способ прогнозирования обострений хронического вирусного гепатита в у подростков

Формула изобретения

Способ прогнозирования обострений хронического вирусного гепатита В у подростков путем исследования крови, отличающийся тем, что с помощью биолюминесцентного метода определяют активности ферментов лимфоцитов периферической крови больных: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и лактатдегидрогеназы (НАДН-ЛДГ), вычисляют соотношение активностей и при значении полученного показателя, равном или более 1,15, прогнозируют обострения, а при значении показателя менее 1,15 прогнозируют отсутствие обострений.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии и гепатологии, и может быть использовано для прогнозирования характера течения хронического гепатита В (ХГВ) у детей подросткового возраста.

Известен способ прогнозирования обострений вирусных гепатитов путем исследования билирубина в сыворотке крови и определения уровня сывороточного железа на пике билирубинемии и через 7-10 дней после него [3]. При нарастании уровня сывороточного железа по сравнению с первоначальным уровнем прогнозируют обострение вирусного гепатита. Недостатком способа является прогнозирование обострений только при затяжном течении острых гепатитов. К тому же способ требует неоднократного забора крови.

Задачей изобретения является создание информативного способа раннего прогнозирования обострений ХГВ у подростков.

Поставленную задачу осуществляют за счет того, что с помощью биолюминесцентного метода определяют активности ферментов лимфоцитов периферической крови больных: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и лактатдегидрогеназы (НАДН-ЛДГ), вычисляют соотношение активностей, и при значении полученного показателя, равном или более 1,15, прогнозируют обострения, а при значении показателя менее 1,15 прогнозируют отсутствие обострений.

Значение 1,15 получено опытным путем на основании сопоставления рассчитываемого показателя и характером течения ХГВ у обследуемых подростков.

Значение показателя, определяемое по соотношению величин активностей Г6ФДГ и НАДН-ЛДГ, равное или более 1,15 свидетельствует о значительном оттоке субстратов с гликолиза на реакции пентозофосфатного цикла, что снижает уровень анаэробных энергетических процессов и, соответственно, понижает функциональную активность лимфоцитов.

Известно, что лимфоциты, реализующие основные функции специфического иммунного ответа, являются главными клетками в системе иммунологического надзора и принимают активное участие в системе противоинфекционной защиты, в том числе и при вирусном гепатите В (ВГВ) [4]. От уровня функциональной активности лимфоцитов зависит исход острой инфекционной болезни и характер течения хронического инфекционного процесса. В то же время установлено, что функциональная активность лимфоцитов в значительной степени определяется уровнем их метаболических процессов [6]. К числу показателей, наиболее объективно отражающих основные параметры внутриклеточного метаболизма, можно отнести дегидрогеназы.

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.49) - осуществляет дегидрирование глюкозо-6-фосфата и кофермента НАДФ. Образовавшийся в ходе данной реакции 6-фосфоглюконо- -лактон является нестабильным и гидролизуется либо спонтанно, либо с помощью фермента 6-фосфоглюконолактоназы с образованием 6-фосфоглюконата [1]. Г6ФДГ катализирует инициализирующую и ключевую реакцию пентозофосфатного цикла, который является конкурентом гликолиза за субстрат (глюкоза-6-фосфат). В норме доля пентозофосфатного цикла в количественном превращении глюкозы обычно невелика и варьирует в зависимости от функционального состояния клеток.

Лактатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.27) - фермент гликолиза, обратимо катализирующий окисление лактата в пировиноградную кислоту с участием в качестве кофермента НАД⁺. Лактатдегидрогеназа занимает ключевое положение в регуляции цитоплазматического уровня НАДН/НАД и характеризует уровень терминальных реакций гликолиза [1].

Способ выполняется следующим образом.

У детей подросткового возраста, больных ХГВ, забирают венозную кровь из локтевой вены свободным током в пробирки с гепарином. Выделяют лимфоциты. Центрифугируют на градиенте плотности фиколл-верографина по стандартной методике A.Boyum (1968) [5]. Подсчитывают концентрацию лимфоцитов, например, в камере Горяева. При контроле морфологического состава лейкоцитарных взвесей определяют чистоту выхода лимфоцитов, которая составляет не менее 97%. 1 млн выделенных клеток используют для определения активностей Г6ФДГ и НАДН-ЛДГ в лимфоцитах одним из известных способов, например, биолюминесцентным [2]. Для этого в 150 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат и кофактор, вносят 50 мкл суспензии разрушенных лимфоцитов. Конкретные значения концентраций субстратов и кофакторов, а также рН среды для определяемых ферментов представлены в таблице 1.

