генетические конструкции, атакующие шесть новых мишеней рнк-интерференции в транскриптах вируса иммунодефицита человека 1 типа и подавляющие репродукцию вируса в клетках человека

Формула изобретения

1. Генетическая конструкция anti-HIV-1 на основе вектора siSTRIKE-neo, продуцирующая siPHK - ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа, содержащая фрагмент генома ВИЧ-1 длиной 23 bp, соответствующий консервативному району домена обратной транскриптазы генома ВИЧ-1 (2435 2457):

5'AAACATCAGAAAGAACCTCCATTcttcctgtcaAATGGAGGTTCTTTCTGATGTTTttttt3',

где строчными буквами показаны область петли между частями палиндрома, способного образовать двуспиральный дуплекс, а также область (Т)₅ на 3' конце, причем область, соответствующая смысловой цепи РНК вируса, показана жирным шрифтом в строке слева, а антисмысловой - справа.

2. Генетическая конструкция anti-HIV-2 на основе вектора siSTRIKE-neo, продуцирующая siPHK - ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа, содержащая фрагмент длиной 19 bp, соответствующий консервативному району домена обратной транскриптазы в геноме ВИЧ-1 (2309 2327):

5'ATAGTGATCTACCAATACActtcctgtcaTGTATTGGTAGATCACTATttttt3',

где строчными буквами показаны область петли между частями палиндрома, способного образовать двуспиральный дуплекс, а также область (Т)₅ на 3' конце, причем область, соответствующая смысловой цепи РНК вируса, показана жирным шрифтом в строке слева, а антисмысловой - справа.

3. Генетическая конструкция anti-HIV-3 на основе вектора siSTRIKE-neo, продуцирующая siPHK - ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа, содержащая фрагмент длиной 19 bp, соответствующий консервативному району домена интегразы в геноме ВИЧ-1 (3905 3923):

5'GTAGTGGAATCTATGAATActtcctgtcaTATTCATAGATTCCACTACttttt 3',

где строчными буквами показаны область петли между частями палиндрома, способного образовать двуспиральный дуплекс, а также область (Т)₅ на 3' конце, причем область, соответствующая смысловой цепи РНК вируса, показана жирным шрифтом в строке слева, а антисмысловой - справа.

4. Генетическая конструкция anti-HIV-4 на основе вектора siSTRIKE-neo, продуцирующая siPHK - ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа, содержащая фрагмент длиной 19 bp, соответствующий консервативному району домена белка U в геноме ВИЧ-1 (5366 5384):

5'GGACCATAGTGTATATAGActtcctgtcaTCTATATACACTATGGTCCttttt 3',

где строчными буквами показаны область петли между частями палиндрома, способного образовать двуспиральный дуплекс, а также область (Т)₅ на 3' конце, причем область, соответствующая смысловой цепи РНК вируса, показана жирным шрифтом в строке слева, а антисмысловой - справа.

5. Генетическая конструкция anti-HIV-5 на основе вектора siSTRIKE-neo, продуцирующая siPHK - ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа, содержащая фрагмент длиной 18 bp, соответствующий консервативному району домена белка GP120 в геноме ВИЧ-1 (6380 6397):

5'GGACAAGCCTTCTATACActtcctgtcaTGTATAGAAGGCTTGTCCttttt 3',

где строчными буквами показаны область петли между частями палиндрома, способного образовать двуспиральный дуплекс, а также область (Т)₅ на 3' конце, причем область, соответствующая смысловой цепи РНК вируса, показана жирным шрифтом в строке слева, а антисмысловой - справа.

6. Генетическая конструкция anti-GAG-1 на основе вектора siSTRIKE-neo, продуцирующая siPHK - ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа, содержащая фрагмент длиной 19 bp, соответствующий консервативному району домена белка Р17 в геноме ВИЧ-1 (3 21):

5'GCGAGAGCGTCAATATTAAttcaagagaTTAATATTGACGCTCTCGCttttt 3',

где строчными буквами показаны область петли между частями палиндрома, способного образовать двуспиральный дуплекс, а также область (Т)₅ на 3' конце, причем область, соответствующая смысловой цепи РНК вируса, показана жирным шрифтом в строке слева, а антисмысловой - справа.

