способ получения низкомолекулярного гепарина

Формула изобретения

Способ получения низкомолекулярного гепарина с помощью ферментативной деполимеризации, характеризующийся тем, что лизоцим в сухом виде добавляют к 1%-ному раствору гепарина в 0,1 М NaCl в весовом соотношении 1:100, перемешивают при 50°C в течение 3 ч, обессоливают на колонке с сефадексом и лиофильно высушивают.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для создания эффективного средства профилактики и лечения тромботических состояний (инфаркты, инсульты, тромбозы различной локализации).

В последнее десятилетие низкомолекулярные гепарины (НМГ) с более узким молекулярно-массовым распределением 4-6 кДа начали вытеснять нефракционированный гепарин (НФГ) как лекарственный препарат. Главное преимущество НМГ следует из их фармакокинетических свойств: в 2-4 раза большее время полувыведения из организма, заметно лучшая биодоступность при подкожном введении и более стабильная дозовая реакция (доза может быть рассчитана только исходя из веса пациента, без дополнительного лабораторного исследования). Меньший токсический эффект связан с вызываемой нефракционированным гепарином тромбоцитопенией, что, в свою очередь, обусловлено меньшим взаимодействием НМГ с тромбоцитами.

Ранее авторами была показана возможность получения НМГ под действием гидролитических ферментов, никогда с этой целью не использованных, таких как папани, химотрипсин, «протеаза С» или целловиридин [1].

Цель изобретения - получение НМГ с помощью фермента лизоцима яичного белка. Данная цель достигается тем, что для гидролиза используется фермент лизоцим. Он легко доступен, дешев. Ранее НМГ с помощью лизоцима никто не получал.

Лизоцим - мураминидаза, фермент класса гидролаз способен разрушать стенку бактериальной клетки, в результате чего происходит ее растворение (лизис). Он действует на один из основных компонентов бактериальной клетки - сложный полисахарид, состоящий из двух типов аминосахаров [2]. Известно применение лизоцима для гидролиза хитозана [3].

Наиболее близким по технической сущности является способ получения НМГ путем частичной деполимеризации под действием иммобилизованных гидролаз [1].

Сущность предложенного способа заключается в том, что в случае использования лизоцима добавляли фермент к раствору гепарина в 0,1 М NaCl в соотношении 1:100 и раствор термостатировали при температуре 50°C в течение 3 часов, обессоливали на колонке с сефадексом G-10. Высушивали лиофильно. С выходом около 70-80% получали гепарин с молекулярной массой на 40-50% ниже, чем у исходного гепарина.

Лизоцим, в виде раствора с целью деполимеризации гепарина, использован авторами впервые. При этом установлено, что анти Ха-активность целевого продукта составляет 139±8 ЕД/мг, что соответствует удельной активности такого препарата НМГ, как фраксипарин 120-160 ЕД/мг.

Авторы исследовали влияние низкомолекулярного гепарина (НМГр) с молекулярной массой 6,8 кДа, полученного с помощью гидролиза нефракционированного гепарина (НФГ "Белмедпрепараты" ОАО, молекулярная масса 13,8 кДа) лизоцимом в растворе на изменение времени свертывания плазмы крови человека в тесте активированного частичного тромбопластинового времени (аЧТВ, влияние на внутренний путь свертывания крови) и РеаКлот НПО "Ренам" (влияние на активность фактора Ха) [4]. Лиофильно высушенную плазму человека приобретали в НПО «Ренам». Для расчета специфических антитромбиновой (антифактор IIа, aIIa) и антифактор Ха (аХа) активностей использовали калибровочную кривую 1-го Международного стандарта низкомолекулярного гепарина (NIBSC).

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.

Пример 1. К 10 мл 1% раствора гепарина (молекулярная масса 13,8 кДа) в 0,1 М NaCl добавляли 1 мг лизоцима. Весовое соотношение фермента к навеске гепарина 1:100. Суспензию перемешивали при 50°C в течение 3 ч и обессоливали на колонке с сефадексом G-10 (2,5×42 см), элюент вода, скорость элюции 80 мл/ч, высушивали лиофильно. Получали 70 мг (70% от исходного) с молекулярной массой 6,8 кДа (НМГр).

