рекомбинантный белок collbd-bmp-7, рекомбинантная плазмида pcollbd-bmp-7, штамм escherichia coli-продуцент рекомбинантного белка collbd-bmp-7, способ получения рекомбинантного белка collbd-bmp-7
Классы МПК: | C12N15/12 гены, кодирующие животные белки |
Автор(ы): | Лунин Владимир Глебович (RU), Карягина-Жулина Анна Станиславовна (RU), Сергиенко Ольга Васильевна (RU), Галушкина Зоя Михайловна (RU), Лаврова Наталья Витальевна (RU), Семихин Александр Сергеевич (RU), Шарапова Наталья Евгеньевна (RU), Котнова Алина Петровна (RU), Гинцбург Александр Леонидович (RU) |
Патентообладатель(и): | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2009-12-02 публикация патента:
10.01.2011 |
Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и медицине. Описан рекомбинантный белок Collbd-BMP-7, состоящий из коллагенсвязывающего домена Collbd (SPARC(w)), из внеклеточного кальцийзависимого белка SPARC (ВМ-40 или остеонектина) человека и спейсерной последовательности GGS. Предложен способ его получения, включающий выращивание штамма E.coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-7]. Представлены соответствующий штамм и плазмида. Изобретение позволяет обеспечить высокий уровень продукции рекомбинантного белка Collbd-BMP-7 и одновременно простую и эффективную схему очистки этого белка с иммобилизацией его на коллагенсодержащем сорбенте, входящем в состав нового поколения изделий и материалов медицинского назначения - имплантатов и покрытий. 4 н.п. ф-лы, 1 ил.
Формула изобретения
1. Рекомбинантный белок Collbd-BMP-7, состоящий из коллагенсвязывающего домена Collbd из внеклеточного кальций зависимого белка SPARC человека с последовательностью SEQ ID NO: 2, спейсера из остатков глицина и серина с последовательностью SEQ ID NO: 3 и костного морфогенетического белка ВМР-7 с последовательностью SEQ ID NO: 4, обладающий биологическими свойствами белка BMP-7 и способностью самопроизвольно связываться с коллагенсодержащим сорбентом.
2. Рекомбинантная плазмида pCollbd-BMP-7 с последовательностью SEQ ID NO: 1, обеспечивающая экспрессию рекомбинантного белка Collbd-BMP-7 по п.1, содержащая
искусственный бактериальный оперон химерных белков, включающий промоторную область раннего промотора бактериофага Т5, обеспечивающий эффективную транскрипцию контролируемой мРНК;
рекомбинантный ген, обеспечивающий экспрессию целевого химерного белка по п.1;
нетранслируемую область терминации транскрипции бактериального оперона, обеспечивающую эффективное окончание транскрипции;
бактериальный оперон bla, кодирующий белок бета-лактамазу, являющуюся селективным маркером для отбора клонов-трансформантов Е.coli методом контрселекции;
бактериальный участок инициации репликации типа ColEl, обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах E.coli.
3. Штамм Escherichia coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-7], полученный трансформацией штамма Escherichia coli M15/pREP4 плазмидой pCollbd-BMP-7 по п.2, - продуцент рекомбинантного белка Collbd-BMP-7 по п.1.
4. Способ получения рекомбинантного белка Collbd-BMP-7 по п.1, включающий выращивание клеток штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-7], индукцию синтеза белка Collbd-BMP-7 по п.1, разрушение клеток, получение супернатанта, содержащего белок, иммобилизацию белка путем добавления к супернатанту суспензии коллагенсодержащего сорбента, инкубирование, отмывание сорбента со связавшимся белком, последующую элюцию белка с сорбента и диализ.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и медицине и может быть использовано для производства рекомбинантного белка, иммобилизованного на коллагенсодержащем носителе, входящем в состав нового поколения изделий и материалов медицинского назначения - имплантатов, покрытий и пр.