Таблица 1
Фермент	Субстрат, мМ	Кофактор, мМ	РН буфера
Г6ФДГ	Глюкоза-6-фосфат - 1,5	НАДФ - 0,025	9,8
НАДН-ЛДГ	Пируват - 0,25	НАДН - 0,005	7,0
Примечание: среду с рН 9,8 готовят на Трис-HCl буфере (ICN Biomedicals Inc., США); с рН 7,0 - на К+, Nа+-фосфатном буфере (буфер готовят из К2НРО4 и NaH 2PO4 (Реахим, Россия)).

После инкубации исследуемых проб при 37°C в течение 30 минут для Г6ФДГ или 5 минут для НАДН-ЛДГ к 200 мкл инкубационной смеси добавляют 50 мкл флавинмононуклеотида (ФМН) в концентрации 1,5×10^-5 M, 50 мкл 0,0005% миристинового альдегида и 10 мкл ферментативной системы НАДН: ФМНоксидоредуктаза-люцифераза (все реактивы биолюминесцентной системы разводят в 0,1 M К⁺, Ка⁺-фосфатном буфере с рН 7,0). После смешивания биолюминесцентных реактивов и инкубационной пробы с помощью биохемилюминометра, например, марки "БЛМ-8803", измеряют свечение. Учитывая, что в клетках имеется определенное количество субстратов для течения различных метаболических реакций, в том числе и катализируемых исследуемыми ферментами, определяют показатели, условно названные "субстратный фон ферментов". Определение производят в тех же условиях, что и для вышеперечисленных дегидрогеназ, но в инкубационную смесь вместо соответствующего субстрата вносят буфер. В результате измерения свечения на биолюминометре получают относительные значения активности исследуемых ферментов. Чтобы получить абсолютные значения активности строят графики зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации НАДФН и НАДН (калибровочный график). Для этого 200 мкл стандартного раствора НАДФН или НАДН в диапазоне 10^-9-10^-4 M вносят в кюветы биолюминометра, содержащие ФМН, миристиновый альдегид и НАДФН: ФМНоксидоредуктазу-люциферазу в концентрациях, указанных выше, после чего производят измерение интенсивности биолюминесценции. В связи с широким диапазоном рН буферов, используемых для определения дегидрогеназной активности, а также рН-зависимостью биолюминесценции ферментативной системы из светящихся бактерий, калибровочные графики строят на основе соответствующего буфера. Активность ферментов рассчитывают по формуле А= [C]×V/T,

где A - активность дегидрогеназы, E на 1×10⁴ лимфоцитов (1E=1 мкмоль/мин [1]);

[C] - разница концентраций НАД(Ф)Н в пробах "фермент" и "фон фермента", мкмоль;

V - объем пробы, мл;

T - время инкубации, мин.

Затем рассчитывают соотношение активностей Г6ФДГ и НАДН-ЛДГ (Г6ФДГ/НАДН-ЛДГ). Значение полученного показателя, равное или более 1,15, свидетельствует о развитии обострения, а значение показателя менее 1,15 - об отсутствии обострения.

Данный способ апробирован на 34 подростках, больных ХГВ. Все больные подростки при поступлении в стационар и в динамике через 6 месяцев были обследованы с помощью общепринятых лабораторных методов обследования. Проведены: анализ периферической крови, биохимический анализ крови с определением концентрации общего билирубина и его фракций, тимоловой пробы, аланиновой трансаминазы (АЛТ), аспарагиновой трансаминазы (ACT) и щелочной фосфатазы. При помощи иммуноферментного анализа в сыворотке крови определяли специфические серологические маркеры HBsAg и анти-HBcIgG. С помощью метода полимеразно-цепной реакции у больных определяли ДНК вируса гепатита В. Активность Г6ФДГ и НАДН-ЛДГ в лимфоцитах крови подростков с ХГВ определяли с помощью биолюминесцентного метода.

