средство, стимулирующее продукцию гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора в клетках системы мононуклеарных фагоцитов

Формула изобретения

1. Средство, стимулирующее продукцию гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора в клетках системы мононуклеарных фагоцитов, отличающееся тем, что оно включает окисленный декстран средней молекулярной массы 35-65 кДа.

2. Средство по п.1, отличающееся тем, что оно дополнительно включает физиологически приемлемый растворитель.

3. Средство по п.2, отличающееся тем, что в качестве физиологически приемлемого растворителя оно включает воду для инъекций, физиологический или буферный раствор.

4. Средство по п.1, отличающееся тем, что оно дополнительно включает физиологически приемлемый растворитель и липосомообразующий агент.

5. Средство по п.4, отличающееся тем, что в качестве липосомообразующего агента оно включает лецитин.

6. Средство по п.1, отличающееся тем, что оно выполнено в виде раствора или нанолипосомальной эмульсии.

7. Средство по п.6, отличающееся тем, что оно выполнено в виде раствора окисленного декстрана в физиологически приемлемом растворителе в концентрации 1-5 мас.%.

8. Применение средства по любому из пп.1-7 путем его введения в культуру клеток системы мононуклеарных фагоцитов в количестве, содержащем 125-250 мкг окисленного декстрана на 1 мл культуральной среды.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, а именно к средствам иммунокоррекции, и может быть использовано в качестве индуктора гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора в клетках системы мононуклеарных фагоцитов in vitro и для эфферентной терапии при патологических состояниях, сопровождающихся снижением клеточного иммунитета.

Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) является гликопротеином и относится к одному из основных медиаторов иммунной системы. Он входит в группу цитокинов, которые продуцируются в живом организме в Т-лимфоцитах, эндотелиальных клетках, фибробластах, клетках системы мононуклеарных фагоцитов. По классификации ВОЗ все макрофаги объединены в систему мононуклеарных фагоцитов (СМФ), которая после лимфоидной системы является второй крупной популяцией клеток иммунной системы. СМФ включает происходящие из единой стволовой клетки костномозговые предшественники. Клетки СМФ являются универсальными участками иммунного ответа, они осуществляют опсонизацию и фагоцитоз антигенов, вырабатывают неспецифические факторы защиты, биологически активные вещества, регулируют агрегационные свойства крови и микроциркуляцию, осуществляют кооперацию иммунного ответа и его завершенность (1).

ГМ-КСФ стимулирует пролиферацию, дифференцировку и функцию гранулоцитов и моноцитов/макрофагов, которые образуют одну из важных систем защиты организма от бактерий, грибов, паразитов, опухолевых поражений, осуществляют фагоцитоз чужеродных агентов, секретируют биологически активные соединения, стимулируют иммунные процессы, регулируют продукцию цитокинов. При ряде заболеваний продукция ГМ-КСФ в организме снижена. В связи с этим для иммунокоррекции необходимо использовать индукторы ГМ-КСФ или синтетический (рекомбинантный) ГМ-КСФ.

Путем генной инженерии в последнее время удалось создать рекомбинантный человеческий ГМ-КСФ (коммерческие названия препарата - молграмостим, лейкомакс) (2). Рекомбинантный ГМ-КСФ используют при лейкопении и агранулоцитозе (при агранулоцитарной ангине, алиментарно-токсической алейкии, при отравлении рядом химических веществ, при лучевой болезни), при различных заболеваниях инфекционной этиологии, при различных онкологических и гранулематозных заболеваниях. Особенно широко рекомбинантный ГМ-КСФ используют в клинической практике при лечении онкологических больных, получающих химиотерапию (3, 4). Однако при неоднократном применении препараты рекомбинантного ГМ-КСФ нередко вызывают побочные эффекты: лихорадку, озноб, миалгию, потерю аппетита, сонливость и боль в костях (5, 6).

Известно средство, стимулирующее продукцию ГМ-КСФ в Т-лимфоцитах, включающее рекомбинантный TNF (фактор некроза опухолей) (7). Его недостатком является то, что при недостаточно эффективном отмывании культуры клеток он может индуцировать TNF-зависимый апоптоз клеток, стимулировать гранулемогенез при воспалительных процессах и другие нежелательные биологические эффекты, обусловленные этим фактором.

Известно средство, стимулирующее продукцию ГМ-КСФ в культуре клеток Т-лимфоцитов, включающее мурамилдипептид (МДП), являющийся минимальным компонентом клеточной стенки грамположительных бактерий (8). Недостатком известного средства является то, что оно обладает выраженными провоспалительными свойствами, а также является индуктором эндогенной продукции фактора некроза опухолей (TNF) в лимфоидных клетках, который может оказывать нежелательные побочные эффекты, указанные выше, т.е. обладает низкой биосовместимостью.