7. Генетическая конструкция anti-HIV-1-27 на основе вектора siSTRIKE-neo, продуцирующая siPHK - ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа, содержащая фрагмент длиной 27 bp, соответствующий консервативному району домена обратной транскриптазы в геноме ВИЧ-1 (2435 2461):

5'AAACATCAGAAAGAACCTCCATTCCTTttcaagagaAAGGAATGGAGGTTCTTTCTGATGTTTttttt 3',

где строчными буквами показаны область петли между частями палиндрома, способного образовать двуспиральный дуплекс, а также область (Т)₅ на 3' конце, причем область, соответствующая смысловой цепи РНК вируса, показана жирным шрифтом в строке слева, а антисмысловой - справа.

8. Генетическая конструкция anti-HIV-2-27 на основе вектора siSTRIKE-neo, продуцирующая siPHK - ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа, содержащая фрагмент длиной 27 bp, соответствующий консервативному району домена обратной транскриптазы в геноме ВИЧ-1 (2304 2330):

5'CAGAAATAGTGATCTACCAATACATGGttcaagagaCCATGTATTGGTAGATCACTATTTCTGttttt 3',

где строчными буквами показаны область петли между частями палиндрома, способного образовать двуспиральный дуплекс, а также область (T)₅ на 3' конце, причем область, соответствующая смысловой цепи РНК вируса, показана жирным шрифтом в строке слева, а антисмысловой - справа.

9. Генетическая конструкция anti-HIV-3-27 на основе вектора siSTRIKE-neo, продуцирующая siPHK - ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа, содержащая фрагмент длиной 27 bp, соответствующий консервативному району домена интегразы в геноме ВИЧ-1 (3901 3927):

5'AGGAGTAGTGGAATCTATGAATAAAGAttcaagagaTCTTTATTCATAGATTCCACTACTCCTttttt 3',

где строчными буквами показаны область петли между частями палиндрома, способного образовать двуспиральный дуплекс, а также область (Т)₅ на 3' конце, причем область, соответствующая смысловой цепи РНК вируса, показана жирным шрифтом в строке слева, а антисмысловой - справа.

10. Генетическая конструкция anti-HIV-4-27 на основе вектора siSTRIKE-neo, продуцирующая siPHK - ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа, содержащая фрагмент длиной 27 bp, соответствующий консервативному району домена белка U в геноме ВИЧ-1 (5361..5388):

5'AGTGTGGACCATAGTGTATATAGAATATtcaagagATATTCTATATACACTATGGTCCACACTttttt 3',

где строчными буквами показаны область петли между частями палиндрома, способного образовать двуспиральный дуплекс, а также область (Т)₅ на 3' конце, причем область, соответствующая смысловой цепи РНК вируса, показана жирным шрифтом в строке слева, а антисмысловой - справа.

11. Генетическая конструкция anti-HIV-5-27 на основе вектора siSTRIKE-neo, продуцирующая siPHK - ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа, содержащая фрагмент длиной 27 bp, соответствующий консервативному району домена белка GP120 в геноме ВИЧ-1 (6376 6402):

5'ACCAGGACAAGCCTTCTATACAAACAGttcaagagaCTGTTTGTATAGAAGGCTTGTCCTGGTttttt 3',

где строчными буквами показаны область петли между частями палиндрома, способного образовать двуспиральный дуплекс, а также область (Т)₅ на 3' конце, причем область, соответствующая смысловой цепи РНК вируса, показана жирным шрифтом в строке слева, а антисмысловой - справа.

12. Генетическая конструкция anti-GAG-1-27 на основе вектора siSTRIKE-neo, продуцирующая siPHK - ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа, содержащая фрагмент длиной 27 bp, соответствующий консервативному району домена белка Р17 в геноме ВИЧ-1 (1 27):

5'GTGCGAGAGCGTCAATATTAAGCGGGGttcaagagaCCCCGCTTAATATTGACGCTCTCGCACttttt 3',

где строчными буквами показаны область петли между частями палиндрома, способного образовать двуспиральный дуплекс, а также область (Т)₅ на 3' конце, причем области, соответствующие смысловой цепи РНК вируса, показаны жирным шрифтом в строке слева, а антисмысловой - справа.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к областям медицинской и молекулярной генетики, а также к генотерапии и связано с выявлением новых мишеней для РНК-интерференции в вирусе иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) и созданием генетических конструкций, экспрессия которых приводит к атаке этих мишеней в транскриптах вируса и мощному ингибированию его репродукции в клетках человека. Данные генетические конструкции экспрессируют шпильки РНК, которые in vivo процессируются в биологически активные siPHK. Последние эффективно доставляются в белковые комплексы, осуществляющие разрезание транскриптов вируса, чем и достигается ингибирование его репродукции. Такие генетические конструкции, а также соответствующие им двуспиральные siPHK, могут быть использованы в медицине для генотерапии СПИДа и ВИЧ-инфекции, а также в научных исследованиях.

