способ раннего определения пола будущего ребенка

Формула изобретения

1. Способ раннего определения пола будущего ребенка в период с 5 по 12 неделю беременности, включающий забор биологической жидкости у женщины, разделение жидкости на клеточную фракцию и супернатант, выделение внеклеточной ДНК (внДНК) из клеточной фракции и выявление Y специфической последовательности в выделенной внДНК при помощи ПЦР-анализа с использованием подобранных праймеров, отличающийся тем, что в качестве биологической жидкости используют периферическую кровь или мочу, в качестве внДНК используют внДНК, связанную с поверхностью клеток крови или мочи, в качестве Y специфической последовательности выявляют последовательность DAZ, при этом в качестве праймеров используют систему праймеров:

прямой 5 -GGGAACTAATGACAAAAGAATTGAC-3 (Пр.1),

обратный 5 -AAGAAATAACTTCTGGGTGTGAATAAG-3 (Пр.2),

прямой 5 -GGGAAGAAATGACAAAAGAATTGAC-3 (Пр.3),

обратный 5 -AAGAAATAACGTCTGGGTGTGAATACG-3 (Пр.4)

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для проведения ПЦР-анализа в реальном времени используют следующий флюоресцентно-меченый зонд:

5 -(6-carboxyfluorescein) ATTTCACCAAAGTTTACCTTATACTGTG (6-carboxytetramethylrhdamme)-3 .

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области диагностической медицины, а именно к разработке способов неинвазивного определения пола будущего ребенка.

Определение пола ребенка на ранних сроках беременности является важной проблемой в медицине из-за существования заболеваний, сцепленных с полом, таких как гемофилия А и В, различные формы умственной отсталости, сцепленные с Х хромосомой, например синдром Мартина-Белла, прогрессирующие мышечные дистрофии Дюшенна и Беккера и другие. Для определения пола будущего ребенка используют такие способы, как ультразвуковое исследование, анализ плодных клеток из амниотической жидкости, крови пуповины или биоптатов ворсин хориона. Однако эти способы невозможно осуществить на ранних сроках беременности из-за маленького размера эмбриона и высокого риска прерывания беременности.

Известен способ определения пола будущего ребенка методом ультразвуковой диагностики (1). Способ позволяет определять пол ребенка при сроке беременности от 25 недель. Недостатком известного способа является поздний срок определения пола ребенка.

Известен способ определения пола будущего ребенка методом исследования амниотической жидкости (2). Исследование амниотической жидкости проводят начиная с 7-й недели беременности. Для взятия амниотической жидкости иглу вводят в живот матери, минуя плод, берут образец амниотической оболочки, содержащий зародышевые клетки, и используют последний для культивирования плодных клеток, из которых готовят препарат для хромосомного анализа.

Недостатком известного способа является повреждение плодных оболочек, увеличивающее риск выкидыша, а также длительный процесс подготовки клеток для хромосомного анализа.

Известен способ определения пола будущего ребенка с использованием плодных клеток, выделенных из кровотока матери, с последующим хромосомным анализом, выполняемым при помощи флуоресцентно-меченых зондов, направленных на выявление клеток, содержащих Х и Y хромосомы (3).

Недостатками известного способа являются низкая точность (плодные клетки, содержащие Y хромосому, обнаруживаются в 41,1%), а также наличие ложноположительных результатов (11,1%).

Известен способ определения пола будущего ребенка, основанный на обнаружении последовательности Y хромосомы в амниотической жидкости методом ПЦР в реальном времени (4).

Недостатком известного способа является невозможность определения пола ребенка раньше, чем на пятнадцатой неделе беременности, а также высокий риск выкидыша зародыша.

Наиболее ближайшим к заявляемому способу - прототипом является способ определения пола будущего ребенка путем выявления Y специфической последовательности SRY в плазме крови беременных женщин в период с 10 по 20 неделю беременности методом ПЦР в реальном времени (5), включающий следующие стадии: разделение крови на фракцию клеток крови и плазму, выделение внеклеточной циркулирующей ДНК из плазмы с использованием коммерческого набора Qiagen и определение пола будущего ребенка (мальчика в случае присутствия SRY последовательности и девочки в случае отсутствия данной последовательности в выделенной внеклеточной ДНК) при помощи ПЦР-анализа в реальном времени.

Недостатком прототипа является низкая точность определения пола будущего ребенка (анализ циркулирующей ДНК, выделенной из плазмы крови женщин, вынашивающих плод мужского пола, позволял определить SRY последовательность лишь в 31% образцов).

