способ прогнозирования течения острых лейкозов

Формула изобретения

Способ прогнозирования течения острых лейкозов у детей, характеризующийся тем, что в периферической крови определяют плоидность и кинетику клеток методом проточной цитометрии и при выявлении анеуплоидии и индекса ДНК менее 1,19 прогнозируют неблагоприятный исход.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для прогнозирования течения в комплексной диагностике у детей острых лейкозов (ОЛ).

Высокая актуальность проблемы острых лейкозов у детей обусловлена как ростом числа больных, страдающих новообразованиями, так и особенностями течения заболевания, высоким уровнем смертности.

В структуре детской смертности в Российской Федерации новообразования, болезни крови и кроветворных органов занимают 6 место после несчастных случаев, отдельных состояний перинатального периода, врожденных пороков развития, болезней органов дыхания и инфекционных заболеваний. Согласно статистике Министерства здравоохранения Республики Башкортостан заболеваемость острыми лейкозами составляет в среднем 3,7 на 100000 детского населения.

На современном этапе развития онкогематологии пристальное внимание уделяется проблемам, связанным с диагностикой ОЛ, основным направлением современных исследований является диагностика и верификация острых лейкозов с углубленной биологической характеристикой клеток методом проточной цитометрии. Решены далеко не все вопросы, касающиеся прогностической ценности экспрессии тех или иных антигенов при острых лейкозах и разработки тактики лечения. В связи с этим представляется весьма актуальным всестороннее изучение особенностей лейкозов у детей, определение диагностических и прогностических критериев заболевания с использованием новейших технологий.

Известен способ прогнозирования характера течения острого лимфобластного лейкоза у детей, заключающийся в том, что в мазках периферической крови больных определяют количество ауторозеток и интенсивность экзоцитарного лизиса эритроцитов. При исходном абсолютном количестве ауторозеток с экзоцитарным лизисом эритроцитов в активную фазу острого лимфобластного лейкоза более 13,0 10⁹/л прогнозируют наступление раннего рецидива лейкоза и(или) развитие внекостно-мозговых пролифератов, а при исходном содержании количества ауторозеток с экзоцитарным лизисом эритроцитов менее 3,0 10⁹/л прогнозируют длительную ремиссию (патент RU 2152028, 2000 г.).

Прототипом изобретения является способ прогнозирования характера течения острого лимфобластного лейкоза у детей, предложенный Черновым, характеризующийся тем, что методом проточной цитометрии определяют плоидность и индекс ДНК клеток костного мозга и при обнаружении гиперплоидии и индексе ДНК более 1,16 прогнозируют положительный исход лечения (Хаматдинова З.Р. Иммунофенотипические варианты острых лейкозов у детей в Республике Башкортостан. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Уфа. 2005 г., с.5). Способ является трудоемким и инвазивным, так как предполагает забор клеток костного мозга.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка эффективного и простого в применении метода прогноза течения острого лейкоза, расширение арсенала методов диагностики.

Технический результат - получение критериев течения заболевания на основе показателей плоидности и кинетики клеток периферической крови, уменьшение инвазивности при диагностике.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Проводят забор периферической крови в количестве 5 мл утром натощак. Определяют плоидность и кинетику клеток периферической крови методом проточной цитометрии. При выявлении анеуплоидии и индекса ДНК<1,19 (маркер, характеризующий агрессивность течения заболевания) прогнозируют неблагоприятный исход. Прогностически благоприятным является диплоидный тип гистограмм.

Предлагаемый способ безопасен, неинвазивен, технически осуществим.

Метод исследования

Анализ ДНК в тканях и клеточной суспензии.

Для характеристики пролиферативной активности клеток используют метод, основанный на связывании ДНК с флуоресцентным зондом - пропидиум-йодидом, который позволяет определить долю клеток в различных фазах митотического цикла: G0/G1, S и G2+M.

Реагенты. Набор CyclTEST PLUS DNA состоит из четырех компонентов.

- Трипсин в растворе детергента (тетрахлорида спермина) для ферментной дезагрегации участков ткани, разрушения клеточной мембраны и цитоскелета.

