способ получения средства, обладающего антимикробной, противовоспалительной и противоожоговой активностью из плодового тела гриба трутовика (fomitopsis officinalis bond.)

Формула изобретения

Способ получения средства, обладающего противовоспалительной, антимикробной, противоожоговой активностью, отличающийся тем, что сырьем является плодовое тело гриба трутовика, которое измельчают до размера частиц не более 0,25 мм, экстрагируют смесью хлороформ:спирт этиловый 96% (1:2) при соотношении сырья и экстрагента 1:40 в течение 120 ч, упаривают при температуре 50-60°С до остаточной влажности 5%, высушивают при температуре 60°С и давлении 0,5 атм до полного удаления хлороформа и спирта этилового, полученную массу растворяют в спирте этиловом 70% в соотношении 1:10.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и касается способов получения препаратов из природного сырья (грибов), которое может быть использовано в качестве наружного антимикробного, противовоспалительного, противоожогового средства.

Известны антимикробные, противоожоговые, противовоспалительные средства, полученные на основе природного сырья (растений): настойка календулы [Регистр лекарственных средств России / Под ред. Ю.Ф.Крылова.- М., 1993. - С.446.], галеновые препараты алоэ [Соколов С.Я. Фитотерапия и фитофармакология. - М., 2000.- С.203] и другие. Наиболее близким прототипом является настойка календулы, характеризующаяся противовоспалительным, противоожоговым, антимикробным (по отношению к стафилококкам, стрептококкам) действием.

Способ получения настойки календулы заключается в следующем:

цветки и цветочные корзинки календулы (ноготков) экстрагируют 70% спиртом этиловым, из одной весовой части сырья получают 10 объемных частей готовой продукции. Сырье заливают 70% спиртом этиловым и настаивают в течение 7 суток. По истечении этого срока вытяжку сливают, остаток отжимают на прессе и присоединяют к вытяжке. Измеряют объем настойки. В случае необходимости остаток промывают небольшим количеством спирта этилового 70%, отжимают, отжатую вытяжку присоединяют к слитому извлечению. Полученное извлечение отстаивают при температуре не выше 10°C не менее 2 суток и фильтруют [Государственная фармакопея СССР. - М., Медицина, 1989.- Вып.2. - С. 148-149; Муравьев И.А. Технология лекарств: В 2-х Т. - М., 1980. - Т.1- С.174].

Недостатком настойки календулы является низкая антибактериальная активность. По этой причине при инфицированных поражениях кожи обычно практикуют комбинированное применение настойки календулы и антибиотиков. Использование антибиотиков часто сопровождается дерматитами, аллергией, кандидамикозами [Машковский М.Д. Лекарственные средства: В 2-х Т. - М., Медицина, 1988. - Т.2 - С.199-222].

Вместе с тем перечень вытяжек, получаемых из растительного сырья и обладающих антимикробным, противовоспалительным и противоожоговым действием, ограничен. Следовательно, расширение арсенала препаратов для наружного применения, характеризующихся антимикробным и противоожоговым действием, является актуальной задачей.

Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка способа получения средства из плодового тела гриба трутовика (Fomitopsis officinalis Bond, et Sing. сем. Polyporaceae), обладающего антимикробной, противовоспалительной, противоожоговой активностью.

Поставленная задача достигается тем, что для получения средства плодовое тело трутовика, измельченное до размера частиц не более 0,25 мм, экстрагируют смесью хлороформ - спирт этиловый 96% (1:2) до полного истощения сырья. Полученное извлечение упаривают при температуре 50-60°C до состояния густой массы, затем высушивают при температуре 100°C до остаточной влажности 5%. Массу растворяют в спирте этиловом 70% в соотношении 1:10.

В литературе отсутствуют данные о возможности применения извлечения из плодового тела гриба трутовика в качестве противовоспалительного и противомикробного средства. Извлечение из плодового тела гриба трутовика можно использовать в медицинской практике для лечения ран, сопровождающихся инфицированием кожи. Данные свойства явным образом не вытекают для специалиста из уровня техники. Таким образом, предлагаемые решения соответствуют критериям изобретения - «новизна», «изобретательский уровень», «промышленно применимо».

Применение в качестве экстрагента смеси хлороформ-спирт этиловый 96% гарантирует максимальную экстракцию липофильных веществ из плодового тела гриба трутовика. Температурный режим, продолжительность экстракции выявлены экспериментально и гарантируют оптимальность технологического процесса.

