векторы на основе рекомбинантных вирусов отряда mononegavirales

Формула изобретения

1. Вектор экспрессии на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales, несущий дополнительную транскрипционную единицу, содержащую чужеродный ген, функционально связанный с вышележащей стартовой последовательностью гена (GS) вируса отряда Mononegavirales и нижележащей концевой последовательностью гена (GE) вируса отряда Mononegavirales, отличающийся тем, что между последовательностью GS и стартовым кодоном чужеродного гена и между стоп-кодоном чужеродного гена и последовательностью GE расположены соответственно 3'-некодирующая область и 5'-некодирующая область (геномная смысловая цепь) гена вируса отряда Mononegavirales.

2. Вектор на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales по п.1, отличающийся тем, что 3' и 5'-некодирующие области принадлежат гену, кодирующему белок оболочки вируса из отряда Mononegavirales, в частности, гену М, G, F или HN.

3. Вектор на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales по п.1, отличающийся тем, что 3'- и 5'-некодирующие области принадлежат гену, кодирующему белок RNP вируса отряда Mononegavirales.

4. Вектор на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales по п.1, отличающийся тем, что чужеродный ген кодирует антиген или патоген.

5. Вектор на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales по п.1, отличающийся тем, что чужеродный ген кодирует иммуномодулятор.

6. Вектор на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales по п.1, отличающийся тем, что вектор на основе вируса из отряда Mononegavirales представляет собой вирус семейства Rhabdoviridae.

7. Вектор на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales по п.6, отличающийся тем, что вектор на основе вируса из отряда Mononegavirales представляет собой вирус бешенства.

8. Вектор на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales по п.6, отличающийся тем, что вектор на основе вируса из отряда Mononegavirales представляет собой вирус инфекционного гематопоэтического некроза.

9. Вектор на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales по любому из пп.6-8, отличающийся тем, что 3'- и 5'-некодирующие области принадлежат гену N, Р, М или G.

10. Вектор на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales по любому из пп.6-8, отличающийся тем, что дополнительная транскрипционная единица расположена в 3'-проксимальной позиции или между генами Р-М, M-G или G-L.

11. Вектор на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales по п.1, отличающийся тем, что вектор на основе вируса отряда Mononegavirales представляет собой вирус семейства Paramyxoviridae.

12. Вектор на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales по п.11, отличающийся тем, что вектор на основе вируса отряда Mononegavirales представляет собой вирус болезни Ньюкасла, вирус чумки собак или вирус (бычьего) парагриппа.

13. Вектор на основе рекомбинантного вируса из отряда Mononegavirales по любому из пп.11-12, отличающийся тем, что 3'- и 5'-некодирующие области принадлежат генам NP, Р, М, F или HN.

14. Вектор на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales по п.11, отличающийся тем, что дополнительная транскрипционная единица расположена в 3'-проксимальной позиции или между генами Р-М, M-F, F-HN или HN-L.

15. Вектор на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales по п.11, отличающийся тем, что вектор на основе вируса отряда Mononegavirales представляет собой вирус болезни Ньюкасла.

16. Вектор на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales по п.15, отличающийся тем, что дополнительная транскрипционная единица расположена между генами F-HN.

17. Вектор на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales по п.15, отличающийся тем, что некодирующие области принадлежат гену HN.

18. Вектор на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales по п.15, отличающийся тем, что чужеродный ген кодирует антиген патогена птиц.

19. Вектор на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales по п.15, отличающийся тем, что чужеродный ген кодирует гемагглютинин (НА) вируса гриппа, предпочтительно гемагглютинин Н5 или Н7.

20. Вектор на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales по любому из пп.1-8, 11 или 14-18, отличающийся тем, что вектор сконструирован на основе аттенуированного вируса отряда Mononegavirales.

21. Вакцина против микробного патогена, отличающаяся тем, что она содержит вектор по любому из пп.1-20, сконструированный на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales, в живой или инактивированной форме и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

22. Вакцина по п.21, отличающаяся тем, что дополнительно содержит адъювант.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к вектору на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales, несущего дополнительную транскрипционную единицу, содержащую чужеродный ген, функционально связанный со стартовой последовательностью гена (GS) вируса отряда Mononegavirales и с концевой последовательностью гена (GE) вируса отряда Mononegavirales, а также к вакцине, содержащей этот вектор на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales.

Живые вирусы, способные реплицироваться в инфицированном хозяине, вызывают сильный и длительный иммунный ответ против экспрессирующихся антигенов этих вирусов. Они эффективно вызывают как гуморальный, так и клеточный иммунный ответы, а также стимулируют биохимические пути, опосредуемые цитокинами и хемокинами. Поэтому, живые аттенуированные вирусы обладают определенными преимуществами по сравнению с композициями вакцин, основанными либо на инактивированных иммуногенах, либо на отдельных субъединицах иммуногенов, которые, как правило, стимулируют лишь гуморальную часть иммунной системы.

В течение последнего десятилетия технология рекомбинантных ДНК произвела революцию в области генной инженерии геномов как ДНК, так и РНК-содержащих вирусов. В частности, в настоящее время возможно вводить чужеродные гены в геном вируса так, что при репликации нового вирусного вектора в животном-хозяине экспрессируется чужеродный белок, который может проявлять биологическую активность в животном-хозяине. Как таковые, рекомбинантные вирусные векторы используются не только для контроля и предотвращения микробных инфекций, но также для разработки методов направленной терапии заболеваний, не вызываемых микроорганизмами, таких как злокачественные заболевания, и для генной терапии.

Первая публикация в 1994 году (Schnell et al., EMBO J., 13, 4195-4203, 1994) о создании несегментированных (-)РНК вирусов (вирусов отряда Mononegavirales) полностью из клонированной кДНК при помощи методов, называемых «обратная генетика», позволило использовать также вирусы отряда Mononegavirales (MV-вирусы) в качестве векторов. С тех пор были опубликованы исследования, касающиеся использования многих вирусов отряда Mononegavirales в качестве вирусных векторов для экспрессии полученных из патогенов чужеродных антигенов для разработки вакцин против патогенов.

В отряд Mononegavirales входят четыре основных семейства: Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae и Bornaviridae. Принадлежащие этим семействам вирусы имеют геномы, представленные единственной отрицательно-смысловой (-) молекулой РНК, т.е. полярность генома противоположна полярности информационной РНК (иРНК или мРНК), которая обозначается как положительно-смысловая (+). Классификация основных вирусов человека и животных из отряда Mononegavirales представлена в таблице, приведенной ниже:

Таблица 1: Классификация вирусов отряда Mononegavirales
Семейство	Род	Вид
Rhabdoviridae	Lyssavirus	Вирус бешенства (RV)
	Vesiculovirus	Вирус везикулярного стоматита (VSV)
	Novirhabdovirus	Вирус инфекционного гематопоэтического некроза (IHNV)
Paramyxoviridae	Respirovirus	Вирус Сендай (SeV)
		Вирус парагриппа человека 1 и 3 типа (hPIV 1/3)
		Вирус бычьего парагриппа 3 типа (bPIV 3)
	Morbillivirus	Вирус кори
		Вирус чумы крупного рогатого скота
		Вирус собачьей чумки (CDV)
	Rubulavirus	Вирус обезьян 5 (SV-5)
		Вирус парагриппа человека 2 типа (hPIV 2)
		Вирус эпидемического паротита
	Avulavirus	Вирус болезни Ньюкасла (NDV)
	Pneumovirus	Респираторный синцитиальный вирус человека (hRSV)
		Бычий респираторный синцитиальный вирус (bRSV)
Filoviridae	Эбола-подобные вирусы	Вирус Эбола
		Вирус Марбург

Геномная организация и подробности жизненного цикла вирусов отряда Mononegavirales (на сегодняшний день) хорошо известны, а их описание представлено в обзорах многих авторов (Neumann et al., J. Gen. Virology 83, 2635-2662, 2002; Whelan et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 203, 63-119, 2004; Conzelmann, K.; Curr. Top. Microbiol. Immunol. 203, 1-41, 2004). Несмотря на то, что вирусы отряда Mononegavirales имеют различных хозяев и различные морфологические и биологические свойства, они обладают многими общими свойствами, такими как геномная организация и элементы, необходимые для обычного способа репликации и экспрессии генов, что указывает на то, что они произошли от общего предка. Эти покрытые оболочкой вирусы реплицируются в цитоплазме клеток и синтезируют мРНК, которой не требуется сплайсинг.

Вирусы этого отряда состоят из двух главных функциональных единиц, рибонуклеотид-белкового комплекса (RNP) и оболочки. Уже определены полные геномные последовательности для характерных представителей родов каждого семейства, приведенных выше. Размер их геномов варьирует от примерно 9000 нуклеотидов до примерно 19000 нуклеотидов, и геном вирусов содержит от 5 до 10 генов. Структура и организация геномов вирусов отряда Mononegavirales являются очень сходными и обусловлены определенным типом экспрессии генов. Геномы всех MV-вирусов содержат три основных гена, кодирующих: нуклеопротеин (N или NP), фосфопротеин (Р) и РНК-зависимую РНК-полимеразу (L). Оболочка вируса состоит из матричного (М) белка и одного или нескольких трансмембранных гликопротеинов (например, белков G, HN и F), которые принимают участие в сборке/отпочковании вирусных частиц, а также в процессе присоединения к клетке и/или проникновения вируса в клетку. В зависимости от рода, к которому принадлежит вирус, количество белков может быть увеличено за счет вспомогательных белков, имеющих определенные специфические регуляторные функции при транскрипции и вирусной репликации, или белков, которые вовлечены в реакции вирус-хозяин (например, белки С, V и NS). Порядок расположения генов в геноме MV-вирусов очень консервативен, причем основные белки находятся на 3'-конце или рядом с ним, а большой (L) ген расположен в 5'-конце. Гены белков М, поверхностных гликопротеинов, а также других вспомогательных генов расположены между генами N, P и L.

В комплексе RNP геномная или антигеномная РНК заключены в капсид из белка N и связаны с РНК-зависимой РНК-полимеразой, которая состоит из белков L и Р. После заражения клетки, именно комплекс RNP, а не голый РНК-геном служит матрицей для двух различных функций синтеза РНК, т.е. транскрипции субгеномных мРНК и репликации полноразмерной геномной РНК.

Каждый тандемно расположенный ген разделен так называемыми структурами «соединения генов». Соединение генов содержит консервативную «концевую последовательность гена» (GE), нетранскрибируемую «область между генами» (IGR) и консервативную «стартовую последовательность гена» (GS). Эти обе последовательности являются необходимыми и достаточными для транскрипции генов. В ходе транскрипции каждый ген последовательно транскрибируется в мРНК с помощью вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, которая начинает процесс транскрипции с 3'-конца геномной РНК на первой GS-последовательности. На каждом участке соединения генов транскрипция прерывается в результате отсоединения РНК-полимеразы на GE-последовательности. Повторная инициация транскрипции происходит на следующей GS-последовательности, хотя и с меньшей эффективностью. В результате этого прерываемого процесса, также называемого процесс «стоп-старта», на каждом участке соединения генов происходит ослабление транскрипции, в результате чего гены, расположенные в 3'-области генома MV-вируса, транскрибируются в большем количестве, чем последующие гены, расположенные в 5'-области. Модульная форма транскрипции генов MV-вирусов, при которой каждый ген является частью отдельного цистрона или транскрипционной единицы, делает эти вирусы необычайно подходящими для встраивания и экспрессии чужеродных генов. Каждая единица транскрипции в геноме MV-вирусов содержит следующие элементы: 3'-GS-открытая рамка считывания (ORF)-GE-5'.