Наиболее близким к заявленному является средство, стимулирующее продукцию ГМ-КСФ в макрофагах, включающее N-ацетилглюкозаминил-1-4-N-ацетилмурамоил-L-аланил-D-изоглугамин, имеющий фармакопейное название ликопид и являющийся синтетическим производным мурамилдипептида (9). Хотя ликопид обладает меньшими побочными эффектами в сравнении с мурамилдипептидом (не вызывает повышение температуры тела), так как применяется преимущественно перорально, его недостатком также является способность вызывать провоспалительные реакции при парентеральном введении, так как по механизму влияния на иммунитет эти препараты практически идентичны. В связи с этим, ликопид также обладает низкой биосовместимостью при парентеральном пути введения, что значительно ограничивает возможности его использования для стимуляции иммунокомпетентных клеток in vitro с целью их последующего использования для эфферентных методов терапии.

Задачей настоящего изобретения является повышение биосовместимости средства.

Решение поставленной задачи достигается тем, что в качестве индуктора ГМ-КСФ используют окисленный декстран средней молекулярной массы 35-65 кДа; средство дополнительно содержит физиологически приемлемый растворитель или физиологически приемлемый растворитель и липосомообразующий агент; в качестве физиологически приемлемого растворителя оно включает воду для инъекций, физиологический или буферный раствор; в качестве липосомообразующего агента оно включает лецитин; средство может быть выполнено в виде раствора или нанолипосомальной эмульсии; средство может быть выполнено в виде раствора окисленного декстрана со средней молекулярной массой 35-65 кДа в физиологически приемлемых растворителях в концентрации 1-5 мас.%; средство применяют путем его введения в культуру клеток системы мононуклеарных фагоцитов в количестве, содержащем 125-250 мкг окисленного декстрана на 1 мл культуральной среды.

Описание сущности изобретения

Средство, стимулирующее продукцию гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора в клетках системы мононуклеарных фагоцитов, включает в качестве активного агента окисленный декстран средней молекулярной массы 35-65 кДа.

Средство может быть выполнено в виде раствора. В таком случае оно дополнительно включает физиологически приемлемый растворитель, например воду для инъекций или физиологический раствор или физиологически приемлемый буферный раствор, например фосфатный буфер pH 7.3-7.5, и др. Стимуляция ГМ-КСФ происходит при использовании раствора окисленного декстрана указанной средней молекулярной массы в физиологически приемлемом растворителе, в концентрации 1-5 мас.%.

Средство может быть выполнено в виде нанолипосомальной эмульсии. В таком случае оно дополнительно включает физиологически приемлемый растворитель и липосомообразующий агент. В качестве липосомообразующего агента может быть использован лецитин и другие физиологически приемлемые липосомообразующие агенты.

Окисленный декстран представляет собой декстран, содержащий карбонильные группы. Он может быть получен известными способами на основе химического или радиационного окисления декстрана. В частности, окисленный декстран может быть получен химическим путем, например путем выделения фракций декстрана из коммерческого препарата «Реополиглюкин», последующего окисления декстрана периодатом натрия и осаждения окисленного декстрана этанолом (10). Известны модификации данного метода, отличающиеся использованием дополнительных способов очистки окисленного декстрана от примесей (11-14). В качестве окислителя используют также перманганат калия (15).

Окисленный декстран может быть также получен путем облучения раствора коммерческого препарата «Реополиглюкин» тормозным гамма-излучением в дозах 2,5-3,5 Мрад на ускорителе электронов ЭЛВ-2 (16).

Стимуляцию продукции ГМ-КСФ в клетках СМФ с использованием заявленного средства осуществляют следующим образом.