В настоящее время основным подходом к лечению СПИДа и ВИЧ-инфекции является назначение пациентам противовирусной химиотерапии, включающей препараты, действующие на ключевые ферменты ВИЧ-1 - обратную транскриптазу, интегразу, протеазу. Однако, несмотря на большое количество разработанных препаратов, существует проблема эффективности применяемой противовирусной терапии. Основная причина, объясняющая неэффективность лечения, - адаптивный мутагенез вируса, приводящий к появлению вариантов вируса, обладающих устойчивостью к противовирусным препаратам. Серьезными проблемами являются также токсичность и высокая стоимость применяемых лекарственных средств.

Известно применение рибозимов и антисмысловых РНК для терапии ВИЧ-инфекции [Dorman N. And Lever A.M. (2001) RNA-based gene therapy for HIV infection. HIV Med., 2, 114-122; Michienzi A., Conti L., Varano В., Prislei S., Gessani S., and Bozzoni I. (1998) Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication by nuclear chimeric anti-HIVribozymes in a human Т lymphoblastoid cell line. Hum. Gene Ther., 9, 621-628; Veres G., Junker U., Baker J., Barske C., Kalfoglou С., Ilves H., Escaich S., Kaneshima H., and Bohnlein E. (1998) Comparative analisis of intracellularly expressed antisense RNAs as inhibitors of human immunodeficiency virus type 1 replication. J. Virol., 72, 1894-1901], которые блокируют несколько генов ВИЧ, что снижает его активность.

Наиболее близким к данному изобретению являются генетические конструкции, обеспечивающие экспрессию siPHK внутри ВИЧ-инфицированных клеток организма (Заявка на патент США № 20030059944, МПК С12N 15/867, опубл. 27.03.2003 г.). Однако оценка действия интерферирующих РНК, продуцируемых в данных опубликованных генетических конструкциях, проводилась с использованием молекулярных клонов вируса иммунодефицита человека, что не позволяет прогнозировать их влияние на естественный пул вирусной популяции, заведомо обладающей генетическим разнообразием, что не допускает проведение более объективной оценки противовирусной эффективности таких генетических конструкций.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является выявление новых мишеней РНК-интреференции в вирусе и получение более эффективных генетических конструкций, содержащих палиндромы, предназначенные для образования "шпилек РНК". Экспрессия таких конструкций в клетках человека приводит к образованию интерферирующих РНК (siPHK). Предлагаемые генетические конструкции кодируют биологически активные siPHK, которые были отобраны с помощью двух тест-систем - невирусной и вирусной с использованием культур клеток человека и различных штаммов ВИЧ-1.

Представленный технический результат достигается путем создания восьми генетических конструкций на базе вектора psiSTRIKE ^TM Neomycin Vector (AC AY497508). Данные генетические конструкции содержат вставки ДНК, указанные в таблице 1.

В таблице 1 18-27-нуклеотидные области, соответствующие смысловой цепи РНК вируса, показаны в строке слева, а антисмысловой - справа. Последовательности ДНК представлены в ориентации 5'-3'. Строчными буквами показаны текст петли, образующейся в транскрипте после отжига комплементарных его областей, а также короткая область (dT)₅ на 3' конце конструкции, являющаяся терминатором для РНК полимеразы III. Тексты генетических конструкций соответствуют штамму ВИЧ-1 подтипа A (HIV-1 subtype А), номер последовательности в GenBank - AF316544. Первые шесть генетических конструкций имеют 18-23-нуклеотидные области, соответствующие смысловой цепи РНК вируса. Следующие шесть генетических конструкций ( № 7- 12 в табл.1) соответствуют тем же шести областям в смысловой цепи РНК вируса, но имеют длины в 27 нуклеотидов. Указанные конструкции предназначены для поражения областей мРНК, кодирующих консервативные области обратной транскриптазы (RT), интегразы (Int), вирусного трансмембранного белка U (Vpu), белка оболочки GP120 и белка матрикса Р17.