На 3'- и 5'-концах генома MV-вирусов присутствуют короткие нетранскрибируемые области, называемые «лидерными» (примерно 40-50 нуклеотидов) и «трейлерными» (примерно 20-600 нуклеотидов), соответственно. Лидерная и трейлерная последовательности являются необходимыми последовательностями, которые контролируют репликацию геномной РНК, заключение вируса в капсид и упаковку вируса.

Методы обратной генетики и возможность восстановления инфекционного MV-вируса сделали возможным манипуляции с его РНК-геномом через кДНК-копию. Минимальным комплексом инициации репликации, необходимым для синтеза вирусной РНК, является комплекс RNP. Инфицирующий MV-вирус можно восстановить путем совместной экспрессии антигеномной РНК и соответствующих вспомогательных белков с плазмид под контролем РНК-полимеразы фага Т7. На основе оригинального протокола, опубликованного в 1994 году (Schnell et al., 1994 (supra)), (или с незначительными вариациями) было получено восстановление многих видов MV-вирусов.

Болезнь Ньюкасла и птичий грипп являются важными заболеваниями домашней птицы, которые могут вызывать серьезные экономические потери в мировой птицеводческой промышленности. Вирус болезни Ньюкасла (NDV) является несегметированным (-)РНК вирусом, относящимся к отряду Mononegavirales. Геном, длина которого составляет 15 т.п.о., содержит шесть генов, которые кодируют нуклеопротеин (NP), фосфопротеин и V-белок (Р/V), матричный белок (М), слитый белок (F), белок гемагглютинин-нейраминидазу (HN) и РНК-зависимую РНК-полимеразу или большой (L) белок. Гены этого вируса расположены последовательно в следующем порядке 3'-NP-P-M-F-HN-L-5' и разделены областями между генами различной длины. Перед всеми генами находится стартовая последовательность гена (GS), за которой следуют некодирующая область, кодирующая белки NDV, открытая рамка считывания, вторая некодирующая область и концевая последовательность гена (GE). Длина генома NDV кратна шести, что следует учитывать при встраивании чужеродных генов.

Птичий грипп (AI) представляет собой заболевание домашней птицы, отличающееся тем, что может представлять собой заболевание с симптомами от слабовыраженных респиратурных проявлений до тяжелой болезни с высокой смертностью. Агентом, вызывающим это заболевание, является вирус птичьего гриппа А (AIV), принадлежащий семейству Orthomyxoviridae. AIV содержит восемь геномных РНК-сегментов отрицательной полярности, которые кодируют 10 белков. На основе антигенных свойств гликопротеинов гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (N) вирусы птичьего гриппа были разделены на подтипы. На сегодняшний день известно 16 гемагглютининовых (Н1-Н16) и девять нейраминидазных (N1-N9) подтипов. Антитела к гемагглютинину и нейраминидазе важны для гуморального иммунного ответа и ингибируют инфекцию или предотвращают заболевание.

Вирусы птичьего гриппа и болезни Ньюкасла можно сгруппировать в два различных патотипа в соответствии с их вирулентностью. Симптомы, вызываемые низкопатогенным AIV (LPAI) или лентогенным NDV, считаются менее значимыми. В отличие от этого высокопатогенный птичий грипп (HPAI) и болезнь Ньюкасла, вызываемая высоковирулентными вирусами (NDV: мезогенными и велогенными штаммами), представляют собой крайне важными заболеваниями.

В то время как вакцинация против NDV лентогенными штаммами NDV проводится для защиты кур от высоковирулентных штаммов NDV, в большинстве стран вакцинация против HPAI не проводится, поскольку распространение HPAI контролируют, уничтожая зараженную популяцию. Однако в качестве стратегии для минимизации потерь и снижения частоты возникновения болезни можно использовать вакцинацию. Вызываемый вакцинами иммунитет специфичен к подтипу вируса, что означает, что вакцина к подтипу Н5 может защищать от H5 AIV, но не может защищать от других Н-подтипов. Обычно репликация вируса гриппа ограничена легкими, поскольку гемагглютинин вирусов LPAI может расщеплять только триптаза клеток Клара, представляющая собой сериновую протеазу, экспрессирующуюся в легких. На сегодняшний день все вирусы HPAI относятся к подтипам Н5 и Н7. Эти вирусы HPAI в участке расщепления Н содержат много основных аминокислот, таким образом их могут расщеплять широко экспрессирующиеся фурин- и субтилизин-подобные ферменты на субъединицы НА1 и НА2. Поэтому, эти вирусы могут размножаться в других органах.

Вакцины против подтипов Н5 и Н7 могут обеспечивать защиту кур и индюшек против клинических проявлений и предотвращать смерть, следующую после заражения HPAI. Кроме традиционного инактивированного целого AIV на масляной основе, экспериментально была показана эффективность иммунизации против AI с помощью вирусных векторов, вакцин в виде белковых субъединиц или ДНК-вакцин. С момента создания обратной генетики получение рекомбинантных вирусов для использования в качестве вакцинных векторов является важным использованием для различных вирусов. Были сконструированы различные рекомбинантные (-)РНК-вирусы, экспрессирующие чужеродные белки. Также гемагглютинин из AIV встраивали в различные вирусные векторы, такие как вирус инфекционного ларинготрахеита (ILTV) (Luschow et al., Vaccine 19, 4249-59, 2001), вирус чумы крупного рогатого скота (Walsh et al., J. Virol. 74, 10165-75, 2000) и вирус везикулярного стоматита (VSV) (Roberts et al., J. Virol. 247, 4704-11, 1998).

Вирус чумы крупного рогатого скота также использовали в качестве вируса для экспрессии капсидного белка VP1 вируса ящура (Baron et al., 1999, J. of Gen. Virol., vol. 80, p.2031-2039).

В статье Tao et al. (1998, J. of Virol., vol.72, p.2955-2961) описывается создание химерного вируса парагриппа человека (hPIV) 3 типа, в котором гены HN и F из hPIV 1 типа используются для замены (а не в качестве дополнения) эндогенных генов HN и F вируса hPIV 3 типа.

Также NDV используют для экспрессии гемагглютинина AIV. Ген гемагглютинина вируса гриппа A/WSN/33 встраивали между генами Р и М штамма Hitchner B1 вируса болезни Ньюкасла. Этот рекомбинантный вирус защищал мышей от смертельной инфекции, хотя при этом наблюдалась заметная потеря веса у мышей, которые полностью выздоравливали в течение 10 дней (Nakaya et al. J. Virol. 75, 11868-73, 2001). Кроме того, рекомбинантный NDV с тем же участком встраивания для чужеродного гена использовали для экспрессии Н7 из LPAI, но в этом случае лишь 40% вакцинированных кур были защищены от велогенного NDV и HPAI (Swayne et al., Avian Dis. 47, 1047-50, 2003).

Однако в этих публикациях не описано никакого благоприятного эффекта так называемых некодирующих областей эндогенных генов MV-вирусов на экспрессию дополнительных чужеродных генов, встроенных в геном MV-вектора.

Целью настоящего изобретения является получение рекомбинантного MV-вирусного вектора, который обеспечивает более высокий уровень экспрессии белка, кодируемого чужеродным геном, встроенным в геном вирусного вектора, и/или который обеспечивает более высокую иммуногенность, чем существующие MV-вирусные векторы.

Авторы изобретения обнаружили, что данную задачу решает вектор на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales по настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение относится к вектору на основе рекомбинантного вируса отряда Mononegavirales, несущему дополнительную транскрипционную единицу, содержащую чужеродный ген, функционально связанный с расположенной выше стартовой последовательностью гена (GS) MV-вируса и расположенной ниже концевой последовательностью (GE) гена MV-вируса, отличающемуся тем, что между GS-последовательностью и старт-кодоном чужеродного гена и между стоп-кодоном чужеродного гена и GE-последовательностью расположены 3'-некодирующая область и 5'-некодирующая область (геномные смысловые) гена MV-вируса, соответственно.

Следует отметить, что указанная полярность нуклеотидных цепей в данном документе дана в контексте геномной (-) смысловой цепи, за исключением последовательностей мРНК и кДНК.

Было обнаружено, что наличие 3'- и 5'-некодирующих областей гена MV-вируса в транскрипционной единице, содержащей чужеродный ген, встроенный в геном MV-вируса, положительно влияет на транскрипцию и/или экспрессию чужеродного гена. На фигуре 3 показано, что введение некодирующих областей гена MV-вируса между GS-последовательностью и геном гемагглютинина (НА) вируса птичьего гриппа увеличивает количество мРНК НА, синтезируемой MV-вирусным вектором, несущим ген НА из AIV. Положительный эффект также наблюдался на белковом уровне: сравнение MV-вирусных векторов показало, что интенсивное иммунологическое окрашивание сывороткой , специфичной к HA AIV, наблюдалось только в случает MV-вирусного вектора, несущего чужеродный ген HA AIV, фланкированный некодирующими областями (фигура 4). Таким образом, было обнаружено, что наличие некодирующих областей MV-вируса, фланкирующих чужеродный ген, положительно влияет на характеристики полученного MV-вирусного вектора, хотя авторы изобретения не хотели бы связывать это с какой-либо теорией или моделью, объясняющими эти наблюдения.

Чужеродный ген представляет собой полинуклеотидную молекулу, которая кодирует полипептид или белок, отсутствующие в природном в геноме MV-вируса-реципиента.

Как подчеркнуто выше, общим свойством геномной организации MV-вирусов является их модульная форма транскрипции, при которой последовательно транскрибируются тандемно расположенные транскрипционные единицы. В MV-вирусах дикого типа транскрибируемые гены фланкированы (i) на своих 3'-концах GS-последовательностью и нуклеотидной последовательностью, обозначаемой в данной области как «некодирующая область», и (ii) на своих 5'-концах нуклеотидной последовательностью, также обозначаемой как «некодирующая область», и GE-последовательностью. Поэтому, используемый в настоящем описании термин (3' или 5')-«некодирующая область» определяет нуклеотидную последовательность, которая расположена выше (в 3'-направлении) или ниже (в 5'-направлении) природного гена MV-вируса и охватывает область между GS-последовательностью и старт-кодоном (ATG) гена MV-вируса и область между стоп-кодоном (TAA, TAG или TGA) гена MV-вируса и GE-последовательностью, соответственно. Используемые в настоящем изобретении некодирующие области получены из гена вируса, на основе которого создается вектор (т.е., некодирующие области гомологичны MV-вирусному вектору).

В данной области известна подробная информация об организации генома MV-вирусов, в том числе нуклеотидные последовательности различных генов MV-вирусов и последовательности, контролирующие их транскрипцию (GS и GE), и некодирующие последовательности, фланкирующие гены. Такую информацию можно, например, получить из базы данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI), например, на веб-странице в интернете; смотри таблицы 2 и 3).

Некодирующие последовательности, которые предпочтительно использовать в изобретении, получены из генов природных MV-вирусов, но также считается, что замена одного или нескольких нуклеотидов в природной некодирующей области находится в объеме изобретения. В частности, предусмотрены нуклеотидные замены, которые расположены непосредственно выше или ниже старт/стоп кодона чужеродного гена, соответственно, и результат введения искусственного сайта расщепления ферментом рестрикции, позволяющий проводить генетические манипуляции с этими областями.