Технической задачей изобретения является повышение точности и надежности способа, а также расширение его функциональных возможностей.

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем:

у беременных женщин в период с 5 по 12 неделю беременности производят забор биологической жидкости - периферической крови или мочи, разделяют собранную жидкость на супернатант (плазму) и фракцию клеток (крови или мочи) при помощи центрифугирования. Далее из клеточной фракции элюируют внеклеточные дезоксирибонуклеиновые кислоты (внДНК), связанные с поверхностью клеток крови или мочи, выделяют внДНК из полученных элюатов и проводят выявление Y специфической последовательности DAZ с помощью ПЦР-анализа, используя систему праймеров, состоящую из двух прямых и двух обратных праймеров:

прямой 5 -GGGAACTAATGACAAAAGAATTGAC-3	(пр.1)
обратный 5 -AAGAAATAACTTCTGGGTGTGAATAAG-3	(пр.2)
прямой 5 -GGGAAGAAATGACAAAAGAATTGAC-3	(пр.3)
обратный 5 -AAGAAATAACGTCTGGGTGTGAATACG-3	(пр.4)

Прямой и обратный праймеры 1, 2 комплементарны элементу последовательности DAZ, повторенному 12 раз во внДНК плода, а праймеры 3, 4 комплементарны элементу последовательности DAZ, повторенному 8 раз. Таким образом, за один цикл ПЦР с каждой молекулы внДНК плода может образовываться до 20 копий ПЦР-продукта, что позволяет повысить точность выявления внДНК плода за счет увеличения количества ПЦР-продукта. Пары праймеров отличаются друг от друга не более, чем на 4 основания, а ПЦР-продукты, полученные с использованием праймеров 1, 2 и 3, 4, имеют одинаковую длину и последовательность, что позволяет использовать один и тот же флюоресцентно-меченный зонд для оценки результатов анализа методом ПЦР-анализа в реальном времени.

Продукты ПЦР, полученные при использовании подобранных праймеров (пр.1, пр.2, пр.3 и пр.4), анализируют с помощью электрофореза в 6% полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием.

Способ позволяет с большой точностью и надежностью определять пол будущего ребенка на ранних сроках беременности.

Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа, по сравнению с прототипом, являются:

1. В качестве Y специфической последовательности выявляют последовательность DAZ, что позволяет повысить точность определения пола будущего ребенка, поскольку участки, подходящие для амплификации большинства членов семейств, состоящих из копий выбранного гена, многократно повторены в внДНК плода, а также проводить определение пола ребенка на ранних сроках беременности, когда наблюдается низкая концентрация плодной ДНК в крови и моче матери. В прототипе используют последовательность однокопийного гена SRY.

Известно выявление Y специфической последовательности DAZ для определения азооспермии или олигоспермии, так как обнаружение делеции в этой последовательности, по литературным данным, корелирует с этими заболеваниями (6), однако выявление Y специфической повторяющейся последовательности DAZ в внДНК плода для определения пола будущего ребенка (мальчик) в известных научно-технических и патентных источниках не обнаружено.

2. Для ПЦР-анализа используют специально подобранную систему праймеров (пр.1, пр.2, пр.3, пр.4), комплементарных к разным участкам повторяющейся последовательности DAZ, что позволяет повысить точность выявления детектируемых повторов DAZ за счет увеличения числа этих повторов во внДНК. В прототипе используют праймеры, позволяющие детектировать только одну копию последовательности гена SRY.

3. В качестве диагностического объекта используют внДНК, связанные с поверхностью клеток крови или мочи, что позволяет значительно повысить точность выявления специфических последовательностей DAZ в внДНК на ранних сроках беременности, когда основная масса внДНК связана с клеточной поверхностью эритроцитов и лейкоцитов, а в плазме находятся лишь незначительные ее количества. ВнДНК, связанные с поверхностью клеток крови, могут быть связаны с клеточной поверхностью в виде свободных внДНК, а также в составе комплексов с белками, липидами, липопротеинами, в виде рибонуклеопротеиновых комплексов, нуклеосом и апоптических телец (7, 8).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.

Пример 1.

У группы женщин (N=35), из отделения гинекологии роддома №15, имеющих беременность 5-12 недель, для обоснования возможности постановки на учет женщин с X и Y сцепленными наследственными заболеваниями, были взяты образцы крови с целью определения пола будущего ребенка.