Хорошо известно, что процесс формирования костной ткани зависит от активности клеток, участвующих в остеогенезе, и от влияния ростовых факторов, так называемых остеоиндуктивных белков. Около 40 лет назад Marshall R. Urist обнаружил, что внеклеточный костный матрикс содержит субстанцию, стимулирующую формирование костной ткани (Urist MR. Bone: formation by autoinduction. Science 1965; 150: 893-9.) Эти соединения, названные позже костные морфогенетические белки (bone morphogenetic proteins, BMPs), стали объектами пристального изучения и разработки на их основе терапевтических препаратов. Дальнейшие исследования привели к выделению индивидуальных BMP, способных стимулировать образование костной ткани мезенхимальными стволовыми клетками (Reddi АН. Bone morphogenetic proteins: from basic science to clinical applications. J. Bone Joint Surg. Am. 2001; 83-A (Suppl. 1): S1-S6).
На сегодняшний день идентифицировано более 20 типов BMP человека. Первый рекомбинантный BMP - BMP-7 - был получен в 1990 г. (Sampath TK, Maliakal JC, Hauschka PV et al. Recombinant human osteogenic protein-1 (hOP-1) induces new bone formation in vivo with a specific activity comparable with natural bovine osteogenic protein and stimulates osteoblast proliferation and differentiation in vitro. J. Biol. Chem. 1992; 267: 20352-62). Однако добиться экспрессии рекомбинантного ВМР-7 в клетках Е.coli не удалось.
Введение биологически активных компонентов с помощью добавления их растворимых форм или пропитки ими материалов обеспечивает лишь кратковременный эффект. Это связано с их быстрым удалением из поврежденного участка, даже при введении ростовых факторов в материал покрытия. Более длительный эффект вызывает иммобилизация биологически активных компонентов непосредственно в раневом покрытии. Таким образом, весьма перспективным подходом для развития методов реконструктивной хирургии является создание материалов и покрытий, несущих на поверхности иммобилизованные специфические факторы роста, и изучение их влияния на приживаемость имплантата.
Однако процессы иммобилизации этих белков, основанные, как правило, на химической пришивке, многостадийны, трудоемки, дорогостоящи и небезопасны с точки зрения обеспечения экологической безопасности производства. Важной проблемой остается разработка методов очистки конечных продуктов от липополисахаридов, балластных белков, ДНК и РНК штаммов-продуцентов; получение функционально активных биологических компонентов.
Аналогов препаратов ВМР-7, иммобилизованного на коллагенсодержащем носителе за счет аффинного взаимодействия, в доступных источниках информации не обнаружено.
В основу заявленной группы изобретений положена задача создания штамма Е.coli, обеспечивающего высокий уровень продукции рекомбинантного белка Collbd-BMP-7 и одновременно простую и эффективную схему очистки упомянутого белка, с иммобилизацией его на коллагенсодержащем сорбенте, входящем в состав нового поколения изделий и материалов медицинского назначения - имплантатов и покрытий.
Упомянутая задача решена за счет синтеза рекомбинантного белка Collbd-BMP-7, в частности за счет введения в состав рекомбинантного белка коллагенсвязывающего домена Collbd (SPARC(w)), из внеклеточного кальцийзависимого белка SPARC (ВМ-40, или остеонектина) человека. А также за счет введения между функциональными доменами спейсерной последовательности GGS для сохранения функции активации клеточного роста слитными белками, связанными с коллагеновым матриксом. Помимо этого упомянутая задача решена за счет возможности одностадийной высокоэффективной очистки рекомбинантного белка Collbd-BMP-7, содержащего коллагенсвязывающий домен, и иммобилизации его на коллагенсодержащем нанокомпозитном покрытии.