В предпочтительном рекомбинантном MV-вирусном векторе по настоящему изобретению некодирующие области принадлежат гену, кодирующему белок оболочки MV-вируса, в частности белок M, G, F или HN, или белок, входящий в RNP, в частности белок N, P или L.

В особенно предпочтительном MV-вирусе по настоящему изобретению некодирующие области принадлежат гену, кодирующему белок F или HN.

Специфические нуклеотидные последовательности некодирующих областей для применения в рекомбинантном MV-вирусном векторе по настоящему изобретению представлены в таблице 3.

Таблица 2: Информация о геноме вирусов из отряда Mononegavirales и векторах на их основе
MV-вирус	Информация о геноме: номер доступа в базе данных NCBI	Литературный источник о рекомбинантном вирусном векторе
RV	NC_001542	Mebatsion et al., PNAS 93, 7310-14,1996
VSV	NC_0011560	Kretzschmar et al., J. Virol. 71, 5982-89, 1997
IHNV	NC_001652	-
SeV	NC_001552	Sakai et al., FEBS Lett. 456, 22106, 1999
hPIV1	NC_003461	-
H PIV3	NC_001796	Tao et al., J. Virol. 74, 6448-58, 2000
bPIV3	NC_002161	Tang et al., Vaccine 23, 1657-67, 2005
Вирус кори	NC_001498	Singh et al., Virol. 73 4823-28, 1999
Вирус чумы крупного рогатого скота	NC_006296	Walsh et al., J. Gen. Virol. 81, 709-18, 2000
CDV	NC_001921	Plattet el al., Virus Res. 101, 147-53, 2004
SV 50	NC_006430	He et al., Virology 237, 249-60, 1997
NDV	NC_002617	Zhao et al., J. Gen. Virol. 84, 781-88, 2003
Вирус эпидемического паротита	NC_002200	-
hPIV2	NC_003443	-
hRSV	NC_001781	Bukreyev et al., PNAS 96, 2367-72, 1999
bRSV	NC_001989	Stope et al., J. Virol., 75, 9367-77, 2002
Вирус болезни Эбола	NC_006432	-
Вирус болезни Марбург	NC_001608	-

Предпочтительными GS- и GE-последовательностями, используемыми в данном изобретении в качестве последовательностей транскрипционного контроля, являются последовательности, полученные из природных генов MV-вирусов. Полагают, что эти последовательности модулируют активность РНК-полимеразы в ходе процесса транскрипции, в частности, в ходе инициации транскрипции и модификации 5'-конца мРНК, и при контроле 3'-полиаденилирования и терминации транскрипции. Для каждого MV-вируса начало каждого гена отмечено последовательностью примерно из 10 нуклеотидов. В то время как у некоторых видов MV-вирусов GS-последовательности являются одинаковыми для каждого гена, GS-последовательности в геноме других видов MV-вирусов могут иметь незначительные отличия.

В связи с их общей функцией в образовании 3'-полиА хвоста у мРНК и терминации транскрипции GE-последовательности в MV-вирусах имеют общие конструктивные особенности последовательности. Характерная GE-последовательность содержит U-образный участок длиной 4-8 нуклеотидов. Кроме того, остаток цитозина, расположенный непосредственно выше U-образного участка, является консервативным, а перед ним находится цепочка нуклеотидов, богатая остатками А/U. В различных GE-последовательностях 4 нуклеотида, расположенных непосредственно выше U-образного участка, представляют собой 3'-AUUC-5'.

Контролирующие транскрипцию последовательности, которые определяют границы и места соединения генов MV-вирусов, были идентифицированы для многих генов MV-вирусов при сравнении нуклеотидных последовательностей геномной матрицы и нуклеотидных последовательностей, присутствующих на конце мРНК. Кроме того, в результате большого числа исследований были идентифицированы консенсусные GS- и GE-последовательности, необходимые для эффективной экспрессии генов. Общие характеристики и конкретные примеры GS- и GE-последовательностей можно получить из базы данных последовательностей NCBI (смотри таблицу 2 для номеров доступа в базе данных NCBI), их обзор также приведен в статьях Neumann et al. (J. Virol. 83, 2635-2662, 2002) и Whelan et al. (Current Topics Microbiol. Immunol. 203, 63-119, 2004).

Конкретные предпочтительные GS- и GE-последовательности, используемые в рекомбинантном MV-вирусном векторе по изобретению, приведены в таблице 3, хотя известно, что не всегда возможно определить точную границу между последовательностями GS, некодирующей области и GE. Информация об этих последовательностях раскрыта в базе данных NCBI (смотри номера доступа в таблице 2). Для вируса NDV1 приведена ссылка на номер доступа в базе данных EMBL (Y18898), для RV на номер доступа в базе данных GenBank (M31046).

Таблица 3: Информация о последовательности в местах соединения генов различных MV-вирусов (+ смысловая цепь)
Вирус	GS	Некодирую- щая область (нуклеотиды) между GS и старт-кодоном	Открытая рамка считы-вания	Некодирующая область (нуклеотиды) между стоп-кодоном и GE	GE	Область между генами (между GE и GS) (IGR)
RV	aacacccct	3	N	50	tgaaaaaaa	ct
	aacacccct	20	P	59	tgaaaaaaa	caggc
	aacaccact	6	M	171	tgaaaaaaa	ctatt
	aacatccct	18	G	459	agaaaaaaa	cattagatcagaagaacaactggc
	aacacttct	21	L	52	tgaaaaaaa
IHNV	ggcacttcagttg	100	NP	70	tagaaaaaaa	t
	ggcactatagtgc	25	P	32	agaaaaaaa	t
	ggcacgcaagtgt	41	M2	90	agacagaaaaaaa	t
	ggcacttttgtgc	39	G	28	agacagaaaaaaa	c
	ggcacatttgtgc	14	NV	-6	agatagaaaaaaa	t
	ggcacttttgtgc	64	L	41	agatacaaaaaaa
Вирус Сендай	agggtcaaag	54	NP	34	taagaaaaa	ctt
	agggtgaaag	93	P	74	taagaaaaa	ctt
	agggtgaaag	22	M	85	taagaaaaa	ctt
	agggataaag	43	F	61	taagaaaaa	ctt
	agggtgaaag	46	HN	95	taagaaaaa	ccc
	agggtgaatg	18	L	76	taagaaaaa
HPIV1	agggtaaag	54	N	31	aagtaagaaaaa	ctt
	agggtgaatg	93	P	71	aattaagaaaaa	ctt
	agggtcaaag	22	M	82	aaataagaaaaa	cgt
	agggacaaag	265	F	76	aagtaagaaaaa	ctt
	agggttaaag	46	HN	98	gaataagaaaaa	ctt
	agggttaatg	18	L	88	tagtaagaaaaa
bPIV3	aggattaaag	45	N	34	taagaaaaa	ctt
	aggattaatg	69	P	116	taagaaaaa	ctt
	aggatgaaag	22	M	51	aaacaaaaa	ctt
	aggatcaaag	101	F	26	tacaaaaaa	ctt
	aggaacaaag	63	HN	86	taataaaaaa	ctt
	aggagaaaag	12	L	62	taagaaaaa
hPIV3	aggattaaag	45	NP	34	taagaaaa	ctt
	aggattaag	69	P	53	taagaaaaa	ctt
	aggattaaag	22	M	51	taatcaaaaa	ctt
	aggacaaaag	183	F	28	ttataaaaaa	ctt
	aggagtaaag	63	HN	81	tataaaaaa	ctt
	aggagcaaag	12	L	62	taataaaaa
Вирус кори	aggattcaaag	42	N	49	ttataaaaaa	ctt
	aggaaccagg	50	P	62	ttataaaaaa	ctt
	aggagcaaag	22	M	417	taaacaaaa	ctt
	agggccaagg	574	F	128	taattaaaa	ctt
	agggtgcaag	10	H	74	ttaagaaaaa	cgt
	agggtccaag	12	L	59	ttaaagaaaa
Вирус чумы круп-ного рога- того скота	aggattcaag	42	N	49	ttataaaaaa	ctt
	aggacccagg	49	P	62	ttataaaaaa	ctt
	aggagcaaag	22	M	408	taccaaacaaaa	ctt
	agggtcaaag	579	F	125	tataaacaaaaa	ctt
	aggatgcaag	10	H	98	ttataaaaaa	cgt
	agggtccaag	12	L	60	taaagaaaa
CDV	agggtcaatg	42	N	49	ttataaaaaa	ctt
	aggacccagg	49	P	62	ttataaaaaa	ctt
	aggacacaag	22	M	394	taattaatcaaaa	ctt
	agggtccagg	16	F	122	ttaaagaaaa	ctt
	agggctcagg	10	H	100	ttataaaaa aa	cta
	aggatccaag	12	L	53	tacgaaaaaaaa
SV5	aggtccggaacct	83	NP	92	tttaaagaaaaaaa	t
	aggcccggcgggt	47	P	54	ttttagaaaaaa	cgattaacgataaata
	agcccgaacact	20	M	193	Ttcaaagaa aa	caatcatattaagactatccta
	agcacgaacccat	15	F	25	ttttaagaaaaaaa	cgat
	aggaccgaacct	67	SH	64	ttttaaagaaaaaa	ta
	aggcccgaacact	54	HN	99	ttttaagaaaaa	ccaagagaacaat
	aggccaga atg	-3	L	22	tttaagaaaaaa
VSV	aacagtaatc	3	NP	42	tgaaaaaaa	ct
	aacagatatc	0	NS	-3	tga aaaaaa	gt
	aacagatatc	31	M	98	tgaaaaaaa	ct
	aacagagatc	19	G	98	tgaaaaaaa	ct
	aacagcaatc	0	L	31	tgaaaaaaa
NDV	acgggtagaa	56	NP	200	ttagaaaaaa	gt
	acgggtagaa	73	P	169	ttaagaaaa aa	t
	acgggtagaa	24	M	102	Ttagaaaa aa	c
	acgggtagaa	36	F	73	ttaagaaaaa	ctaccggttgtagatgaccaaaggacgatat
	acgggtagaa	81	HN	166	ttaagaaaa aa	tgtaagtggcaatgagatacaaggcaaaacagctcatggtaaataat
	acgggtagga	1	L	67	ttagaaaaaa

В предпочтительном рекомбинантном MV-вирусном векторе по изобретению GS-, GE-последовательности и некодирующие области получены из гена того же MV-вируса.

Способы получения рекомбинантного MV-вирусного вектора, несущего дополнительную единицу транскрипции, содержащую чужеродный ген, хорошо известны в данной области. Например в таблице 2 приведены ссылки на документы, описывающие получение таких рекомбинантных векторных вирусов для различных видов MV-вирусов. В принципе, используемый в настоящем изобретении способ является таким же как и прототип, за исключением того, что встраиваемый в геном MV-вируса чужеродный ген фланкирован соответствующими 3'- и 5'-некодирующими областями, описанными выше.