По результатам биохимического анализа крови установлено, что у 22 детей и подростков в течение 6 месяцев не было обострения ХГВ (активность АЛТ и ACT были в пределах нормы), у 12 - в диапазоне от 3 недель до 6 месяцев развилось обострение ХГВ (при повторном обследовании обнаружено повышение активности трансаминаз в сыворотке крови).

У всех больных обнаружено совпадение прогноза, сделанного по предложенному способу (табл.2).

Таблица 2
Прогноз обострений ХГВ
№	Будет/не будет обострений	Показатель соотношения активностей Г6ФДГ и НАДН-ЛДГ
1	будет обострение	12,31
2	будет обострение	18,47
3	будет обострение	1,19
4	будет обострение	1,60
5	будет обострение	1,56
6	будет обострение	44,15
7	будет обострение	2,29
8	будет обострение	27,42
9	будет обострение	3,77
10	будет обострение	1,76
11	будет обострение	1,24
12	будет обострение	30,51
13	нет обострения	0,15
14	нет обострения	1,13
15	нет обострения	0,14
16	нет обострения	0,00
17	нет обострения	1,14
18	нет обострения	0,79
19	нет обострения	0,00
20	нет обострения	0,35
21	нет обострения	0,14
22	нет обострения	1,06
23	нет обострения	0,22
24	нет обострения	0,27
25	нет обострения	1,05
26	нет обострения	0,77
27	нет обострения	0,39
28	нет обострения	0,10
29	нет обострения	0,11
30	нет обострения	0,89
31	нет обострения	0,00
32	нет обострения	0,04
33	нет обострения	1,03
34	нет обострения	1,04

Клинический пример 1. Больная Б., 9 лет ( № истории болезни 128), находилась на плановом обследовании в детском инфекционном отделении МУЗ ГКБ № 20 им. И.С.Берзона г.Красноярска с диагнозом: хронический вирусный гепатит В, неактивный. Ребенок состоял на диспансерном учете в течение 3 лет в диспансерном кабинете гепатоцентра МУЗ ГКБ № 20 г.Красноярска. Из анамнеза известно, что мать девочки также больна хроническим вирусным гепатитом В. При поступлении в детское инфекционное отделение девочка жалоб не предъявляла.

Результаты биохимического исследования: билирубин общий 14,6 мкмоль/л, АЛТ 0,5 ммольхч/л (в пределах нормы), ACT 0,24 ммоль×ч/л (в пределах нормы).

При исследовании лимфоцитов периферической крови биолюминесцентным методом по предложенному способу обнаружено, что соотношение активностей Г6ФДГ и НАДН-ЛДГ составило 0,14 (пример № 15 из табл.2), что указывает на отсутствие обострения.

При амбулаторном обследовании больной в диспансерном кабинете гепатологического центра через 6 месяцев активность АЛТ и ACT была в пределах нормы.

Клинический пример 2. Больной Р., 16 лет ( № истории болезни 539), находился на лечении в детском инфекционном отделении МУЗ ГКБ № 20 им. И.С.Берзона г.Красноярска с диагнозом: хронический вирусный гепатит В с умеренной степенью активности. Из анамнеза известно, что ребенок получал переливание препаратов крови в возрасте 5 лет в связи с оперативным вмешательством. Ребенок состоит на диспансерном учете в течение 5 лет в диспансерном кабинете МУЗ ГКБ № 20 г.Красноярска. При плановом обследовании в диспансерном кабинете гепатоцентра выявлена гиперферментемия, и ребенок был направлен в стационар для уточнения характера поражения печени и решения вопроса о тактике лечения. При поступлении в стационар больной предъявлял жалобы на периодические боли в животе. Во время осмотра выявлено умеренное увеличение печени (1/3-2 см-2 см).

Результаты биохимического исследования: билирубин общий 11 мкмоль/л (норма до 20 мкмоль/л), АЛТ 1,6 ммольхч/л (выше нормы в 2,3 раза), ACT 0,99 ммоль×ч/л (немного выше нормы).

При исследовании лимфоцитов периферической крови по предложенному способу обнаружено, что соотношение активностей Г6ФДГ и НАДН-ЛДГ составило 1,13 (пример № 14 из табл.2), что указывает на отсутствие обострения.