Сущность изобретения состоит в том, что рекомбинантная плазмида pCollbd-BMP-7 размером 3525 п.н. обеспечивает экспрессию рекомбинантного белка Collbd-BMP-7, состоящего из коллагенсвязывающего домена Collbd из внеклеточного кальцийзависимого белка SPARC человека, спейсера из остатков глицина и серина и костного морфогенетического белка BMP-7, и содержит:
- искусственный бактериальный оперон химерных белков, включающий: промоторную область раннего промотора бактериофага Т5 (7-87 п.н.), обеспечивающую эффективную транскрипцию контролируемой мРНК; рекомбинантный ген, обеспечивающий экспрессию целевого химерного белка (коллагенсвязывающий домен Collbd - спейсер - костный морфогенетический белок BMP-7) (117-623 п.н.); нетранслируемую область терминации транскрипции бактериального оперона, обеспечивающую эффективное окончание транскрипции (663-757 п.н.);
- бактериальный оперон bla (3320-2460 п.н. комплементарной цепи), кодирующий белок бета-лактамазу, являющуюся селективным маркером для отбора клонов-трансформантов Е.coli методом контрселекции;
- бактериальный участок инициации репликации типа ColE1 (1630 п.н.), обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах Е.coli.
Штамм Escherichia coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-7] получен трансформацией штамма Escherichia coli M15/pREP4 плазмидой pCollbd-BMP-7. Полученный штамм является продуцентом рекомбинантного белка Collbd-BMP-7, состоящего из коллагенсвязывающего домена Collbd из внеклеточного кальцийзависимого белка SPARC человека, спейсера из остатков глицина и серина и костного морфогенетического белка ВМР-7.
Рекомбинантный белок Collbd-BMP-7, состоящий из коллагенсвязывающего домена Collbd из внеклеточного кальцийзависимого белка SPARC человека, спейсера из остатков глицина и серина и костного морфогенетического белка BMP-7, обладает биологическими свойствами белка BMP-7 и способностью самопроизвольно связываться с коллагенсодержащим сорбентом.
Способ получения рекомбинантного белка Collbd-BMP-7 включает выращивание клеток штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-7], индукцию синтеза белка Collbd-BMP-7, разрушение клеток, получение супернатанта, содержащего белок, иммобилизацию белка путем добавления к супернатанту суспензии коллагенсодержащего сорбента, инкубирование, отмывание сорбента со связавшимся белком, последующую элюцию белка с сорбента и диализ.
Техническим результатом заявленного изобретения является обеспечение высокого уровня продукции рекомбинантного белка Collbd-BMP-7 и одновременно обеспечение простой и эффективной схемы очистки этого белка с иммобилизацией его на коллагенсодержащем сорбенте, входящем в состав нового поколения изделий и материалов медицинского назначения - имплантатов и покрытий.
Таким образом, технический результат достигается за счет того, что создана рекомбинантная плазмида pCollbd-BMP-7, кодирующая бифункциональный рекомбинантный белок Collbd-BMP-7, с одной стороны, содержащий аминокислотную последовательность BMP-7, а с другой, обладающий способностью самостоятельно связываться с коллагенсодержащим сорбентом благодаря наличию коллагенсвязывающего домена Collbd из внеклеточного кальцийзависимого белка SPARC человека.
Также указанный технический результат достигается тем, что штамм Escherichia coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-7] является продуцентом рекомбинантного белка Collbd-ВМР-7. При этом отсутствие в клетках Е.coli белков, способных связываться с коллагеном, служит гарантией того, что рекомбинантный белок Collbd-BMP-7 является единственным белком штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-7], прочно связывающимся с используемым сорбентом, что обеспечивает возможность одностадийного получения высокоочищенного препарата указанного рекомбинантного белка, иммобилизованного на коллагенсодержащем сорбенте.
Штамм Е.coli M15 [pREP4], содержащий плазмиду pCollbd-BMP-7, - продуцент рекомбинантного белка Collbd-BMP-7 - характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидные, неподвижные, грамотрицательные. При рассеве на чашке с 1,5% LB-агаром рост в виде отдельных колоний, иногда в R-форме с неровными краями. Хорошо растет на плотных и жидких питательных средах (LB-бульон, LB-aгap, МПА, МПБ).