В общем случае способа по изобретению рекомбинантный MV-вирусный вектор получают путем встраивания выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей (i) чужеродный ген, фланкированный 3'- и 5'-некодирующими областями, описанными выше, и (ii) соответствующих последовательностей транскрипционного контроля, в геном MV-вируса таким образом, чтобы в полученном MV-вирусном векторе перед и после чужеродного гена находились участки соединения генов MV-вируса, в частности, фрагмент геномной нуклеотидной последовательности, содержащий элементы GE-IGR-GS. Присутствие этих выше- и нижележащих элементов гарантирует соответствующую транскрипцию не только встроенных чужеродных генов, но также гомологичных генов MV-вируса, расположенных выше и ниже от встроенного чужеродного гена.

Более того, в способе по настоящему изобретению выделенная молекула нуклеиновой кислоты и геном MV-вируса используются в форме кДНК (+ смысловой). Это обеспечивает легкость манипулирования с желаемыми нуклеотидными молекулами и встраивания их в вирусный геном.

Как правила, для встраивания чужеродного гена можно использовать различные части генома между двумя генами, т.е. чужеродный ген можно встраивать в области между генами (IGR), 3' или 5'-некодирующие области гена, а также в 3'-промоторный-проксимальный (между N/NP генами) или 5'-дистальный конец (после L-генов) генома.

Лучше всего встраивать чужеродный ген перед геном N/NP, между генами NP-P, P-M, M-G/F, G/F-HN, HN-L и после гена L.

Наиболее простым путем встраивания чужеродного гена является использование уже существующей в одном из этих участков последовательности распознавания ферментом рестрикции (RE) путем разрезания ее ферментом и встраивания подходящей экспрессионной кассеты. Так как в нужном месте не всегда расположены природные последовательности распознавания ферментами рестрикции, то распознаваиваемые рестриктазами последовательности можно встроить в геном обычно используемыми способами, такими как сайт-направленный или ПЦР-мутагенез. Примеры подходящих участков IGR для встраивания чужеродного гена представлены в таблице 3.

Состав транскрипционной кассеты для встраивания зависит от участка встраивания. Например, в случае, когда транскрипционная кассета встраивается в IGR, она может содержать следующие элементы: 3'-сайт распознавания рестриктазой-GS-некодирующую область-открытую рамку считывания (чужеродного гена)-некодирующую область-GE-5'-сайт распознавания рестриктазы.

В альтернативном случае, когда транскрипционную кассету встраивают в 5'-некодирующую область природного гена MV-вируса, она может состоять из: 3'-сайта распознавания рестриктазой-GE-IGR-GS-некодирующей области-открытой рамки считывания (чужеродного гена)-некодирующей области-5'-сайта распознавания рестриктазы.

Аналогичным образом, когда транскрипционную кассету встраивают в 3'-некодирующую область природного гена MV-вируса, она может состоять из: 3'-сайта распознавания рестриктазой-некодирующей области-открытой рамки считывания (чужеродного гена)-некодирующей области-GE-IRG-GS-5'-сайта распознавания рестриктазы.

Получение таких транскрипционных кассет и встраивание их в геном MV-вируса предусматривает использование только рутинных биологических методик, примеры которых приведены в литературных ссылках, перечисленных в таблице 2 и в примерах настоящего описания. В частности, для этих целей можно использовать сайт-направленный и ПЦР-мутагенез (Peeters et al., 1999, supra; Current Protocols in Molecular Biology, eds.: F.M. Ausubel et al., Wiley N.Y., 1995 edition, pages 8.5.1.-8.5.9; Kunkel et al., Methods in Enzymology Vol.154, 376-382, 1987).

Более того, рекомбинантный MV-вирусный вектор по настоящему изобретению можно получить с помощью общепризнанной методики «обратной генетики», которая далает возможным проводить генетические модификации несегментированных (-)РНК вирусов отряда Mononegavirales (например, обзор дан в статьях Conzelmann, K.K., Current Topics Microbiol. Immunol. 203, 1-41, 2004; и Walpita et al., FEMS Microbiol. Letters 244, 9-18, 2005).

В соответствии с этой методикой проводят трансфекцию соответствующих клеток вектором, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую полноразмерный геном, или предпочтительно, антигеном (положительную смысловую цепь) MV-вируса, вместе с одним или несколькими векторами, включающими молекулы кДНК, содержащие нуклеотидные последовательности, которые кодируют необходимые вспомогательные белки, при условиях, способность к осуществлению транскрипции и совместной экспрессии (анти)генома MV-вируса и вспомогательных белков и продукцию рекомбинантного MV-вектора. В этой методике указанная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полноразмерный (анти)геном MV-вируса содержит дополнительную транскрипционную единицу, описанную выше.

Под вектором понимают репликон, такой как плазмида, фаг или космида, к которому можно присоединить другой сегмент ДНК для осуществления репликации присоединенного ДНК-сегмента и его транскрипцию и/или экспрессию в клетке, трансфецированной этим вектором.

Предпочтительным вектором транскрипции полноразмерного генома является плазмида, содержащая последовательность кДНК, кодирующую (анти)геном MV-вируса, фланкированную промотором полимеразы фага Т7 на своем 5'-конце и рибозимной последовательностью (гепатита дельта) на своем 3'-конце, хотя можно использовать промоторы РНК-полимеразы фагов Т3 и SP6.

Для внутриклеточной экспрессии соответствующих вспомогательных белков предпочтительно использовать плазмиды, содержащие кодирующие эти белки кДНК-последовательности под контролем соответствующих последовательностей контроля экспрессии, например, под контролем промотора полимеразы фага Т7.

В особенно предпочтительном способе получения рекомбинантного MV-вирусного вектора по настоящему изобретению используют экспрессионные плазмиды, кодирующие белки N (или NP), P и L MV-вируса.

Количество и соотношение трансфецируемых вспомогательных плазмид, используемых этой методике обратной генетики, находятся в широком диапазоне. Соотношение для вспомогательных плазмид N:P:L может изменяться от 20:10:1 до 1:1:2, а дающие эффективную трансформацию протоколы известны для каждого вируса.

В трансфецированной клетке синтезируется точная копия геномной РНК посредством совместного действия промотора РНК-полимеразы фага Т7 и рибозимной последовательности, а затем эта РНК пакуется и реплицируется с помощью вспомогательных вирусных белков, экспрессируемых с параллельно трансфецированных экспрессионных плазмид.

Предпочтительно, чтобы экспрессия полимеразы фага Т7 обеспечивалась с помощью рекомбинантного вируса осповакцины, инфицирующего трансфецированные клетки, в частности, вируса осповакцины vTF7-3, хотя для экспрессии полимеразы фага Т7 можно использовать и другие векторы на основе рекомбинантных вирусов оспы, такие как вирус оспы птиц, например, fpEFLT7pol, или другие вирусные векторы.

Восстановленный вирус можно легко отделить от вируса осповакцины простыми физическими методиками, такими как фильтрация. Вирус Сендай или NDV можно восстановить посредством инокуляции оплодотворенных яиц супернатантом трансфецированных клеток.

В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения для трансфекции транскрипционными и экспрессионными векторами используются клеточные линии, конститутивно экспрессирующие РНК-полимеразу (фага Т7) и/или один или несколько из необходимых вспомогательных белков.

Например можно осуществить восстановление вируса кори в клеточной линии почки эмбриона человека, 293-3-46, в которой экспрессируются и РНК-полимераза фага Т7, и вспомогательные белки вируса кори N и P (Radecke et al., EMBO J. 14, 5773-5784, 1995). Другая подходящая клеточная линия, которую успешно можно использовать в настоящем изобретении, основана на клетках BSR, экспрессирующих РНК-полимеразу фага Т7, а именно, клеточная линия BSR-T7/5 (Buchholz et al., J. Virol. 73, 251-259, 1999).

Кроме того, более подробная информация о методах обратной генетики, используемых в настоящем изобретении для получения MV-вируса по настоящему изобретению, раскрыта в обзоре Conzelmann, K.K. (supra) и в примере 1.

Благодаря способности рекомбинантных MV-вирусных векторов стабильно экспрессировать чужеродные гены были разработаны векторы для профилактического и терапевтического использования.

В рекомбинантном MV-вирусном векторе по настоящему изобретению чужеродный ген может изменяться в зависимости от конкретного вида MV-вируса и использования вирусного вектора.

Чужеродный ген может кодировать антиген (другого) микробного патогена (например, вируса, бактерии или паразита), главным образом, чужеродный ген кодирует антиген патогена, способный вызывать защитный иммунный ответ.

Например, последовательности гетерологичных генов, которые можно встроить в вирусные векторы изобретения, включают, но ими не ограничены, гены гликопротеинов вирусов гриппа, в частности, гены гемагглютининов Н5 и Н7 вируса птичьего гриппа, гены, полученные из вируса инфекционного бурсита (IBDV), особенно из штамма VP2 (вируса IBDV), гены, полученные из вируса инфекционного бронхита (IBV), вируса кошачьей лейкемии, вируса чумки собак, вируса инфекционной анемии лошадей, вируса бешенства, эрлихий, в частности, Ehrlichia canis, респираторных синцитиальных вирусов, вирусов парагриппа, метапневмовирусов и вируса кори.

В качестве альтернативы чужеродный ген может кодировать полипептидный иммуномодулятор, который способен усиливать или модулировать иммунный ответ на вирусную инфекцию, например, путем совместной экспрессии цитокина, такого как интерлейкин (например, IL-2, IL-12, IFN- , TNF- или GM-CSF).

Отряд Mononegavirales включает вирусы, которые способны к репликации в организме человека и животного, или в организме только человека, и только животного (например, вирус бешенства или вирус болезни Ньюкасла). Поэтому, чужеродный ген может быть выбран из широкого спектра микробных патогенов человека и животных.

Хотя в качестве векторного вируса по настоящему изобретению можно использовать все MV-вирусы, в предпочтительном варианте осуществления изобретения рекомбинантный MV-вирусный вектор является вирусом семейства Rhabdoviridae, предпочтительно, рода Lyssavirus или Novirhabdovirus, более предпочтительно, видом вируса бешенства или IHNV, соответственно.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения рекомбинантный MV-вирус является вирусом семейства Paramyxoviridae, предпочтительно, рода Respovirus, в частности видом hPlV3 или bPIV3, рода Morbillivirus, в частности, видом CDV, рода Pneumovirus, в частности, видом RSV, и рода Avulavirus, в частности, видом NDV.

В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному MV-вирусному вектору, при этом вирус является вирусом болезни Ньюкасла (NDV). Поскольку NDV способен реплицироваться в организме человека и животного, в частности в организме домашней птицы, более конкретно кур, то рекомбинантный NDV-вектор по изобретению может содержать чужеродный ген, который кодирует антиген патогена, в частности респираторного патогена, или иммуномодулятор, способные вызывать соответствующий иммунный ответ у людей или у любых из перечисленных животных.

Способы обратной генетики для генетических манипуляций с NDV подробно описаны для случая NDV в статьях Peeters et al. (J. Virology 73, 5001-5009, 1999), Römer-Oberdörfer et al. (J. Gen. Virol. 80 , 2987-2995, 1999) и в обзоре Conzelmann, K.K. (supra). Кроме того, также известно, что NDV можно использовать в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов, например, для стимуляции иммунного ответа у животных, инфицированных вектором NDV (Nakaya et al., 2001, supra) и Swayne et al., Avian Dis. 47, 1047-50, 2003).