Образцы крови разделяли на плазму и фракцию клеток крови при помощи центрифугирования в течение 20 мин при 400 g. Далее элюировали внДНК, связанные с поверхностью клеток крови в две стадии: сначала отмывали клетки добавлением 10 объемов ФБР, содержащего 5 мМ ЭДТА при 4°С, с последующим осаждением клеток центрифугированием и сбором супернатанта, а затем элюцию проводили равным объемом 0,25% раствора трипсина при 4°С, с последующим добавлением ингибитора фермента, осаждением клеток центрифугированием и сбором супернатанта.

ВнДНК выделяли из полученных элюатов, а также плазмы (для сравнения) методом сорбции на стекловолокнистом сорбенте (9). После начальной термической обработки ДНК в течение 5 минут при 95°С добавляли 1 ед. Taq ДНК полимеразы (СибЭнзим, Россия) и проводили 45 циклов полимеразной цепной реакции для амплификации специфического участка (Y специфической последовательности DAZ) плодной внДНК в следующем режиме: 30 секунд при 94°С, 15 секунд при 62°С, 30 секунд при 72°С; с использованием системы праймеров (пр.1, пр.2, пр.3 и пр.4):

прямой 5 -GGGAACTAATGACAAAAGAATTGAC-3	(пр.1)
обратный 5 -AAGAAATAACTTCTGGGTGTGAATAAG-3	(пр.2)
прямой 5 -GGGAAGAAATGACAAAAGAATTGAC-3	(пр.3)
обратный 5 -AAGAAATAACGTCTGGGTGTGAATACG-3	(пр.4)

После окончания 45 циклов полимеразной цепной реакции реакционную смесь инкубировали 5 минут при 72°С и охлаждали до 4°С. Далее проводили электрофоретический анализ продуктов амплификации в 6% полиакриламидном геле.

При анализе образцов внДНК, связанных с поверхностью клеток крови, методом ПЦР-анализа в 24 образцах была выявлена последовательность DAZ. Пол ребенка - мальчик был подтвержден по факту рождения ребенка. При анализе плазмы этих же 24 образцов была выявлена последовательность DAZ лишь в 23 образцах, а в одном образце плазмы последовательность DAZ не была выявлена. В образцах внДНК из крови беременных женщин, у кого по факту рождения был подтвержден пол ребенка как девочка, данная последовательность не была выявлена.

Данный пример иллюстрирует, что заявляемый способ может быть использован для раннего определения пола будущего ребенка, что способствует своевременной диагностики заболеваний, сцепленных с полом.

Пример 2.

Пациентка В., 1976 г.р., имеющая в родословной Y сцепленное заболевание (гемофилия), обратилась в женскую консультацию больницы №1 СО РАН г.Новосибирска на 5-й неделе беременности. Выделение внДНК, циркулирующих в плазме (для сравнения), и из элюатов с поверхности клеток крови с дальнейшим ПЦР-анализом проводили аналогично примеру 1.

Далее проводили электрофоретический анализ продуктов амплификации в 6% полиакриламидном геле.

При анализе внДНК из элюатов с поверхности клеток крови и из плазмы была выявлена Y специфическая последовательность DAZ. Пол ребенка, мальчик, был подтвержден кариотипическим анализом клеток амниотической жидкости.

Пример 3.

Пациентка К., 1982 г.р., имеющая в родословной Х сцепленное заболевание (синдром Мартина-Белла), обратилась в женскую консультацию отделения "Центра новых медицинских технологий" г.Новосибирск на 12-й неделе беременности. У нее был взят образец мочи. Для выделения внДНК из мочи последнюю пропустили через систему, содержащую фильтрующий материал с диаметром пор не более 1,5 мкм (ватман 3ММ) и стекловолокнистый сорбент (стекловата), провели двухстадийную элюцию внДНК, связанных с поверхностью клеток мочи, находящихся на фильтрующем материале, путем промывания последнего фосфатным буферным раствором, содержащим 5 мМ ЭДТА, а затем 0,125% раствором трипсина, после чего фильтрующий материал удалили, а сорбент промыли от примесей ненуклеотидной природы и провели элюцию с последнего суммарного пула внДНК. Далее провели ПЦР-анализ Y специфической последовательности DAZ.