Указанные генетические конструкции тестировали с помощью невирусной системы. Данная система предназначена для количественной оценки биологической активности siPHK, которые образуются in vivo при экспрессии генетических конструкций. Она создана на базе вектора psiCHECK^TM-2 (Promega, номер последовательности в GenBank AY535007). Вектор содержит ген люциферазы светлячка и ген люциферазы коралла (Renilla). Указанные люцифезазы вызывают свечение разной длины волны и их экспрессию можно измерять с помощью люминометра. В 3' концевую некодирующую область гена Renilla вставляли короткие области генома вируса (домены), соответствующие выбранным мишеням РНК-интерференции в транскриптах вируса. Домены получали с помощью химического синтеза олигонуклеотидов ДНК. В таблице 2 представлены тексты доменов, которые клонировали в векторе psiCHECK^TM-2 по сайгам рестриктаз Xhol и Notl.

В таблице 2 строчными буквами показаны области, содержащие сайты рестрикции эндонуклеаз XhoI и NotI. В правой колонке приведены области генома вируса, которые соответствуют 27-30-нуклеотидным мишеням РНК-интерференции в последовательности AF316544.

Тестирование биологической активности siPHK проводят в экспериментах по ко-трансфекции культуральных клеток человека. При этом используют два препарата ДНК: генетической конструкции, содержащей промотор U6 РНК полимеразы III и кодирующей конкретную siPHK, а также ДНК psi-CHECK-2, содержащую клонированный домен, соответствующий данной siPHK (мишень РНК-интерференции). В клетках человека на генетических конструкциях экспрессируется вставка, содержащая палиндром. Синтезированная РНК образует шпильку, которая является природным субстратом Дайсера, фермента, вырезающего 19-23 нуклеодидные дуплексы РНК из шпильки. Если Дайсер работает на дуплексе РНК длиной более 19 пар нуклеотидов (природный субстрат), то далее он, оставаясь связанным с двуспиральной siPHK, активно участвуют также и в ее "загрузке" в белковый комплекс RISC. В данном комплексе происходит "раскручивание" цепей siPHK и освобождение его от одной из них (от так называемой "passengers-цепи). Если в комплексе остается антисмысловая siPHK, то она используется как "наводчик", узнающий комплементарную мишень в транскриптах клетки. После связывания комплекса с соответствующей мРНК происходит ее разрезание одним из его белков, что приводит к выключению экспрессии соответствующего гена вируса и нарушает его размножение в клетке-хозяине. В трансфецированных клетках мРНК Renilla, содержащая в 3'-некодирующей области испытываемую мишень РНК-интерференции, разрезается, что приводит к резкому снижению голубого свечения, вызываемого данной люциферазой (478 nm). Желто-зеленое свечение, вызываемое люциферазой светлячка Photinus pyralis (557 nm), кодируемой той же ДНК psiCHECK-2, служит внутренним контролем.

В настоящем исследовании использовали одиннадцать критериев для отбора последовательностей мишеней РНК-интерференции. Они важны для того, чтобы именно антисмысловая цепь siPHK оставалась в комплексе RISC. Кроме того, важно было провести отбор мишеней, менее подверженных адаптивному мутагенезу и иметь возможность использовать мощный промотор РНК полимеразы U6 человека. Каждая из приведенных в табл.1 вставок в генетических конструкциях соответствует, по крайней мере, десяти из одиннадцати ниже перечисленных критериев, которые использовались для отбора коровых 19-нуклеотидных последовательностей siPHK:

- состав G/C 30-52%

- не менее 3 A/U в позициях 15-19 смысловой цепи

- отсутствие внутренних повторов

- А в позиции 19 смысловой цепи

- А в позиции 3 смысловой цепи

- U в позиции 10 смысловой цепи

- отсутствие G/C в позиции 19 смысловой цепи

- отсутствие G в позиции 13 смысловой цепи

- отсутствие гомополимерных трактов (А)_4-5 или (Т)_4-5 в смысловой цепи

- локализация мишени в консервативном районе генома вируса

- отсутствие гомологии с известными транскриптами генома человека.

Часть вышеперечисленных критериев отбора биологически активных siPHK опубликована [Reynolds A., Leake D., Boese Q., Scaringe S., Marshall W.S., Khvorova A. (2004) Rational siRNA design for RNA interference. Nature Biotechnol. 22, 326-330] и представлена на сайге http://www.dharmacon.com.

Приведенные в табл.1 генетические конструкции обеспечивают целенаправленное воздействие на мРНК вируса в клетках человека с помощью siPHK, продуцирующихся в клетках. Терапевтическим результатом такого воздействия является подавление репродукции ВИЧ-1 в клетках человека.