Чужеродный ген можно успешно ввести в различные положения генома NDV, как в общем было описано выше для MV-вирусов. В частности, в рекомбинантном NDV-векторе по изобретению чужеродный ген (как часть соответствующей транскрипционной единицы) можно встроить между следующими генами NDV: NP-P, P-M, M-F, F-HN, HN-L и в 3'-проксимальный и 5'-дистальный локусы (Zhao et al., 2003, supra; Nakaya et al., 2001, supra), предпочтительно, в 3'-проксимальную, P-M, M-F и F-HN области, причем наиболее предпочтительной является область F-HN.

Кроме того, в рекомбинантном векторе NDV по настоящему изобретению некодирующие области, фланкирующие чужеродный ген, можно получить из всех природных генов NDV, в частности, из генов N, P, M, F или HN, предпочтительно, из гена HN.

В конкретном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному NDV-вектору, в котором дополнительная транскрипционная единица расположена между генами F-HN, а встроенный чужеродный ген фланкирован некодирующими областями гена HN из NDV.

Более конкретно, изобретение относится к вектору NDV, в котором 3'- и 5'-некодирующие области (и, необязательно, GS- и GE-последовательности) имеют нуклеотидные последовательности, представленные как в SEQ ID NO: 1 и 2 или 3 и 4.

Рекомбинантный NDV-вектор по настоящему изобретению имеет преимущество при использовании индукции иммунного ответа против других патогенов у домашней птицы, в частности у кур. Поэтому, рекомбинантный NDV-вектор, предпочтительно, содержит чужеродный антиген, кодирующий вызывающий иммунный ответ антиген патогена птиц, в частности вируса гриппа, вируса болезни Марека (MDV), вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV), вируса инфекционного бронхита (IBV), вируса инфекционного бурсита (IBDV), вируса куриной анемии (CAV), реовируса, ретровируса птиц, аденовируса птиц, вируса ринотрахеита индюшек (TRTV), E.coli, видов Eimeria, Cryptosporidia, микоплазм, таких как M.gallinarum, M.synoviae и M.meleagridis, Salmonella-, Campylobacter-, Ornithobacterium (ORT) или Pasteurella sp.

Более предпочтительно, рекомбинантный NDV-вектор содержит чужеродный ген, кодирующий антигены AIV, MDV, ILTV, IBV, TRTV, E.coli, ORT или микоплазмы.

В частности, мутант рекомбинантного NDV-вектора содержит ген гемагглютинина (НА) вируса гриппа, предпочтительно, вируса птичьего гриппа (AlV), более предпочтительно, гемагглютинина высокопатогенных штаммов Н5 или Н7 AIV.

В принципе, в соответствии с изобретением можно использовать ген НА всех штаммов гриппа (птиц). В данной области описаны нуклеотидные последовательности многих генов НА и их можно получить из нуклеотидных баз данных, таких как базы данных GenBank или EMBL.

Ген гемагглютинина (НА) недавно выделенного штамма A/chicken/Italy/8/98 высокопатогенного подтипа H5N2 AIV можно эффективно использовать в качестве чужеродного гена по настоящему изобретению, как описано выше. Проводили обратную транскрипцию гена, ген клонировали в вектор для экспрессии эукариот pcDNA3 (Invitrogen) и определяли его нуклеотидную последовательность (Lüschow et al., Vaccine, vol.19, p.4249-4259, 2001, номер доступа в базе данных Gen Bank № AJ305306). Из полученной экспрессионной плазмиды pCD-HA5 можно получить ген НА амплификацией со специфических праймеров, создающих искусственные сайты рестрикции, которые позволяют встроить ген НА в геномные последовательности NDV.

В дополнительном варианте осуществления изобретения ген НА штамма A/chicken/Italy/445/99 высокопатогенного подтипа H7N1 AIV можно использовать в качестве чужеродного гена в настоящем изобретении, как описано выше. Ген НА получали путем обратной транскрипции и амплифицировали ПЦР. Продукт длиной 1711 п.о. клонировали в вектор pUC18 (Amersham), расщепленный рестриктазой SmaI и секвенировали (Veits et al., J. Gen. Virol. 84, 3343-3352, 2003; номер доступа в базе данный GenBank № AJ580353).

В особенно эффективном рекомбинантном MV-вирусном векторе по настоящему изобретению MV-векторный вирус является аттенуированным, т.е. векторный вирус не является патогенным для животного-мишени или его вирулентность существенно снижена по сравнению с вирусом дикого типа. Многие MV-вирусы, используемые в настоящем изобретении в качестве вирусных векторов, имеют показатели безопасности в качестве живых аттенуированных вакцин за длительный период времени, такие как вирус кори и NDV, а другие вирусы, такие как SeV и VSV считаются непатогенными для людей. Кроме того, существуют общепринятые методики для получения и скрининга аттенуированных вирусов, имеющих ограниченные возможности к репликации и заражению. Такие методики включают серийное (холодное) пассирование вируса в гетерологичном субстрате и химический мутагенез.

Рекомбинантный вектор NDV по изобретению можно получить из любого обычного штамма вакцины против ньюкаслской болезни. Примерами таких подходящих штаммов NDV, присутствующих в имеющихся в продаже вакцинах, являются: Clone-30®, La Sota, Hitchner B1, NDW, C2 и AV4, при этом предпочтительным штаммом является Clone-30®.

Также авторы изобретения обнаружили, что рекомбинантный MV-вирусный вектор по настоящему изобретению способен вызывать защитный иммунный ответ у животных.

Поэтому, другой вариант осуществления изобретения относится к вакцине против микробного патогена, содержащей рекомбинантный MV-вирусный вектор, описанный выше, в живой или инактивированной форме, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

Вакцину по изобретению можно получить общеизвестными способами, такими как способы, обычно используемые для доступных в продаже живых и инактивированных MV-вирусных вакцин.

Кратко, в восприимчивый субстрат вносят рекомбинантный MV-вирусный вектор и размножают его до достижения желательного титра вируса, после чего собирают содержащий вирус материал. Затем из собранного материала получают фармацевтический препарат, обладающий иммуногенными свойствами.

В настоящем изобретении можно использовать любой субстрат, который способен поддерживать репликацию рекомбинантного MV-вирусного вектора. В качестве субстрата можно использовать как прокариотические, так и эукариотические клетки, в зависимости от MV-вируса. Подходящими клетками-хозяевами могут быть клетки позвоночных, например, приматов. Примерами подходящих клеток являются: клеточные линии человека HEK, WI-38, MRC-5 или H-239, клеточная линия обезьяны Vero, клеточные линии грызунов CHO, BHK, клеточная линия собаки MDCK или клетки птиц CEF или CEK.

Особенно подходящим субстратом для размножения рекомбинантного NDV-вектора по настоящему изобретению являются беспатогенные (SPF) оплодотворенные яйца. Оплодотворенные яйца можно, например, инокулировать 0,2 мл содержащей NDV аллантоидной жидкости, содержащей по крайней мере 10^2,0 EID₅₀ на яйцо. Предпочтительно, инокулировать оплодотворенные 9-11-дневные яйца 10^5,0 EID₅₀ и затем инкубировать в течение 2-4 дней при 37°С. Через 2-4 дня можно собирать ND-вирусный продукт, предпочтительно, отбирая аллантоидную жидкость. Затем можно центрифугировать жидкость в течение 10 мин при 2500 g с последующей фильтрацией супернатанта через фильтр (100 микрон).

Вакцина по изобретению содержит рекомбинантный MV-вирусный вектор вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем, обычно используемыми для таких композиций.

Содержащую живой вирус вакцину можно получить и реализовать в виде суспензии или в виде лиофилизата. Носители включают стабилизаторы, консерванты и буферы. Разбавители включают воду, водные буферы и полиспирты.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к вакцине, содержащей рекомбинантный MV-вирусный вектор в инактивированной форме. Основными преимуществами инактивированной вакцины является ее безопасность и возможность индукции высокого титра долгоживущих защитных антител.

Целью инактивации вирусов, собираемых после стадии размножения, является устранение способности вирусов к репродукции. Обычно этого можно достичь известными химическими или физическими средствами.

Если желательно, то вакцина по изобретению может содержать адъювант. Примерами подходящих для этой цели соединений и композиций, обладающих адъювантной активностью, являются гидроксид, фосфат или оксид алюминия, эмульсии «масло в воде» или «вода в масле» на основе, например, минерального масла, такого как Bayol F® или Marcol 52®, или растительного масла, такого как ацетат витамина Е, и сапонины.

Вводить вакцины по изобретению можно любым известным эффективным способом, который зависит от типа MV-вирусного вектора. Подходящие способы введения включают парентеральную, интраназальную, пероральную и аэрозольную вакцинацию.

Предпочтительно вводить NDV-векторную вакцину по изобретению при помощи недорогих методов массового применения, обычно используемых для вакцинации против NDV. Для вакцинации против NDV эти методы включают вакцинацию посредством питьевой воды и аэрозольную вакцинацию.

Вакцина по изобретению содержит эффективную дозировку рекомбинантного MV-вирусного вектора в качестве действующего компонента, т.е. определенное количество иммунизирующего MV-вирусного материала, которое будет вызывать иммунитет у вакцинированных птиц против антигенной стимуляции вирулентным микробным организмом. В настоящем описании иммунитет определяется как индукция после вакцинации достаточно высокого уровня защиты против смертности и клинических симптомов в популяции людей или животных по сравнению с невакцинированной группой. В частности, вакцина по изобретению защищает большую часть вакцинированных людей или животных от возникновения клинических симптомов болезни и смертности.

Обычно, живую вакцину можно вводить в дозировке 10^2,0-10^8,0 культуральной/эмбириональной инфекционной дозы (TC/EID₅₀), предпочтительно, в дозировке, варьирующей между 10^4,0-10^7,0 TC/EID ₅₀. Инактивированные вакцины могут содержать антигенный эквивалент 10^4,0-10^9,0 TC/EID₅₀ .

Изобретение также относится к комбинированным вакцинам, содержащим кроме рекомбинантного MV-вирусного вектора по изобретению штамм вакцины, способный вызывать защиту против еще одного патогена.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Создание рекомбинантного MV-вирусного вектора, экспрессирующего ген HA вируса птичьего гриппа (NDV/AIVH5)

Вирусы и клетки

Восстановленный рекомбинантный NDV и изолят A/chicken/Italy/8/98 вируса гриппа размножали в беспатогенных (SPF) 10-дневных оплодотворенных куриных яйцах. Использовали велогенный штамм Herts 33/56 вируса болезни Ньюкасла и вакцину Clone 30 (Nobilis®) против NDV.

Для восстановления инфекционного NDV из кДНК использовали клетки BSR-T7/5, стабильно экспрессирующие РНК-полимеразу фага Т7.