После начальной термической обработки внДНК в течение 5 минут при 95°С добавили 1 ед. Taq ДНК полимеразы (производства СибЭнзим, Россия) и провели 45 циклов полимеразной цепной реакции для амплификация Y специфической последовательности DAZ в внДНК в следующем режиме: 30 секунд при 94°С, 20 секунд при 62°С, 30 секунд при 72°С; с использованием системы праймеров, описанной в примере 1.

После окончания 45 циклов ПЦР реакционную смесь инкубировали 5 минут при 72°С и охлаждали до 4°С. Далее проводили электрофоретический анализ продуктов амплификации. При анализе внДНК из мочи методом ПЦР-анализа была выявлена Y специфическая последовательность DAZ. Пол ребенка, мальчик, был подтвержден по факту рождения ребенка.

Пример 4.

У группы женщин (N=7) из отделения патологии беременности роддома №15, имеющих беременность 5-12 недель, для обоснования возможности постановки на учет женщин с Х и Y сцепленными наследственными заболеваниями, были взяты образцы крови с целью определения пола будущего ребенка.

Выделение внДНК, циркулирующих в плазме (для сравнения), и из элюатов с поверхности клеток крови проводили аналогично примеру 1. В качестве контроля для определения количества суммарной внДНК использовали ДНК с известной концентрацией, разведенную от 50 до 5000 копий из расчета, что 6.6 пг ДНК на клетку соответствует 1 геномному эквиваленту. Количественное определение суммарной внДНК проводили методом ПЦР-анализа в реальном времени. В реакционную смесь добавляли AmplyTaq Gold ДНК полимеразу (Perkin Elmer) из расчета 0,025 ед. на 1 1 и AmpErase урацил-N-гликозилазу (Perkin Elmer) из расчета 0,01 ед. на 1 1. Затем реакционную смесь последовательно инкубировали 2 минуты при 50°С и денатурировали 10 минут при 95°С, после чего для обоих генов проводили 40 циклов полимеразной цепной реакции в следующем режиме: 1 минута при 60°С и 15 секунд при 95°С; при этом были использованы аналогичные примеру 1 праймеры и флуоресцентно-меченный зонд:

прямой 5 -GGGAACTAATGACAAAAGAATTGAC-3	(пр.1)
обратный 5 -AAGAAATAACTTCTGGGTGTGAATAAG-3	(пр.2)
прямой 5 -GGGAAGAAATGACAAAAGAATTGAC-3 ,	(пр.3)
обратный 5 -AAGAAATAACGTCTGGGTGTGAATACG-3	(пр.4)

5 -(6-carboxyfluorescein; FAM) ATTTCACCAAAGTTTACCTTATACTGTG (6-carboxytetramethylrhodamine; TAMPA)-3 (зонд).

Полученные данные представлены в таблице.

Таблица 1
Количество образцов	Кол-во беременных плодом мужского пола	Кол-во плодной внДНК в плазме (эквивалент генома/мл крови)	Кол-во внДНК из элюатов с поверхности клеток крови(эквивалент генома/мл крови)
7	5	1205,5*(0-2537)	2009,6(0-4396)
* - среднее значение

Из таблицы видно, что количество внДНК, выделенных из элюатов с поверхности клеток крови в группе женщин, вынашивающих плод мужского пола, в 1,7 раз выше по сравнению с количеством внДНК, выделенных из плазмы. Ни в одном образце внДНК из крови беременных женщин, у которых по факту рождения был подтвержден пол ребенка как девочка, данная последовательность не выявлялась.

Использование предлагаемого способа позволит, по сравнению с прототипом:

- повысить точность определения пола будущего ребенка за счет проведения ПЦР-анализа по многократно повторяющейся Y специфической последовательности плода DAZ;

- увеличить чувствительность выявления специфических Y специфических последовательностей DAZ в внДНК плода за счет использования в качестве праймеров системы праймеров, комплементарных к разным участкам повторяющейся последовательности DAZ;

- увеличить чувствительность детекции Y специфических последовательностей DAZ за счет использования в качестве диагностического объекта внДНК, связанных с поверхностью клеток крови или мочи, что особенно важно на ранних сроках беременности, так как основная масса внДНК связана с поверхностью клеток крови или мочи;

- расширить функциональные возможности способа за счет использования в качестве биологической жидкости для анализа не только крови (прототип), но и мочи беременных женщин.

Использование изобретения позволяет достоверно и точно определять пол ребенка на ранних сроках беременности в крови или моче женщины без использования инвазивных методов диагностики.