Методом эксплантации клеток перитонеального транссудата мышей, например мышей линии BALB/c, в культуру получают первичную культуру перитонеальных макрофагов, содержащую в своем составе моноциты (1-2%). Перитонеальные клетки (моноциты/макрофаги) вносят в чашки Петри и культивируют на покровных стеклах в течение 3 часов в среде 199, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров. Через 3 часа первичную инкубационную среду сливают, адгезированные клетки (моноциты/ макрофаги) отмывают от неадгезированных клеток (неприлипающих к стеклу клеток - лимфоцитов и лаброцитов) двукратным ополоскиванием клеток в свежей среде 199, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров. После повторного отмывания клеточного монослоя, содержащего 98-99% макрофагов и 1-2% моноцитов, промывочную среду заменяют на свежую среду 199, содержащую 7% сыворотки эмбрионов коров и добавляют к ней заявляемое средство в виде раствора окисленного декстрана в физиологически приемлемом растворителе с концентрацией окисленного декстрана 1-5 мас.% или в виде нанолипосомальной эмульсии до конечной концентрации по окисленному декстрану 125-250 мкг на 1 мл культуральной среды. Клетки инкубируют при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО₂ в течение 24 часов. Через 24 часа культивирования проводят оценку продукции ГМ-КСФ в клетках СМФ (моноциты/макрофаги) при помощи иммуноцитохимического метода анализа с использованием компьютерной морфометрии следующим образом.

Для оценки продукции ГМ-КСФ в клетках СМФ используют двухэтапный иммуноцитохимический метод определения экспрессии цитокинов в клетках. Клетки фиксируют в 4% растворе формальдегида (в фосфатном буфере pH 7,3-7,5) в течение 10 мин, демаскировку антигенов проводят при инкубировании в 0,3% растворе тритона Х 100 (в фосфатном буфере pH 7,3-7,5) 2 мин. Далее препараты клеточных культур инкубируют с «первыми» антителами к ГМ-КСФ (Rat Anti-Mouse GM-CSF; Isotype: Rat IgG2a) во влажной камере (60 мин). Препараты, обработанные небиотинилированными крысиными антителами, дополнительно инкубируют с антикрысиными биотинилированными антителами овцы (biotin-conjugated goat anti-rat Ig specific polyclonal antibody) во влажной камере (30 мин). Препараты, инкубированные с биотинилированными антителами, инкубируют со стрептавидин-пероксидазным комплексом (30 мин). Далее окраску препаратов проводят в растворе диаминобензидина (DAB) с субстратом, содержащим Н₂O₂ (используют стандартный BD DAB Kit). Клетки отмывают от свободного DAB дистиллированной водой, препараты высушивают (60 мин), докрашивают водным 1% раствором метилового зеленого (15 мин). Все процедуры иммуноцитохимической окраски клеток проводят при комнатной температуре. Зоны клеточных мембран или цитоплазмы, содержащие ГМ-КСФ, окрашиваются в «специфический» темно-коричневый цвет. Интенсивность такой окраски прямо пропорциональна количеству экспрессируемого ГМ-КСФ. Стимуляцию продукции ГМ-КСФ в клетках СМФ (моноциты/макрофаги) оценивают по кратности увеличения количества клеток, продуцирующих ГМ-КСФ (индекс стимуляции ГМ-КСФ). Для оценки биосовместимости композиции используют индекс функциональной активности клеток СМФ (% распластанных форм) и индекс жизнеспособности (% жизнеспособных клеток).

После инкубации клеток в среде для культивирования с добавлением заявляемого средства в культуре возрастает количество макрофагов, продуцирующих ГМ-КСФ, в 8-10 раз по сравнению с контролем (моноциты/макрофаги, культивируемые в среде без добавления заявляемого средства).

Определяющим существенным отличием заявляемого средства от прототипа является то, что оно обладает более высокой биосовместимостью. Результаты сравнительной оценки заявляемого средства и прототипа по критерию биосовместимости (индекс функциональной активности клеток и индекс жизнеспособности) приведены в таблице. Биосовместимость заявленного средства продемонстрирована на примере раствора окисленного декстрана средней молекулярной массы 35 кДа в воде для инъекций, в концентрации 1 мас.% при различных количествах его введения в культуру клеток.

Как видно из данных, представленных в таблице, заявляемое средство в отличие от прототипа при добавлении в культуру клеток в диапазоне 125-250 мкг на 1 мл культуральной среды обладает более высокой биосовместимостью, что подтверждается более низким торможением распластывания макрофагов и более высоким процентом жизнеспособных клеток.

Таким образом, заявляемое средство обладает способностью стимулировать продукцию ГМ-КСФ в культуре клеток СМФ (макрофаги/моноциты) в сочетании с высокой биосовместимостью.

ПРИМЕРЫ КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

Пример 1.

В качестве средства, стимулирующего ГМ-КСФ, использован раствор, содержащий 1 мас.% окисленного декстрана со средней молекулярной массой 35 кДа и 99 мас.% 0,05 М фосфатного буферного раствора, pH 7,4.

