностического реагента. Активность полученных реагентов оценивают в реакции коагглютинации, отбирая оптимальные варианты реагента, обеспечивающие наибольшую чувствительность в данном опыте.

Диагностический коагглютинационный препарат, приготовленный по предлагаемому методу, высокоспецифичен, в сравнении с прототипом обладает большей чувствительностью, позволяя использовать взвеси испытуемых микробных культур меньших концентраций. В предлагаемом способе в отличие от прототипа на этапе адсорбции предусматривается многократное использование паракоклюшного сорбента.

Результаты испытаний коагглютинационного диагностического реагента в сравнении с прототипом представлены в таблице.

Таблица.
Исследуемый материал Диагностический реагент		Концентрация микр. взвеси (МОЕ) штамма Bordetella pertussis №39						Концентрация микр. взвеси (МОЕ) штамма Bordetella parapertussis №402
		40	20	10	5	0,5	0,05	40-	20	10	5
Сыворотка кокл. адсорб. для РА (прототип)	Сер.74	++++	++++	+++	-	-	-	-	-	-	-
	Сер.65	++++	++++	+++	-	-	-	-	-	-	-
Диагностический реагент для РКОА (предлагаемый способ)	Сер.1	++++	++++	++++	++++	++++	+++	-	-	-	-
	Сер.2	++++	++++	++++	++++	++++	+++	-	-	-	-