Физиолого-биохимические признаки. Клетки растут в пределах +4 - 42°C при оптимуме рН 6,8-7,5. Штаммы разлагают глюкозу, маннит с образованием кислоты, не разлагают сахарозу, арабинозу, галактозу, сбраживают мальтозу, ксилозу, сорбит, рамнозу. Существенной при использовании данных штаммов является их чувствительность к налидиксовой кислоте (25 мг/мл), стрептомицину (20 мг/мл) и рифампицину (25 мг/мл). Проявляют устойчивость к ампициллину (до 100 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды pCollbd-BMP-7, и к канамицину (до 25 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды pREP4.
Указанный технический результат достигается также тем, что рекомбинантный белок pCollbd-BMP-7, включающий в себя аминокислотную последовательность, определяющую способность данного белка связываться с коллагенсодержащим сорбентом, позволяет проводить в одну стадию концентрирование, очистку и иммобилизацию белка Collbd-BMP-7 на коллагенсодержащем сорбенте.
Достигается указанный технический результат также тем, что способ очистки, концентрирования и получения иммобилизованного рекомбинантного белка Collbd-BMP-7 заключается в обработке супернатанта гидролизата клеток штамма E.coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-7] коллагенсодержащим сорбентом с последующей отмывкой сорбента с иммобилизованным рекомбинантным белком.
Изобретение проиллюстрировано чертежом.
На чертеже представлена схема плазмиды pCollbd-BMP-7.
В перечне последовательностей: нуклеотидная последовательность плазмиды pCollbd-BMP-7 - последовательность № 1, аминокислотная последовательность белка коллагенсвязывающего домена Collbd - последовательность № 2, аминокислотная последовательность глицин-серинового спейсера - последовательность № 3, аминокислотная последовательность костного морфогенетического белка BMP-7 - последовательность № 4.
Все стандартные генно-инженерные и микробиологические манипуляции, а также амплификацию и секвенирование ДНК проводили по известным методикам (Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984; Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д.Гловера. Пер. с англ., М.: Мир, 1988; Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Sharf S.J., Higuchi R., Horn G.T., Mullis K.B., Erlich H.A. Science, 1988. V.239, № 4839, p.487-491; Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, V.74, p.5463-5467).
Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.
Примеры.
Пример 1. Получение плазмиды pQE6-BMP-7.
а) Химический синтез олигодезоксирибонуклеотидов.
Олигодезоксирибонуклеотиды были синтезированы твердофазным фосфорамидитным методом с помощью синтезатора АСМ 100-2 (Новосибирск) и очищены методом электрофореза в 12%-ном ПААГ.
б) Получение гена ВМР-7 с последующим его клонированием.
Копию гена BMP-7 получали методом полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Для этого проводили выделение тотальной РНК человека из скелетной мышцы человека. кДНК получали путем обработки 100ng полиаденилированной РНК скелетной мышцы человека с помощью ImProm-II обратной транскриптазы Promega согласно протоколу производителя.
Для последующей ПЦР были выбраны праймеры, соответствующие началу и концу гена BMP-7. В прямой праймер был введен сайт BamHI, а в обратный - сайты BglII, Kpn2I и стоп-кодон.
DIR: 5'-GGATCCAGATCCTCCACGGGGAGCAAACAGCGCA-3'
REV: 5'-TCCGGACTAAGATCTGTGGCAGCCACAGGCCCGGA-3'
2 мкл полученной в результате обратной транскрипции смеси вносили в реакционную смесь для ПЦР, которая содержала 10 пкМ каждого праймера (Dir и Rev), 67 мМ трис-HCl (рН 8,8 при 25°C), 15 мМ сульфата аммония, 2,5 мМ хлористого магния, 0,01% Твин-20, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ по 2,5 мМ) и 1 ед. полимеразы Native Pfu Polymerase (Stratagene). Реакцию амплификации проводили в объеме 25 мкл под вазелиновым маслом: 1 цикл 95°C - 3 мин; 35 циклов: 95°C - 15 сек, 72°C - 1 мин.