Конструирование кДНК, кодирующей антигеномную РНК NDV, содержащую ген Н5 AIV

Нумерация в скобках, используемая в настоящем описании для идентификации нуклеотидных позиций в геноме NDV и аминокислотных остатков в белках NDV, описана в статье Römer-Oberdörfer et al. (J. Gen. Virol. 80, 2987-2995, 1999, номер доступа в базе данных EMBL № Y18898). Плазмиду pflNDV, экспрессирующую полноразмерную антигеномную РНК Clone 30 (Römer-Oberdörfer et al., supra), использовали для встраивания гена Н5 AIV, который получали амплификацией плазмиды pCD-HA5 (Luschow et al., supra) со специфических праймеров с искусственными сайтами рестрикции MluI (PH5F1: 5'- cta aac gcg taa aat gga gaa aat agt gc -3' (SEQ ID NO:5) и PH5R1: 5'- tcg gac gcg ttt aaa tgc aaa ttc tgc act g -3' (SEQ ID NO:6), сайты рестрикции MluI подчеркнуты) для rNDV/AIVH5-A и с сайтами NcoI или AflII (PH5F2: 5'- cct tcc atg gag aaa ata gtg ctt c -3' (SEQ ID NO:7) и PH5R2: 5'- cct cct taa gta taa ttg act caa tta aat gca aat tct gca ctg caa tga tcc -3' (SEQ ID NO:8), сайты рестрикции подчеркнуты) для rNDV/AIVH5-B. Ген Н5 в антигеном Clone 30 (фиг.1А) встраивали, используя сайты MluI, как было описано ранее для встраивания GFP (Engel-Herbert et al., J. Virol. Methods 108, 19-28, 2003). Кратко, для создания полноразмерной плазмиды pflNDV/AIVH5-A открытую рамку считывания Н5 амплифицировали с праймерами, содержащими искусственные сайты рестрикции MluI (смотри выше), которые использовали для встраивания открытой рамки считывания Н5 в минимальную генную кассету между F и HN генами NDV (фиг.1А). Конструирование полноразмерной плазмиды, содержащей ген Н5 AIV, для создания rNDV/AlVH5-B приведено на фигуре 1В. Мутагенез проводили с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза Quik Change® II XL (Stratagene). Для этого использовали плазмиду pUC 18 (pUCNDV1), содержащую фрагмент NotI/BsiWI (нуклеотиды 4953-8852) генома Clone 30, и следующие праймеры: MP1 (5'- gac aac agt cct caa cca tgg acc gcg ccg -3') (SEQ ID NO:9) и MP2 (5'- ctg gct agt tga gtc aat tct taa gga gtt gga aag atg gc -3') (SEQ ID NO:10) для мутагенеза А (фиг.1В), в результате получая плазмиду pUCNDV1a с нововведенными сайтами NcoI и AflII (сайты рестрикции в праймерах подчеркнуты). После расщепления NcoI и AflII открытую рамку считывания HN из Clone 30 заменяли амплифицированной открытой рамкой считывания Н5 из AIV. В мутагенезе В для создания сайтов рестрикции SgfI и SnaBI в области между генами перед геном L плазмиды pUCNDVH5 использовали праймеры MP3 (5'- caa aac agc tca tgg tac gta ata cgg gta gga cat gg -3') (SEQ ID NO:11) и MP4 (5'- gta agt ggc aat gcg atc gca ggc aaa aca gct cat gg -3') (SEQ ID NO:12), в результате получая плазмиду pUCNDV/AIVH5-1b (фиг.1В). В мутагенезе С использовали праймеры MP3 и MP5 (5'- gaa aaa act acc ggc gat cgc tga cca aag gac gat ata cgg g -3') (SEQ ID NO:13), получая плазмиду pUCNDV1c для того, чтобы ввести сайты SgfI и SnaBI, используемые для встраивания гена HN из Clone 30 в область между генами перед геном L в плазмиде pUCNDVH5_1b. В конце, фрагмент NotI/BsiWI замещали фрагментом NotI/BsiWI из плазмиды pUCNDVH5_1c (фиг.1В). Длина вновь созданных полноразмерных генов представляла кратное шести (16938 нуклеотидов для rNDV/AIVH5-A и 17196 нуклеотидов для rNDV/AIVH5-B).

Трансфекция и размножение вируса

Трансфекции, размножение вируса и подтверждение восстановления инфекционного вируса проводили как было описано ранее (Römer-Oberdörfer et al., supra; Engel-Herbert et al., supra). Единственным отличием было то, что общее количество ДНК, используемое в трансфекции, составляло 20 мкг (10 мкг плазмиды, содержащей полноразмерный геном, 6 мкг плазмиды pCiteNP, 2 мкг плазмиды pCiteP и 2 мкг pCiteL).

Результаты

Открытую рамку считывания гена Н5 из AIV встроили между генами F и HN ранее описанной плазмиды pflNDV (Römer-Oberdörfer et al., supra). Для этого амплифицировали открытую рамку считывания Н5 AIV из изолята A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) вируса птичьего гриппа, используя в качестве матрицы плазмиду pCD-HA5 (Luschow et al., supra) и специфические праймеры с сайтами рестрикции MluI, которые использовали для встраивания открытой рамки считывания гена Н5 вируса птичьего гриппа в единственный сайт MluI плазмиды pflNDVoligo1; (Engel-Herbert et al., supra), в результате получая плазмиду pflNDV/AIVH5-A (фиг.1A). В этой конструкции открытая рамка считывания Н5 вируса птичьего гриппа была фланкирована искусственными стартовой (GS) и концевой (GE) последовательностями гена в области между генами F и HN NDV. Для создания полноразмерной плазмиды pflNDV/AlVH5-B открытую рамку считывания гена HN из плазмиды pUCNDV1a замещали амплифицированной открытой рамкой считывания гена Н5 в виде фрагмента Nco I/AflII (фиг.1В). В полученной плазмиде pUCNDVH5 были созданы сайты рестрикции SgfI and SnaBI в области между генами ниже гена Н5, что в результате дало плазмиду pUCNDVH5_1b (фиг.1В). Созданные сайты рестрикции SgfI и SnaB I использовали для встраивания гена HN из плазмиды pUCNDV1c, в которой ген HN также фланкирован сайтами рестрикции Sgf I и SnaBI (фиг.1В). В конце полученную плазмиду pUCNDVH5_1c использовали для замены фрагмента NotI/BsiWI из плазмиды pflNDV (фиг.1В). Полученная плазмида pflNDV/AlVH5-B отличается от плазмиды pflNDV/AIVH5-А, поскольку между элементами транскрипционного контроля (GS, GE) и открытой рамкой считывания гена Н5 были дополнительно встроены некодирующие области гена HN из NDV.

Рекомбинантные вирусы ньюкаслской болезни rNDV/AIVH5-A и rNDV/AIVH5-B восстанавливали в клетках BSR-T7/5, трансфецированных соответствующими полноразмерными кДНК и вспомогательными плазмидами, как было описано ранее (Römer-Oberdörfer et al., supra; Engel-Herbert et al., supra). Для восстановления вируса проводили инъекции трансфекционными супернатантами в аллантоидную полость 10-дневных оплодотворенных яиц кур, и инкубировали их в течение 5 дней. Аллантоидную жидкость собирали и проводили анализ на присутствие вируса с помощью теста гемагглютинации или посредством метода непрямой иммунофлуоресценции (IF). Содержащую вирус аллантоидную жидкость использовали в повторном пассировании вируса в яйцах для дальнейшего размножения вируса. Присутствие встроенного гена Н5 в геноме вирусов rNDV/AIVH5-A и rNDV/AIVH5-B подтверждали с помощью метода ОТ-ПЦР и секвенирования (данные не приведены). На фигурах 2А и 2В показана нуклеотидная последовательность областей, фланкирующих открытую рамку считывания гена HN в NDV и открытую рамку считывания гена Н5 в векторе NDV.

Пример 2: in vitro характеристика вектора NDV/AIVH5

Анализ РНК

Клетки CEF заражали NDV Clone 30, rNDV/AIVH5-A, rNDV/AIVH5-B и AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) при множественности инфекции (MOI) 10 на клетку и инкубировали 8 часов при 37°С. Получали тотальную РНК из инфицированных и неинфицированных клеток, разделяли в денатурирующем агарозном геле и гибридизовали с радиоактивномеченной кРНК. Плазмиды pCD-HA5 and pCD-NDVHN, которые содержали открытую рамку считывания гена H5 AIV A/chicken/ltaly/8/98 (H5N2) и гена HN NDV Clone 30, использовали для транскрипции in vitro ³²Р-меченной кРНК (SP6/T7 Transcription kit, компании Roche).

Для того чтобы подтвердить транскрипцию гена Н5 из AIV, встроенного в rNDV/AIVH5-A и -B, проводили Нозерн-блот на тотальной РНК из первичных фибробластов эмбрионов цыпленка, зараженных рекомбинантными NDV/AIVH5. В качестве контроля использовали препараты РНК из клеток, зараженных NDV Clone 30 и AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2). С помощью специфичной антисмысловой кРНК транскрипцию встроенного гена Н5 из AIV детектировалия для rNDV/AIVH5-A, а также для rNDV/AIVH5-B (фиг.3). Было замечено, что транскрипт AIV-H5B был удлинен на примерно 81 нт и был более распространен, чем транскрипт AIV-H5A.

Вестерн-блот

Клетки CEF заражали NDV Clone 30, rNDV/AIVH5-A, rNDV/AIVH5-B и AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) и инкубировали 20 часов при 37°С. Лизаты инфицированных и неинфицированных контрольных клеток разделяли на ДСН-ПААГ (приблизительно 10⁴ клеток на дорожку) и переносили на нитроцеллюлозные фильтры (Trans-Blot® SD cell, Bio-Rad). Блоты инкубировали с поликлональной кроличьей антисывороткой против NDV или поликлональной куриной антисывороткой против подтипа Н5 AIV в разведении 1:20000 и 1:2500, соответственно. Детекцию связавшихся конъюгированных с пероксидазой вторичных антител проводили хемилюминесцентным методом, используя хемилюминесцентный субстрат SuperSignal® West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce) и рентгеновскую пленку (Hyperfilm® MP, Amersham).

В анализе методом Вестерн-блоттинга белок Н5 детектировался только в клетках, инфицированных rNDV/AIVH5-B. Специфичная к подтипу Н5 AIV антисыворотка обнаружила два заметно выделяющихся белка с приблизительным молекулярным весом 70 и 50 кД и едва видимый белок с приблизительным молекулярным весом 25 кД, которые не обнаруживались в клетках, зараженных NDV Clone 30 (фиг.4).

Непрямая иммунофлуоресценция

Для анализа методом непрямой флуоресценции проводили заражение клеток CEF низкой MOI вирусами NDV Clone 30, rNDV/AIVH5-A, rNDV/AIVH5-B и AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) в течение 20 часов. После фиксации в метаноле и ацетоне (1:1) клетки затем инкубировали или с поликлональной кроличьей антисывороткой против NDV, или с поликлональной куриной антисывороткой против подтипа Н5 AIV в разведении 1:3000 и 1:100, соответственно. После инкубирования с F(ab)₂-фрагментами анти-кроличьих IgG и флуоресцеин-конъюгированными антителами против IgG курицы образцы анализировали с помощью обычной флуоресцентной микроскопии.

Экспрессию Н5 в инфицированных клетках проверяли методом непрямой иммунофлуоресценции. После инкубации с NDV-специфичной антисывороткой выраженная флуоресценция наблюдалась в клетках, инфицированных NDV Clone 30, rNDV/AIVH5-A и rNDV/AIVH5-B, но не в клетках, инфицированных AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2), или неинфицированных клетках (фиг.5, правая панель). Инкубация с антисывороткой, специфичной к подтипу Н5 AIV, показала заметную флуоресценцию клеток, инфицированных AIV. При сравнении двух рекомбинантов rNDV/AIVH5-B показывал более интенсивную флуоресценцию, специфичную к Н5, чем rNDV/AIVH5-A, что указывало на более высокий уровень экспрессии белка Н5 (фиг.5, левая панель).