Для вируса иммунодефицита человека первого типа характерно быстрое возникновение и отбор мутантных вариантов, обладающих резистентностью к различным противовирусным препаратам. Для решения проблемы вирусной изменчивости получена серия генетических конструкций, каждая из которых стабильно экспрессирует определенную siPHK.

Для оценки эффективности действия созданных генетических конструкций также используют и вирусную модель - культуру клеток человека, инфицированную различными штаммами ВИЧ-1, в частности штаммами, репродуцирующимися по типу острой и хронической инфекции. Такой подход позволяет проводить исследования, приближенные к реальным процессам развития ВИЧ-инфекции в организме. Применение лабораторных штаммов ВИЧ-1 (в отличие от молекулярных клонов вируса в прототипе) дает возможность оценивать влияние интерферирующих РНК на естественный пул вирусной популяции, заведомо обладающий генетическим разнообразием. Кроме того, вирусная модель тестирования биологической активности siPHK позволяет провести отбор не только эффективных siPHK, но и стерически доступных мишеней в транскриптах вируса. Биологически активная (по данным вышеописанной невирусной системы) siPHK может оказаться неактивной при тестировании на вирусной системе, т.к. в последнем случае мишень-домен РНК находится в другом контексте последовательностей РНК. Кроме того, он может быть связан с белками, участвующими в цикле размножения вируса, что также делает данную мишень в вирусной мРНК недоступной комплексу RISC, "заряженному" потенциально активной антисмысловой siPHK. Это также допускает проведение более объективной оценки противовирусной эффективности генетических конструкций.

На фиг.1 приведена физическая карта вектора psiSTRIKE-neo.

На фиг.2 приведена физическая карта вектора psiCHECK-2.

На фиг.3 представлены результаты проверки эффективности РНК-интерференции, вызываемой созданными генетическими конструкциями на невирусной тест-системе.

Пример 1. Описание генетических конструкций и способа их получения

Вектор psiSTRIKE-neo зарегистрирован в GenBank (Accession # AC AY497508), имеет размер 4,56 kb (kitobases - тысяча пар оснований) и характеризующаяся тем, что содержит:

старт-сайт РНК полимеразы Т7: 1

U6 прмотор РНК полимеразы III человека: 16-275

РНК полимеразы РНК полимеразы III человека: 276

промотор РНК полимеразы SP6: 329-348

старт-сайт РНК полимеразы SP6: 331

ранний энхансер/промотор вируса SV40: 600-1018

сигнал начала репликации вируса SV40: 916-981

ген neo: 1053-1847

синтетический поли(А): 1882-1930

ген -лактамазы: 2882-3742

промотор РНК полимеразы Т7: 4544-3.

В данный вектор, который поставляется Promega в линейной форме, вставляют химически синтезированные олигонуклеотиды ДНК, которые соответствуют генетическим конструкциям, продуцирующим шпильки РНК (табл.1).

Вектор psiCHECK-2 зарегистрирован в GenBank (Accession # AY535007), имеет размер 6,27 kb и характеризующаяся тем, что содержит:

ранний энхансер/промотор вируса SV40: 7-425

химерный интрон: 489-621

промотор РНК полимеразы Т7: 666-684

ген люциферазы Relilla: 694-1629

полилинкер: 1636-1680

синтетический поли(А): 1688-1736

промотор HSK-TK: 1744-2496

ген люциферазы светлячка: 2532-4184

поздний сигнал поли(А) SV40: 4219-4440

ген -лактамазы: 4587-5447.

В данном векторе в сайты XhoI и NotI полилинкера вставляют химически синтезированные олигонуклеотиды ДНК, которые соответствуют выбранным мишеням РНК-интерференции (табл.2).

Пример 2. Оценка эффективности РНК-интерференции, вызываемой созданными генетическими конструкциями в невирусной системе

Накануне проведения ко-трансфекции (за 18-20 часов) клетки НЕК293 рассевают в лунки 24-луночного планшета Nunc - по 50 тыс.клеток в 500 мкл культуральной среды DMEM (ПанЭко), содержащей глютамин и сыворотку (полная среда), на лунку. В день эксперимента готовят пробы ДНК для ко-трансфекции при комнатной температуре следующим образом (на одну экспериментальную точку). В 200 мкл среды DMEM, не содержащей сыворотки (SFM), добавляют 100 ng ДНК генетической конструкции в векторе siSTRIKE-neo (см. табл.1) и 10 ng ДНК плазмиды, содержащий соответствующий клонированный домен в векторе psiCHECK-2 (см. табл.2). После перемешивания добавляют 1 мкл свежеразмороженного реагента TransFast (Promega), встряхивают смесь и инкубируют ее 15 мин. Затем отсасывают среду из лунок с "сидящими" клетками, встряхивают пробирку со смесью ДНК-TransFast и сразу добавляют смесь в лунки с клетками. После инкубации 1 час при 37°С в СО₂-инкубаторе добавляют в лунки по 600 мкл среды с сывороткой, перемешивают и нкубируют планшет 48-72 ч.