Продукт амплификации размером 444 п.н. обрабатывали хлороформом, переосаждали этиловым спиртом и растворяли в воде. Для клонирования данного продукта полученную ДНК ВМР-7, а также ДНК плазмиды pQE6 («Qiagene», США) гидролизовали рестрикционными эндонуклеазами BamHI и BspEI при 37°C в буфере, содержащем 66 мМ Трис-ацетат (рН 7,9 при 37°C), 20 мМ ацетата магния, 132 мМ ацетата калия и 0,2 мг/мл BSA в течение 1,5 ч.
Выделенные из геля рестрикционные фрагменты: фрагмент ДНК, соответствующий гену BMP-7 размером 438 п.н., фрагмент плазмиды pQE6 размером 3024 п.н. лигировали с помощью ДНК-лигазы бактериофага Т4. Эту конструкцию использовали для трансформации клеток E.coli M15 [pREP4] методом электропорации. Трансформированные клетки отбирали на агаризованной среде LB с антибиотиками ампициллином и канамицином. Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса, анализировали с помощью рестриктаз BamHI и Kpn2I, а также рестриктаз, находящихся внутри клонируемых фрагментов, и отбирали клоны, плазмидная ДНК которых рВМР-7 размером 3462 н.п. содержит последовательность гена BMP-7.
Первичную структуру полученной плазмиды подтверждали секвенированием.
г) Получение участка гена SPARC, содержащего последовательность коллагенсвязывающего домена Collbd, с последующим его клонированием в плазмидную конструкцию pQE6-BMP-7.
Коллагенсвязывающий домен Collbd из внеклеточного белка SPARC (ВМ-40 или остеонектин) человека был синтезирован с использованием 4-х олигонуклеотидов следующего состава:
Dir1: CATGGGATCCCTGGACTCTGAACTGACCGAATTCCCGCTGCGCATGCGT
Dir2: GACTGGCTGAAAAACCCGGGTGGTTCTA
Rev1: GATCTAGAACCACCCGGGTTTTTCAGCCAGTCACGCATG
Rev2: CGCAGCGGGAATTCGGTCAGTTCAGAGTCCAGGGATCC.
Олигонуклеотиды были спланированы таким образом, что при гибридизации они образуют двуцепочечный фрагмент ДНК, содержащий липкие концы, соответствующие сайтам гидролиза рестриктаз NcoI и BglII. При синтезе олигонуклеотиды были фосфорилированы по 5' - концу.
Для получения двухцепочечного фрагмента ДНК смесь олигонуклетидов (по 20 пкМ), прогревали при 95°С (10 мин) и в течение 4 часов охлаждали до 25°С. Полученную смесь объединяли с фрагментом плазмиды pQE6-BMP2 (3376 п.н.), гидролизованной эндонуклеазами рестрикции NcoI и BamHI при 37°C в буфере, содержащем 66 мМ Трис-ацетат (рН 7,9 при 37°C), 20 мМ ацетат магния, 132 мМ ацетат калия в течение 1,5 часов. Лигирование проводили с помощью ДНК-лигазы фага Т4 в буфере, содержащем 40 мМ Трис-HCl (рН 7,8 при 25°C), 10 мМ хлористого магния, 10 мМ ДТТ и 5 мМ АТФ. Лигированную смесь ДНК использовали для трансформации клеток Е.coli M15 [pREP4] методом электропорации. Трансформированные клетки отбирали на агаризованной среде LB с антибиотиками канамицином (25 мкг/мл) и ампициллином (100 мкг/мл). Из отобранных рекомбинантных клонов выделяли плазмидную ДНК pCollbd-BMP-7 методом щелочного лизиса. Отобранные клоны секвенировали и подтвердили наличие вставки, соответствующей коллагенсвязывающему домену Collbd из внеклеточного белка SPARC (или ВМ-40, или остеонектина) человека.