- Ингибитор трипсина и рибонуклеаза А в цитратном буфере с тетрахлоридом спермина для подавления действия трипсина и расщепления РНК.

- Пропидиум-йодид (PI) и тетрахлорид спермина в цитратном буфере. PI связывается с ДНК в концентрации 125 µg/ml.

- Буферный раствор, содержащий цитрат натрия, сахарозу и диметилсульфоксид (DMSO), для сбора и/или замораживания клеточной суспензии.

Процедура окрашивания. В пробирку с 100 мкл крови последовательно добавляется трипсиновый буфер 250 мкл, ингибитор трипсина с РНК-азой 200 мкл и раствор пропидиум-йодида 200 мкл с промежуточным перемешиванием и 10-минутными инкубациями, затем образец фильтруется через нейлоновую ткань с ячейками 50 мкм. Образцы в течение 3 часов после добавления PI (Vindelov L.,1989) (не менее 20000 клеток) анализируют на проточном цитофлуориметре FACSCalibur, оборудованном модулем дискриминации дуплетов в программе ModFit.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими чертежами: на фиг.1 изображена ДНК-гистограмма клеток периферической крови больного Л. по примеру 1; на фиг.2 - ДНК-гистограмма клеток периферической крови больного М. по примеру 2; на фиг.3 - ДНК-истограмма клеток периферической крови больного Р. по примеру 3.

Диагноз острого лейкоза устанавливают на основании цитоморфологического исследования и иммунофенотипирования бластных клеток костного мозга, жалоб, анамнеза, клинической картины заболевания. В работе проанализированы показатели иммунного статуса и ДНК-цитометрии периферической крови у 16 детей с В-ОЛЛ.

В зависимости от плоидности клеток периферической крови дети с В-ОЛЛ были разделены на две группы (с наличием или отсутствием анеуплоидных клеток).

Полученные результаты стали основанием к рекомендации включения ДНК-цитометрии клеток периферической крови в иммунологический мониторинг перед началом полихимиотерапии.

Проанализировав эти две группы больных, можно сказать, что достоверные различия касаются только плоидности и кинетики клеточного цикла в периферической крови. Но, анализируя больных с анеуплоидией, можно сказать что, несмотря на то, что к 15-му дню химиотерапии была достигнута морфологическая ремиссия, эти дети (в отличие от детей с диплоидным набором хромосом) отличались значительно худшим качеством жизни (частые инфекции, кардиологические осложнения, развитие вторичных опухолей).

У 3-х детей с анеуплоидией в ходе проводимой полихимиотерапии аплазия кроветворения сопровождалась септическим процессом. На фоне проводимой терапии наступила летальность. Индекс ДНК в данных случаях был <1,19.

Предлагаемый метод иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Больному Л. при поступлении на основании иммунофенотипирования костного мозга поставлен диагноз В-2 ОЛЛ. При проведении ДНК-цитометрии периферической крови анеуплоидия составила - 5% (фиг.1). Индекс ДНК равен 1,16. Была начата полихимиотерапия. Аплазия кроветворения сопровождалась септическим процессом. На фоне проводимой терапии наступила смерть.

Пример 2. Больной М. при поступлении на основании иммунофенотипирования костного мозга поставлен диагноз В-2 ОЛЛ. В костном мозге бласты составили 100%. При проведении ДНК-цитометрии периферической крови гистограмма характеризовалась диплоидным типом (фиг.2). Ребенок после химиотерапии выписан домой в стадии ремиссии.

Пример 3. Больной Р. при поступлении на основании иммунофенотипирования костного мозга поставлен диагноз В-2 ОЛЛ. В костном мозге бласты составили 100%. При проведении ДНК-цитометрии периферической крови анеуплоидия составила 7% (фиг.3). Индекс ДНК равен 1,19. Была начата полиохимиотерапия. На 33-день в костном мозге бластные клетки не обнаружены, при ДНК-цитометрии периферической крови выявлена 100% диплоидия. После программной полихимиотерапии ребенок выписан домой в стадии ремиссии.