В контрольном биохимическом анализе крови отмечалось снижение концентрации билирубина и нормализация показателей АЛТ и ACT. На 23 день пребывания в стационаре больной выписан.

При амбулаторном обследовании больного в диспансерном кабинете гепатоцентра через 6 месяцев активность АЛТ и ACT сохранялась на уровне нормальных показателей.

Клинический пример 3. Больной Д., 11 лет ( № истории болезни 438), находился на плановом обследовании в детском инфекционном отделении МУЗ ГКБ № 20 г.Красноярска с диагнозом: хронический вирусный гепатит В, с минимальной степенью активности. Больной наблюдается в течение 2 лет в диспансерном кабинете гепатоцентра МУЗ ГКБ № 20 г.Красноярска с диагнозом: хронический вирусный гепатит В. При плановом обследовании в диспансерном кабинете гепатоцентра выявлена гиперферментемия, и ребенок был направлен в стационар для уточнения характера поражения печени и решения вопроса о тактике лечения.

Результаты биохимического исследования: билирубин общий 13,4 мкмоль/л, АЛТ 0,76 ммоль×ч/л (выше нормы), ACT 0,39 ммоль×ч/л (в пределах нормы).

При исследовании лимфоцитов периферической крови по предложенному способу обнаружено, что соотношение активностей Г6ФДГ и НАДН-ЛДГ составило 18,47 (пример № 2 из табл.2), что указывает на развитие обострения.

На 16 день пребывания в стационаре больной выписан. Однако при амбулаторном обследовании в диспансерном кабинете гепатоцентра через 6 месяцев вновь отмечено увеличение активности АЛТ и ACT в 1,3 раза.

Клинический пример 4. Больной Б., 15 лет ( № истории болезни 108), находился на обследовании и лечении в детском инфекционном отделении МУЗ ГКБ № 20 г. Красноярска с диагнозом: хронический вирусный гепатит В с высокой степенью активности. Из анамнеза известно, что ребенок наблюдается с 2008 г. в диспансерном кабинете МУЗ ГКБ № 20 г.Красноярска с диагнозом: хронический вирусный гепатит B. При плановом обследовании у ребенка регистрировалось повышение активности АЛТ, и мальчик направлен в стационар.

Результаты биохимического исследования: билирубин общий 19,6 мкмоль/л, АЛТ 5,2 ммоль×ч/л (выше нормы в 7,7 раз), ACT 1,2 ммоль×ч/л (выше нормы в 2 раза).

При исследовании лимфоцитов периферической крови по предложенному способу обнаружено, что соотношение активностей Г6ФДГ и НАДН-ЛДГ составило 44,15 (пример № 6 из табл.2), что указывает на развитие обострения.

На 28 день пребывания в стационаре больной выписан. Однако при амбулаторном наблюдении больного в диспансерном кабинете через 6 месяцев вновь отмечено увеличение активности АЛТ и ACT в 1,6 раз.

Технический результат предлагаемого способа:

- возможность прогноза обострений ХГВ у подростков с клинико-биохимической ремиссией;

- однократный забор венозной крови;

- высокий уровень совпадения прогноза.

Предложенный способ позволяет корректировать план и тактику лечения больного на этапах динамического наблюдения и может быть рекомендован для применения в клинической практике.

Источники информации

1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - М.: Медицина, 1998. - 704 с.

2. Савченко А.А., Сунцова Л.Н. Высокочувствительное определение активности дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови человека биолюминесцентным методом // Лабораторное дело. - 1989. - № 11. - С.23-25.

3. Томилка Г.С., Медяников О.Ю. Способ прогнозирования обострений вирусных гепатитов // Патент РФ № 2188429 C2, G01N 33/68, G01N 33/84, БИПМ № 6, 27.02.2002.

4. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. - М.: Медицина, 2000. - 432 с.

5. Boyum A. Isolation of lymphocytes from blood and bone marroow // Scand. J. Clin. Lab. Invest - 1968. - Vol.21 (Suppl. 97). - P.77-80.

6. Jacobs S.R., Rathmell J.C. Lymphocyte selection by starvation: glucose metabolism and cell death // Trends Immunol. - 2006. - Vol.27, № 1. - P.4-7.