Пример 2. Получение штамма Е.coli - продуцента рекомбинантного белка Collbd-ВМР-7, состоящего из ВМР-7, спейсера и коллагенсвязывающего домена Collbd (SPARC(w)).
Для получения штамма Е.coli - продуцента рекомбинантного белка Collbd-BMP-7 - клетки штамма Е.coli M15 [pREP4] (Nals, Strs, rifs, lac-, ara-, gal- , mtl-, F-, recA+, uvr+ ) трансформировали плазмидой pCollbd-BMP-7. Трансформированные клетки выращивали в 500 мл среды LB при 37°C до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 600 нм, индуцировали 150 мкл 0,1 М раствора изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида и выращивали в течение 8 часов.
Для контроля продукции рекомбинантного белка Collbd-BMP-7 клетками штамма Е.coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-7] применяли метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Разделение белков проводили в 12%-ном полиакриламидном геле в стандартной системе буферов (электродный буфер: 25 мМ Трис-HCl, 192 мМ глицин, 0,1% додецилсульфат натрия, рН 8,3; буфер для геля: 375 мМ Трис-HCl, рН 8,8). По окончании электрофореза гели окрашивали 0,15% раствором Кумасси G250 в 25% изопропаноле и 10% уксусной кислоте и отмывали в 10% уксусной кислоте. При сравнении спектра белков у штаммов Е.coli M15 [pREP4] и Е.coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-7] обнаруживали появление дополнительной белковой полосы с молекулярной массой 18,8 кДа, что соответствует молекулярной массе рекомбинантного белка Collbd-BMP-7.
Уровень синтеза белка Collbd-BMP-7 определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка - стандарта молекулярной массы.
Согласно полученным данным клетки штамма Е.coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-7] синтезируют около 10% Collbd-BMP-7 от общего белка клеток.
Пример 3. Способ получения препарата белка Collbd-BMP-7, иммобилизированного на коллагенсодержащем сорбенте.
Клетки Е.coli M15 [pREP4], трансформированные плазмидой pCollbd-BMP-7, выращивали в 3,5 мл среды LB с ампициллином и канамицином при 37°C до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 600 нм, добавляли 3 мкл 0,1 М раствора изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида и выращивали в течение 4 ч. Культуру разводили до оптической плотности 0,7 при 530 нм, отбирали 400 мкл суспензии, осаждали клетки центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин. Клетки ресуспендировали в 500 мкл фосфатно-цитратного буфера (ФЦБ, 50 мМ, рН 6.0), разрушали ультразвуком, клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 16000 об/мин в течение 10 мин.
К 100 мкл 50% суспензии желатин-сефарозы добавляли 2 мл буферного раствора, содержащего 30 мМ Трис, рН 8,0, и 0,15 М хлорида натрия, а также лизат клеток в 7 М растворе гуанидинхлорида. Инкубировали при +4°C в течение 2 ч, затем оставляли на 16 ч при той же температуре. Центрифугировали полученную суспензию в течение 5 мин при 5000 об/мин. Осадок сорбента со связавшимся белком трижды отмывали буферным раствором, содержащим 30 мМ Трис, рН 8,0, и 0,15 М хлорида натрия.
Элюцию белка проводили буферным раствором, содержащим 6 М мочевины, 30 мМ Трис, рН 8,0 и 10 мМ ЭДТА. Анализ результатов связывания и элюции белка Collbd-BMP-7 проводили методом электрофореза по Лэммли в 12% ПААГ в денатурирующих условиях.
По результатам электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН концентрация белка составляла 20 мг на 1 мл сорбента.
Класс C12N15/12 гены, кодирующие животные белки