Иммуноэлектронная микроскопия

Вирусные клетки сорбировали на медную сеточку с формваровой подложкой в течение 7 минут. Сеточки промывали четыре раза раствором PBS, содержащим 0,5% бычьего сывороточного альбумина, и далее инкубировали с NDV-специфичной или специфичной к подтипу Н5 AIV антисывороткой в течение 45 минут. После нескольких промывок РВ сетки инкубировали в течение еще 45 минут с белком А, конъюгированным с коллоидным золотом (10 нм, PAG 10, Biocell International), и вторичными кроличьими антителами против куриных иммуноглобулинов, коньюгированными с коллоидным золотом (10 нм, RCHL 10, Biocell International). После финальных промывок буфером РВ вирусные частицы оттеняли фосфовольфрамовой кислотой (РТА, рН 7,2) и исследовали на электронном микроскопе.

При исследовании вирионов из NDV Clone 30 или rNDV/AIVH5-A окрашивание наблюдалось только при использовании NDV-специфичной антисыворотки. В отличие от этого, для rNDV/AIVH5-B окрашивание наблюдалось при использовании антисыворотки против NDV и также при использовании антисыворотки против AIV, что демонстрировало, что вирионы из rNDV/AIVH5-B содержат гемагглютинин Н5. Частицы золота обнаруживались преимущественно на поверхности вирионов rNDV/AIVH5-B, что указывало на то, что гемагглютинин был закреплен на вирусной мембране.

Пример 3: in vivo характеристика вектора NDV/AIVH5

Оценка защиты, обеспечиваемой рекомбинантными rNDV/AIVH5-A и rNDV/AIVH5-B:

Однодневных цыплят случайным образом распределяли по двум группам и проводили окулоназальную вакцинацию 10⁶ EID₅₀ rNDV/AIVH5-A или имеющейся в продаже вакциной NDV Clone 30 (Nobilis®, Intervet, NL) путем распыления. На 28 день проводили вторую вакцинацию таким же образом. На 12 день после второй иммунизации забирали образцы крови для оценки присутствия антител против NDV и H5 AIV с помощью теста гемагглютинации. Через две недели после второй вакцинации иммунизированные группы разделяли и одну часть каждой группы заражали окулоназально 10⁸ EID₅₀ высоко патогенного изолята AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2). Других кур использовали для оценки эффективности защиты вакцин против велогенного NDV. Для этого птицы и дополнительные контрольные животные получали 10^5,3 EID₅₀ штамма Herts 33/56 вируса NDV внутримышечно.

После иммунизации и проверочного заражения всех птиц наблюдали ежедневно в течение 10 дней и следили за появлением клинических признаков, при этом птиц классифицировали как здоровых (0), больных (1; один из следующих признаков: респираторные симптомы, депрессия, диарея, цианоз, эдема, беспокойство), тяжело больных (2; более, чем один из следующих признаков: респираторные симптомы, депрессия, диарея, цианоз, эдема, беспокойство) или мертвых (3). Вычисляли клиническую оценку, представляющую собой среднее значение для всех кур из группы за этот период. В конце, через три недели после заражения, отбирали образцы крови у выживших животных для определения титра антител против AIV и NDV.

Рекомбинантный вирус ньюкаслской болезни rNDV/AIVH5-B тестировали в отдельном испытании на животных по практически идентичной схеме эксперимента. Единственным отличием являлось то, что иммунизацию 10⁶ EID₅₀ rNDV/AIVH5-A или вакциной NDV Clone 30 проводили в обеих группах окулоназально и не проводили заражение NDV.

Все данные их этих экспериментов объединены в таблице 4 и фигуре 6. Сыворотку иммунизированных кур анализировали с помощью теста гемагглютинации через три недели после вакцинации, но в обоих случаях не могли обнаружить НА-специфичных антител в сыворотке. У всех животных в обеих группах был обнаружен высокий уровень NDV-специфичных антител, уже после первой иммунизации (средние титры гемагглютинации составляли 26-27) животные были полностью защищены против инфекции велогенным NDV, в то время как все контрольные животные умерли в течение 4 дней с типичными признаками ньюкаслской болезни. Как и ожидалось, заражение AIV вызывало тяжелую болезнь у кур, иммунизированных NDV Clone 30 с уровнем смертности 90%. Животные из группы, иммунизированной rNDV/AlVH5-A, выживали при введении смертельной дозы высокопатогенного AIV, но у всех кур проявлялись различные признаки птичьего гриппа с клинической оценкой 0,64, что указывает на недостаточную защиту. В то время как после заражения высокопатогенным вирусом птичьего гриппа А куры, иммунизированные rNDV/AIVH5-B, были полностью защищены от любых признаков заболевания.

Таблица 4 Итоговые данные экспериментов на животных с использованием rNDV/AIVH5-A и rNDV/AIVH5-B
1. Иммунизация	Временная шкала 1)	rNDV/AIVH5-А окулоназально	Clone 30 распыление	контроль	Временная шкала1)	rNDV/AIVH5-В окулоназально	Clone 30 окуло-назально
EID50/ животное		10 5,7	106,0	-		10 6,0	106,0
Смертность	1-10 д.п.и.	0/24	0/34	-	1-10 д.п.и.	0/5	0/5
Заболеваемость	1-10 д.п.и.	6/24	5/34	-	1-10 д.п.и.	0/5	0/5
клиническая оценка2)		0,034	0,016			0	0
NDV-специф. антитела	17 д.п.и.	22/22	34/34	-	21 д.п.и.	5/5	5/5
HI-титр		25,6	27,2			25,6	27,6
НА-специф. антитела	17 д.п.и.	22/22	34/34		21 д.п.и.	5/5	5/5
HI-титр		0	0			0	0

2. Иммунизация	28 д.п.и.	rNDV/AIVH5-А окулоназально	Clone 30 распыление	Кон-троль	28 д.п.и.	rNDV/AIVH5-В окулоназально	Clone 3 окуло-назально
EID50/ животное		10 6,0	106,0	-		10 6,0	106,0
Смертность	1-10 д.п.в.и.	0/22	0/24	-	1-10 д.п.в.и.	0/5	0/5
Заболеваемость	1-10 д.п.в.и.	4/22	3/24	-	1-10 д.п.в.и.	0/5	0/5
клиническая оценка2)		0,023	0,017			0	0
NDV-специф. антитела	12 д.п.в.и.	21/21	24/24	5/5	12 д.п.в.и.	5/5	5/5
HI-титр		27,3	26,8	0		26,0	27,8
НА-специфич. антитела	12 д.п.в.и.	2/21	24/24	5/5	12 д.п.в.и.	5/5	5/5
HI-титр		23	0	0		0	0

Заражение EID50/животное	14 д.п.в.и.	NDV Herts 33/56 105,3
Смертность	3-4 д.п.з.	0/10	0/10	5/5
Заболеваемость	1-10 д.п.з.	4/10	5/10	5/5
клиническая оценка2)		0,04	0,05	2,4
NDV-специфичные антитела	20 д.п.з.	10/10	10/10
HI-титр		28,9	29,2

Заражение	14	AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2)	AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2)
EID50/животное	д.п.в.и.	108,0	107,7
Смертность	3-6 д.п.з.	0/10	9/10		3-4 д.п.з.	0/5	4/5
Заболеваемость	1-10	10/10	10/10		1-10 д.п.з.	0/5	5/5
клиническая оценка2)	д.п.з.	0,64	2,57			0	22,2
AIV-специфичные антитела	20 д.п.з.	10/10	1/1		24 д.п.з.	5/5	1/1
HI-титр		26,5	29,0			28,0	211
д.п.и. - дни после иммунизации; д.п.в.и. - дни после вторичной иммунизации; д.п.з. - дни после заражения; HI-титр - титр ингибирования гемагглютинации

Пример 4: конструирование вектора NDV/AIV-H5 с фланкирующей некодирующей областью гена F NDV

С использованием в основном тех же методов и материалов, описанных выше (Engel-Herbert et al., supra), была создана NDV-векторная конструкция, несущая ген H5 AIV между генами F и HN ранее описанной плазмиды pflNDV (Römer-Oberdörfer et al., supra), но в данном случае вставка Н5 была фланкирована некодирующими областями F-гена NDV.

Краткое описание используемых различных материалов и стадий:

Проводили мутагенез плазмиды pUC с фрагментом NotI-PstI длиной 1,6 т.п.о. из NDVH5 (pUCIRA) для того, чтобы создать сайт MluI, используя праймеры для мутагенеза: pMPMLUIGRFHNF (5'- ggt tgt aga tga cca aag gac qcgtta cgg gta gaa cgg taa gag agg -3'; SEQ ID NO:14) и pMPMLUIGRFHNR (5'- cct ctc tta ccg ttc tac ccg taa cgc gtc ctt tgg tca tct aca acc -3'; SEQ ID NO:15) (сайт MluI подчеркнут, GS-последовательность выделена жирным шрифтом), в результате получая плазмиду pUCIRAMLU.

Проводили отжиг двух нуклеотидов: OFVOF: 5'- agg acg cgt tac ggg tag aag att ctg gat ccc ggt tgg cgc cct cca ggt gca gca cca tgg ag -3' (SEQ ID NO:16, сайт MluI подчеркнут) и OFVOR: 5'- ctc cat ggt gct gca cct gga ggg cgc caa ccg gga tcc aga atc ttc tac ccg taa cgc gt c ct -3' (SEQ ID NO:17, сайт MluI подчеркнут). Далее эти конструкции расщепляли рестриктазами MluI и NcoI.

Расщепление плазмиды pUCIRAMLU рестриктазами MluI и NcoI.

Лигирование фрагмента MluI-NcoI из плазмиды pUCIRAMLU с приблизительной длиной 4,3 т.п.о. с расщепленными MluI-NcoI гибридизованными олигонуклеотидами OFVOF/OFVOR. Полученная плазмида была названа PUCIRA2.

Расщепляли плазмиду pUC (pUCAROK) с фрагментом NotI-BsiWI из NDV с открытой рамкой считывания H5 вместо открытой рамки считывания гена HN и плазмиду pUCIRA2 рестриктазами NcoI и SgfI, и заменяли фрагмент NotI-NcoI из pUCAROK на фрагмент из pUCIRA2, в результате получая плазмиду pUCAROK2.

Проводили высокоточную ПЦР (Roche) для амплификации некодирующей области гена F NDV позади встроенного гена F, используя праймеры: PNCRFHIF: 5'- ata ctt aag ttc cct aat agt aat ttg tgt -3' (SEQ ID NO:18, сайт AflII подчеркнут), и PNCRFHIR: 5'- cac gcg atc gca ttg cca ctg tac att ttt tct taa ctc tct gaa ctg aca gac tac c -3' (SEQ ID NO:19, сайт SgfI подчеркнут), и плазмиду pUCAROA (плазмиду pUC с фрагментом NotI-SpeI из NDV). Полученный фрагмент длиной примерно 100 п.о. лигировали в вектор pGEMTeasy, что дало плазмиду pGEMFncrhi.

Проводили расщепление рестриктазами AflII и SgfI плазмид pUCAROK2 и pGEMFncrhi для замещения некодирующей области гена HN позади Н5 в плазмиде pUCAROK2 такой же областью гена F из pGEMFncrhi. Полученная плазмида была названа pUCAROK4.

В последней стадии фрагмент NotI-SgfI плазмиды NDVH5 был заменен на такой же фрагмент из плазмиды pUCAROK4, что в результате давало новую полноразмерную плазмиду E18C, содержащую ген Н5 AIV, встроенный в NDV-вектор между генами F и HN, и фланкированный некодирующими областями гена F.