Для измерения экспрессии люцифераз среду над клетками в лунках планшета отсасывают, добавляют 100 мкл раствора трипсина-ЭДТА (ПанЭко) на лунку, после 10 мин инкубации при 37°С в СО₂-инкубаторе добавляют по 100 мкл полной среды, переносят полностью суспензию клеток в пробирку эппердорф на 0.5 мл, осаждают центрифугированием при комнатной температуре в центрифуге Eppendorf (5 мин- 2000 rpm), надосадочную жидкость отсасывают, суспендируют клетки в 70 мкл 1xPBS и проводят измерение свечения люцифераз светлячка и Renilla согласно рекомендациям к набору Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) на люминометре Reporter Microplate Luminometer (Turner BioSystems). На фиг.3 показаны результаты испытания генетических конструкций на невирусной системе. Видно, что генетические конструкции специфически подавляют экспрессию мишеней на 60-96%.

Пример 3. Подавление репродукции вируса в культуре клеток МТ-4 путем введения в клетки генетических конструкций с помощью электропорации

Исследования проводят на перевиваемой линии лимфоидных клеток МТ-4. Клетки культивируют на среде RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки КРС, предварительно инактивированной прогреванием при 56°С в течение 30 минут, 300 мг/мл L-глютамина и 100 мкг/мл гентамицина.

Наработку и выделение ДНК плазмид проводят с помощью ацетата аммония согласно разработанной методике по подготовке ДНК для трансфекции клеток млекопитающих [Saporito-Irwin S.M., Geist R.T. and Gutmann D.H. (1997) Ammonium Acetate Protocol for the preparation of plasmid DNA Sutable for Mammalian Cell Transfections. BioTechniques 23(3), 424-427].

Клетки МТ-4 культивируют как описано выше 3 суток до концентрации 1,6 млн/мл, отмывают дважды средой RPMI, суспендируют в нужном объеме среды до концентрации 1×10⁷ кл/мл. К 800 мкл суспензии клеток добавляют 40 мкг плазмидной ДНК, выдерживают 15 мин во льду и переносят в кювету для электропорации. Электропорацию проводят при 400 Вт, 960 мкФ (Gene Pulser^R Transfection Apparatus, Bio-Rad). Продолжительность импульса 31-36 мс. После электропорации клетки переносят в среду RPMI с добавлением 10% фетальной сыворотки КРС. Эффективность введения плазмидной ДНК 92-98% (оценивают регистрацией появления зеленой флюоресценции с использованием флюоресцентного микроскопа "Olimpus"). Клетки инфицируют через 3 суток после электропорации с различной множественностью заражения. Для заражения используют супернатант инфицированных штаммом ГКВ-4046 ВИЧ-1 клеток со множественностью заражения 2-5×10^-1, 2-5×10^-2 и 2-5×10^-3 инфекционных единиц на клетку. Планшет инкубируют при 37°С четверо суток в атмосфере 5% СO ₂. Через 72 часа отбирают пробы для количественного определения вирусспецифического белка р24 методом прямого иммуноферментного анализа. Концентрацию и жизнеспособность клеток оценивают методом исключения трипанового синего. Влияние введения в клетки генетических конструкций на репродукцию вируса оценивают по накоплению вирусспецифического антигена р24. Результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3
№	Название конструкции	% подавления продукции вируса
1	anti-HIV-2	83
2	anti-HIV-3	67
3	anti-HIV-4	88
4	anti-HIV-5	69
5	anti-GAG-1	85

В клетках, содержащих генетические конструкции, наблюдается значительное подавление репродукции ВИЧ-1 по сравнению с нетрансфецированными клетками (до 88%). Выраженный противовирусный эффект наблюдается при заражении клеток высокой концентрацией вируса (количество вирусных частиц эквивалентно 1081,5 нг р24). Максимальное подавление вируса выявлено при заражении клеток через 72 часа после введения ДНК генетических конструкций.