Пример 2. К смеси 0,06 мл плазмы и 0,06 мл аЧТВ-реагента (НПО "Ренам") добавляли 0,05 мл растворов НФГ или НМГр в конечных концентрациях 0,14-2,20 мкг/мл. Через 3 мин инкубации при 37°С добавляли 0,06 мл 0,025 М раствора CaCl₂ и фиксировали время (сек) появления фибринового сгустка. Отмечали достоверное удлинение времени свертывания плазмы с увеличением концентрации образцов (Таблица 1). Антитромбиновые активности (aIIa) НФГ и НМГр при сравнении со стандартом составили 128±3 ЕД/мг и 120±5 ЕД/мг соответственно.

Пример 3. К смеси 0,099 мл плазмы и 0,025 мл раствора фактора Ха (НПО "Ренам") добавляли 0,01 мл растворов НФГ или НМГр в конечных концентрациях 0,07-0,47 мкг/мл. Через 2 мин инкубирования при 37°С добавляли 0,06 мл 0,035 М раствора

СаСl₂ и фиксировали время (сек) появления фибринового сгустка. Отмечали достоверное удлинение времени свертывания плазмы с увеличением концентрации образцов (Таблица 2). Активности против фактора Ха (аХа) для НФГ и НМГр при сравнении со стандартом составили 117±10 ЕД/мг и 139±8 ЕД/мг.

Таблица 1
Время появления сгустка плазмы (сек) в тесте активированного частичного тромбопластинового времени (аЧТВ)
шифр	Конечная концентрация, мкг/мл
0	0,22	0,27	0,3	0,36	0,43	0,54	0,72	1,1	2,2
НФГ	30,0±1,8	32,3±2,7	33,9±2,5	36,1±3,0*	37,2±3,3*	38±4,0*	43,4±3,8**	51,4±4,4**	69,5±6,7***	114,7±12,3***
НМГр	31,7±1,5	32,8±3,7	35,8±2,8	36,7±3,5*	37,5±3,5*	42,6±3,9**	49,9±4,1**	68,7±5,9***	110±9,9***
* - р<0.05, ** - р<0.01 и *** - р<0.001 достоверность различий с показаниями при конечной концентрации гепаринов 0 мкг/мл

Таблица 2
Время появления сгустка плазмы (сек) в тесте РеаКлот
шифр	Конечная концентрация, мкг/мл
0	0,07	0,14	0,18	0,23	0,28	0,35	0,47
НФГ	19,4±1,3	20,0±2,3	20,2±2,1	20,8±1,7	22,1±1,9	22,5±2,0	28,8±2,4**	37,9±2,8***
НМГр	20,9±1,5	21,8±1,9	24,5±2,1*	26,1±2,3**	27,2±1,9**	33,6±2,5***	43,8±3,1**
* - р<0.05, ** - р<0.01 и *** - р<0.001 достоверность различий с показаниями при конечной концентрации гепаринов 0 мкг/мл

Таким образом, при деполимеризации нефракционированного гепарина (отношение активностей aXa/aIIa=0,9) лизоцимом в растворе мы получаем гепарин с молекулярной массой, меньшей в сравнении с исходным НФГ. При этом отношение активностей аХа /aIIa увеличивается в 1,2 раза.

Список литературы

1. Г.Е.Банникова, В.П.Варламов, Н.Н.Дрозд, В.А.Макаров, В.Е.Тихонов, К.Г.Скрябин, патент РФ № 2295538 от 20 марта 2007 г., Бюлл. Открыт., № 5 (2007).

2. Бернхард С., Структура и функция ферментов. М., 1971.

3. Ильина А.В., Варламов В.П. Ферментативная деполимеризация N-сукцинилхитозана. Биоорг.Хим. 2007; 33(1):156-9.

4. Bates SM, Weitz JI // Circulation. 2005. V 112. N 4. P 53-60.