Проводили размножение рекомбинантного вируса и подтверждали восстановление инфекционного вируса в трансфекционных экспериментах с новыми конструкциями, как было описано выше. Далее проводили биохимическую и биологическую характеристику вируса.

Пример 5: Создание других NDV-векторных конструкций и рекомбинантных вирусов:

Используя аналогичные методики в NDV-вектор встраивали другие гены по другим сайтам встраивания.

С подробностями, данными в настоящем описании, стратегии создания этих конструкций будут очевидны специалистам, поэтому достаточно представить эти конструкции в форме таблицы:

Таблица 5: Другие конструкции на основе NDV-вектора по изобретению:
Встроенный ген	Область встраивания в NDV	Некодирующая область NDV, фланкирующая встроенный ген
H5 AIV	Р-М	HN
H5 AIV	М-F	HN
H7 AIV	F-HN	HN
N1 AIV	F-HN	HN
H5 AIV	Перед NP	HN

Пример 6: Создание вектора на основе рекомбинантного вируса бешенства, экспрессирующего ген белка оболочки EIAV

Для того чтобы продемонстрировать, что преимущество, обеспечиваемое изобретением (применение некодирующих областей MV-генов для увеличения экспрессии и/или представления чужеродных белков в рекомбинантных MV-вирионах), выходит за пределы семейства Paramyxoviridae использовали вирус бешенства (член семейства Rhabdoviridae) в качестве вектора для экспрессии белка оболочки из неродственного вируса, вируса инфекционной анемии лошадей (EIAV).

В этом примере описана конструкция рекомбинантного вируса бешенства, содержащего белок оболочки EIAV, встроенный между генами G и L вируса бешенства, причем ген оболочки фланкирован некодирующими областями гена белка G вируса бешенства.

Субклоны вирусов бешенства получали в фагмиде pBluescript® SK+, используя полноразмерный клон SAD-D29 (Mebatsion, 2001, J. Virol., vol.75, p.11496-11502), который в этом описании называется ORA-D. Чтобы получить вектор для клонирования, вектор pSK сначала расщепляли SacI, затем для получения тупых концов достраивали выступающие концы фрагментом Кленова, далее проводили рестрикцию HindIII и очищали через гель фрагмент длиной примерно 3 т.п.о. Вставку получали путем расщепления ORA-D рестриктазами StuI и HindIII, очищали полученный фрагмент длиной 1,3 т.п.о. и лигировали его с приготовленным вектором pSK, чтобы получить плазмиду pNCR-b.

Плазмиду pNCR-b расщепляли рестриктазами BstXI и HindIII и фрагмент длиной около 4 т.п.о. очищали и использовали в реакции лигирования с олигонуклеотидами BSSNH+ и BSSNH- (смотри таблицу 6) для того, чтобы создать содержащую минимальную транскрипционную кассету плазмиду pSSNsc, и использовали в реакции лигирования с олигонуклеотидами RABGNCR1-4 (таблица 6) для создания конструкции GNCR-b, содержащей некодирующие области в дополнение к минимальной транскрипционной единице (фигура 7).

Ген белка оболочки штамма Wyoming EIAV получали амплификацией синтетического гена длиной 2052 нуклеотидов, у которого были оптимизированы кодоны, удалены сайты сплайсинга РНК (Cook, et al. 2005, Vet. Micro., vol.108, p.23-37) и который был укорочен на 134 аминокислоты на 3'-кодирующем конце исходного гена.

Таблица 6: Последовательности олигонуклеотидов, используемых в ходе конструирования рекомбинантных вирусов бешенства
Название олигонуклеотида	SEQ ID NO:	Последовательность олигонуклеотида (5'->3')
BSSNH+	20	CTGGTGAAAAAAACTAACACCCCTGCTAGCA
BSSNH-	21	CGTTGACCACTTTTTTTGATTGTGGGGACGAT-CGTTCGA
RABGNCRoligo1 (*)	22	CTGGTGAAAAAAACTATTAACATCCCTCAAAA- GACTCAAGGATACGTACT
RABGNCRoligo2	23	GTATCCTTGAGTCTTTTGAGGGATGTTAATAG- TTTTTTTCACCAGTTGC
RABGNCRoligo3	24	GGCCGTCCTTTCAACGATCCAAGTCCTGAAGA- TCACCTCCCCTTGGGGGA
RABGNCRoligo4	25	AGCTTCCCCCAAGGGGAGGTGATCTTCAGGAC- TTGGATCGTTGAAAGGACGGCCAGTAC
EIAsynCDF	26	ATGGTGTCCATCGCCTTCTA
EIAsynCDstopR	27	TCAGTGTATGTTGTGTTGGGC
(*) 3 нуклеотида изменены в исходной последовательности ORA-D: GGAAAG GGACTGG на: GGA TAC GTACTGG

Амплифицированный ген кинировали и встраивали в субклоны по нижеследующей схеме: ампликон размером 2 т.п.о., сконструированный так, что он представлял весь укороченный белок оболочки EIAV, получали, используя набор праймеров EIAsynCDF + EIAsynCDstopR (смотри таблицу 6). Ампликон встраивали в субклон GNCR-b, предварительно расщепленный рестриктазой SnaBI и дефосфорилированный, чтобы получить рекомбинантную плазмиду pGNCR-b:envG. Фрагмент размером ~2 т.п.о. также встраивали в субклон SSNsc, предварительно расщепленный NheI, выступающие концы которого были превращены в тупые и дефосфорилированы, чтобы получить рекомбинантную плазмиду pSSNsc:env.

Каждую рекомбинантную конструкцию расщепляли SphI и HindIII и лигировали с субклоном SSNsc, предварительно расщепленным SphI/HindIII и дефосфорилированным с помощью CIAP (щелочной фосфатазой из кишечника теленка). После возвращения в субклон SSNsc модифицированные вставки возвращали в каркас ORA-D путем расщепления SphI и MluI для того, чтобы получить рекомбинантные вирусы бешенства RV-env и RV-envG (фигура 8). Проверку 5' и 3'-концов конструкций осуществляли ПЦР-секвенированием, используя Big-Dye® Terminators (Applied Biosystems) и анализируя реакции методом капиллярного электрофореза на секвенаторе Applied Biosystems 3100-Avant.

Конструирование полноразмерного кДНК-клона на основе модифицированного SAD-штамма вируса бешенства ORA-D и создание рекомбинантного вируса бешенства были описаны (Schnelt et al., 1994, EMBO J., vol.13, p.4195-4203; Mebatsion, 2001, supra). Каждым рекомбинантным вирусом бешенства трансфецировали клетки BSR, как было ранее описано (Schnell, et al., 1994, supra), используя набор Trans-IT-LT1 компании Mirus. Через три дня после трансфекции собирали клетки и супернатанты и пассировали. Последовательные пассажи осуществляли только супернатантами, используя примерную множественность инфекции 0,5. Для подтверждения стабильности вируса каждый рекомбинантный вирус перепассировали как минимум 5 раз.

Клетки BSR, зараженные рекомбинантными вирусами бешенства, фиксировали через примерно 40 часов после заражения. Их анализировали методом прямой иммунофлуоресценции, используя меченные FITC моноклональные антитела против бешенства (компании FDI Diagnostics Inc.) или используя сыворотку лошадей против EIAV. Также для наблюдения за стабильностью вируса и экспрессией рекомбинантного антигена в серии 10-кратных разведений сравнивали соотношение количества инфицированных клеток, продуцирующих вирус бешенства, к количеству инфицированных клеток, экспрессирующих белок оболочки EIAV.

Рекомбинантные вирусы после пятого пассажа вносили в культуральные флаконы Т-75 с клетками BSR при множественности инфекции, составляющей 0,01. Через 24 часа после заражения заменяли среду на бессывороточную среду. Супернатанты собирали и очищали центрифугированием (10000×g) через 72 часа после заражения. Для анализа очищенных вирионов вирусные супернатанты очищали в градиенте сахарозы.

Очищенные вирионы и общий белок инфицированных клеток смешивали с 2х восстанавливающим буфером Лэмли для образцов и помещали в кипящую воду на 5-10 минут. Образцы наносили на 10% Tris-HCL акриламидный гель (Bio-Rad) в 1х буфере для разделения. Электрофорез в ДСН-ПААГ проводили при 20 мА до тех пор, пока фронт красителя на достигал низа геля. Разделенные белки переносили на мембрану Immobilon-P (PVDF) (IPVH10100, Immobilon) при 225 мМ в течение 45 минут. Блоты инкубировали в блокирующем буфере (PBS-Tween 20+1% сухого обезжиренного молока) в течение одного часа при комнатной температуре и затем промывали три раза по 5 минут в PBS-Tween 20. Экспрессию вируса бешенства детектировали, используя кроличьи поликлональные сыворотки против гликопротеина и нуклеопротеина вируса бешенства, разведенные 1:20000 и 1:2000, соответственно, в блокирующем буфере.

Далее детектировали экспрессию белка оболочки EIAV, используя поликлональную лошадиную сыворотку против EIAV, разведенную 1:500 в блокирующем буфере. Блоты инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре и затем промывали 3 раза по пять минут в PBS-Tween20. Блоты помещали в HRP-меченный конъюгат козьих IgG (H+L) против кроличьих антител (компании KPL) и HRP-меченный конъюгат козьих IgG (H+L) против лошадиных антител (компании Bethyl Labs), каждый разведенный 1:2000 в блокирующем буфере, и инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре. Блоты затем промывали 3×5 минут в PBS-Tween20. Блоты инкубировали в субстрате пероксидазы TMB (компании KPL) до завершения реакции, приблизительно 1-3 минуты. Блоты помещали в дистиллированную воду для остановки реакции.

Типичный результат такого Вестерн-блота показан на фигуре 9, и он демонстрирует белковый состав рекомбинантных вирусов бешенства, экспрессирующих белок оболочки EIAV.

Дорожка 1: маркер молекулярных весов широкого спектра (Bio-Rad);

Дорожка 2: исходный вирус ORA-D;

Дорожка 3: RV-env (рекомбинантный вирус бешенства, содержащий белок оболочки EIAV), содержащей ген белка оболочки EIAV, встроенный между генами G и L вируса бешенства без фланкирующих некодирующих областей;

Дорожка 4: RV-envG (рекомбинантный вирус бешенства, содержащий белок оболочки EIAV), содержащей ген белка оболочки EIAV, фланкированный некодирующими областями белка G вируса бешенства.

Оба рекомбинантных вируса давали сравнимые инфекционные титры и стабильно экспрессировали встроенный ген белка оболочки EIAV после множественных пассажей in vitro.

Однако несмотря на то, что на блот наносили сопоставимые количества вирионов, рекомбинантный RV-env, сконструированный традиционным путем (а именно без фланкирующих некодирующих областей) давал очень слабую полосу, соответствующую белку оболочки EIAV; в то время как рекомбинантный RV-envG, в котором встроенный ген белка оболочки EIAV был фланкирован некодирующими областями G-белка, экспрессировал его с гораздо большей интенсивностью: на фигуре 9 сравните полосы белка оболочки на дорожках 3 и 4.

Поскольку конструкции и вставки RV-envG и RV-env являются идентичными, то это является уверенным доказательством того, что некодирующие области обладают положительным эффектом в усилении продукции высокого уровня чужеродного белка и его иммунопредставления.