Пример конкретного выполнения способа

Около 100 г плодового тела трутовика измельчают до размера частиц не более 0,25 мм, экстрагируют смесью хлороформ - спирт этиловый 96% (1:2) при суммарном соотношении сырья и экстрагента 1:40 в течение 120-ти часов до полного истощения сырья. Параллельно определяют влажность сырья. Все измерения проводят с точностью до 0,0002 г.

Полноту извлечения липофильных веществ контролируют методом тонкослойной хроматографии на пластинках «Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ». Для этого используют две системы растворителей: № 1 (хлороформ:уксуснаякислота:вода 13:2,5:1) и № 2 (уксусная кислота - н-гексан - диэтиловый эфир 2:1:4). Хроматограммы, полученные с использованием системы № 1, детектировали раствором бромкрезолового зеленого 0,4% [Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. - М: Химия, 1971. - С.108; Кейтс М. Техника липидологии.- М.: Мир, 1975.- 322 с.]. При полном извлечении насыщенных жирных кислот отсутствуют пятна желтого цвета. Хроматограммы, полученные с использованием системы № 2, детектировали УФ-светом при длине волны 365 нм. При полном извлечении ненасыщенных жирных кислот отсутствуют пятна с ярко-голубой флуоресценцией.

Полученное извлечение упаривают при температуре 50-60°С достаточной влажности 5%, а затем высушивают при температуре 60°С и давлении 0,5 атм до полного удаления хлороформа и спирта этилового. Выход сухого извлечения составляет 62-64% от массы воздушно-сухого сырья. Выделенное извлечение исследовали на наличие высших жирных кислот методом газожидкостной хроматографии. Массовые доли жирных кислот определяли методом внутренней нормализации после ацетилирования смолистой фракции с метиловым спиртом и ацетилхлоридом при нагревании с обратным холодильником. После отгона избытка спирта остаток растворяли в н-гексане. Идентифицированы пальмитиновая, олеиновая, линолевая, линоленовая и арахидоновая кислоты. Количество агарициновой кислоты в составе липидной фракции определяли методом внешнего стандарта (Sigma Ol.) с содержанием 96% с концентрацией 34,15 мг/мл в метиловом спирте. Содержание агарициновой кислоты в липидной фракции исследуемого образца трутовика лекарственного составило 14,7%.

Массу растворяют в спирте этиловом 70% в соотношении 1:10 и получают настойку с концентрацией сухого остатка 6,4%.

При изучении антимикробных свойств целевого продукта изучали: извлечение из плодового тела трутовика, настойку календулы. При исследовании антимикробной активности целевого продукта использовали метод, основанный на способности лекарственных веществ диффундировать в агар, зараженный тест-культурами микроорганизмов, и подавлять рост последних [Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под ред. Биргера М.О. - М.: Медицина, 1982. - С.172-177]. Определение активности изучаемых настоек проводили в 3-х чашках Петри одинакового диаметра с плоским дном. В чашки, устанавливаемые горизонтально, наливали по 15 мл расплавленного питательного агара. Слой агара в чашке Петри заливали 1 - 2 мл взвеси испытуемого микроба в физиологическом растворе. Затем излишек взвеси полностью удаляли, подсушивали поверхность агара в течение 30 минут. Затем сверлом (6 мм диаметром) пробуравливали 6 отверстий («колодцев») на расстоянии 2,5 см от центра и на одинаковом расстоянии друг от друга «колодцы» заполняли образцами настоек календулы и плодового тела гриба трутовика и растворителем в соответствующей концентрации (контроль). Чашки оставляли при комнатной температуре на 30 минут, после чего их ставили в термостат при температуре 37°C, не переворачивая, строго горизонтально, чтобы получить круглые зоны. Под крышки чашки Петри помещали стерильный фильтр во избежание попадания конденсата на лунки. Зоны угнетения измеряли через 16 часов. Оценка результатов проводилась по диаметру зон задержки роста вокруг «колодца», включая диаметр самого «колодца»:

- отсутствие зоны задержки роста - испытуемая культура не чувствительна к данной концентрации препарата;

- диаметр зоны задержки роста 10 мм - умеренная чувствительность культуры к данной концентрации препарата;

- диаметр зоны задержки роста более 10 мм - высокая чувствительность испытуемой культуры к данной концентрации препарата.

Результаты эксперимента представлены в табл.1 и примерах 1-3.

Пример 1

Настойка плодового тела гриба трутовика обладает:

1) выраженным антимикробным действием в отношении грамположительных кокков рода Staphylococcus: Staphylococcus aureus (209) 25,0±2,0; Staphylococcus aureus (Type) 21,0±1,0; Staphylococcus epidermidis Wood-46 22,0±1,0;

2) выраженным антимикробным действием в отношении грамотрицательных микроорганизмов Shigella sonnei 3d 14,0±2,0;

3) выраженным антимикробным действием в отношении спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus: Bacillus subtilis L₂ 17,0±1,0; Bacillus anthracoides - 1 17,0±1,0;

4) умеренным антимикробным действием в отношении Salmonella typhimurium - 9,0±1,0 и Escherichia coli - 9,0±1,0 (табл.1).

Пример 2

Настойка календулы обладает:

1) умеренным антимикробным действием в отношении грамположительных кокков рода Staphylococcus: Staphylococcus aureus (209) 8,0±2,0; Staphylococcus aureus (Type) 7,0±1,0; Staphylococcus epidermidis Wood-46 8,0±1,0;

2) выраженным антимикробным действием в отношении грамотрицательных микроорганизмов Shigella sonnei 3d 10,0±2,0;

3) выраженным антимикробным действием в отношении спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus: Bacillus subtilis L₂ 10,0±1,0; Bacillus anthracoides - 1 10,0±1,0;

4) умеренным антибактериальным действием в отношении Salmonella typhimurium - 9,0±1,0 и Escherichia coli - 9,0±1,0 (табл.1).

Противоспалительную активность настойки календулы и настойки плодового тела гриба трутовика изучали на модели термического ожога кожи спины крыс. Термический ожог кожи спины у белых крыс вызывали контактным высокотемпературным способом с помощью лабораторной пробирки с водой, нагретой до 100°C. Данный способ позволяет получить стандартные по площади (2 см) и глубине ожоги всей толщи кожи. Время экспозиции пробирки, нагретой до 100°C, составляло 20 секунд. Ожог наносили животным под эфирным наркозом. При соблюдении этих условий у всех подопытных животных ожоги кожи соответствовали IIIА степени по клинической классификации ожогов. Динамику ожогового повреждения оценивали на 14 сутки по площади раны весовым методом [Гублер Е.В. и др. Термические ожоги и ожоговая болезнь /Моделирование заболеваний. - М., 1973. - С.59-78].

В качестве лечения на ожоговую поверхность наносили настойку календулы (в опытной группе) и извлечение из плодового тела гриба трутовика в группе сравнения. В контрольной группе наносили спирт этиловый 70%. Процедуру проводили ежедневно, 1 раз в сутки, на протяжении 14 дней. Результаты исследования представлены в табл.2, примерах 4-6, фото 1-6. На фото 1-6 документировано состояние ожоговых ран на 1 и 14 день от нанесения ожога. На фото 1 (группа 1), 2 (группа 2), 3 (группа 3) видно, что цвет, размер, форма ожоговых ран во всех экспериментальных группах животных практически идентична, что говорит о правильном и адекватном моделировании ожоговой патологии.

Пример 4. На фоне лечения спиртом этиловым 70% площадь раны на коже спины крыс (группа 1) на 14 день составила 168,8±6,2 мг (табл.2), в группе наблюдается начало отторжения струпа с раневой поверхности (фото 4).

Пример 5. На фоне лечения извлечением из плодового тела гриба трутовика площадь раны на коже спины крыс (группа 2) на 14 день составила 59,6±5,9 мг или 35,27% по отношению к контролю (табл.2), струп сохранен лишь на небольшом участке ожоговой поверхности (фото 5), более активно, чем в группах 1 и 3, восстанавливается волосяной покров (см. фото 4, 5, 6).

Пример 6. На фоне лечения настойкой календулы (группа 3) площадь раны на коже спины крыс на 14 день составила 67,3±5,3 мг или 59,20% по отношению к контролю (табл.2), струп сохранен лишь на небольшом участке ожоговой поверхности (фото 6).

Таблица 2
Влияние настойки календулы и извлечение из плодового тела гриба трутовика на процесс заживления ожоговой раны (14 сутки)
Группы животных	Площадь раны в весовых единицах, мг	Размер раны в % к контролю
Контроль	168,8±6,2	-	100%
Настойка календулы	67,3±5,3	Р<0,05	59,20
Извлечение из плодового тела гриба трутовика	59,6±5,9	Р<0,05	35,27
Р1 >0,05
Примечание:
Р - по отношению к контролю;
Р1 - по отношению к настойке календулы