Методом эксплантации клеток перитонеального транссудата мышей линии BALB/c в культуру получают первичную культуру перитонеальных макрофагов, содержащую в своем составе моноциты (1-2%). Перитонеальные клетки вносят в чашки Петри и культивируют на покровных стеклах в течение 3 часов в среде 199, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров. Через 3 часа первичную инкубационную среду сливают, адгезированные клетки (моноциты/макрофаги) отмывают от неадгезированных клеток («неприлипающих к стеклу клеток - лимфоцитов и лаброцитов) двукратным ополоскиванием клеток в свежей среде 199, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров. После повторного отмывания клеточного монослоя, содержащего 98-99% макрофагов и 1-2% моноцитов, промывочную среду заменяют на свежую среду 199, содержащую 7% сыворотки эмбрионов коров и добавляют к ней заявляемое средство в виде раствора с концентрацией 1 мас.% до конечной концентрации по окисленному декстрану 125 мкг на 1 мл культуральной среды. Клетки инкубируют при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 5% СO₂ , в течение 24 часов. Через 24 часа культивирования проводят оценку индекса стимуляции продукции ГМ-КСФ в клетках СМФ при помощи иммуноцитохимического метода анализа с использованием компьютерной морфометрии. Индекс стимуляции ГМ-КСФ составляет 8,1. Оценка биосовместимости: индекс функциональной активности клеток - 62%, индекс жизнеспособности - 100%.

Пример 2.

В качестве средства, стимулирующего ГМ-КСФ, использован раствор, содержащий 2,5 мас.% окисленного декстрана со средней молекулярной массой 65 кДа и 97,5 мас.% физиологического раствора.

Методом эксплантации клеток перитонеального транссудата мышей линии BALB/c в культуру получают первичную культуру перитонеальных макрофагов, содержащую в своем составе моноциты (1-2%). Перитонеальные клетки вносят в чашки Петри и культивируют на покровных стеклах в течение 3 часов в среде 199, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров. Через 3 часа первичную инкубационную среду сливают, адгезированные клетки (моноциты/макрофаги) отмывают от неадгезированных клеток (неприлипающих к стеклу клеток - лимфоцитов и лаброцитов) двукратным ополоскиванием клеток в свежей среде 199, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров. После повторного отмывания клеточного монослоя, содержащего 98-99% макрофагов и 1-2% моноцитов, промывочную среду заменяют на свежую среду 199, содержащую 7% сыворотки эмбрионов коров и добавляют к ней заявляемое средство в виде раствора с концентрацией 2,5 мас.% до конечной концентрации по окисленному декстрану 200 мкг на 1 мл культуральной среды. Клетки инкубируют при температуре 37° в атмосфере, содержащей 5% CO₂ , в течение 24 часов. Через 24 часа культивирования проводят оценку индекса стимуляции продукции ГМ-КСФ в клетках СМФ при помощи иммуноцитохимического метода анализа с использованием компьютерной морфометрии. Индекс стимуляции ГМ-КСФ составляет 9,8. Оценка биосовместимости: индекс функциональной активности клеток - 74%, индекс жизнеспособности - 100%.

Пример 3.

В качестве средства, стимулирующего ГМ-КСФ, использовали раствор, содержащий 5 мас.% окисленного декстрана со средней молекулярной массой 35 кДа и 95 мас.% воды для инъекций.

Методом эксплантации клеток перитонеального транссудата мышей линии BALB/c в культуру получают первичную культуру перитонеальных макрофагов, содержащую в своем составе моноциты (1-2%). Перитонеальные клетки вносят в чашки Петри и культивируют на покровных стеклах в течение 3 часов в среде 199, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров. Через 3 часа первичную инкубационную среду сливают, адгезированные клетки (моноциты/макрофаги) отмывают от неадгезированных клеток (неприлипающих к стеклу клеток - лимфоцитов и лаброцитов) двукратным ополоскиванием клеток в свежей среде 199, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров. После повторного отмывания клеточного монослоя, содержащего 98-99% макрофагов и 1-2% моноцитов, промывочную среду заменяют на свежую среду 199, содержащую 7% сыворотки эмбрионов коров и добавляют к ней заявляемое средство в виде раствора с концентрацией 5 мас.% до конечной концентрации по окисленному декстрану 250 мкг на 1 мл культуральной среды. Клетки инкубируют при температуре 37° в атмосфере, содержащей 5% СO₂, в течение 24 часов. Через 24 часа культивирования проводят оценку индекса стимуляции продукции ГМ-КСФ в клетках СМФ при помощи иммуноцитохимического метода анализа с использованием компьютерной морфометрии. Индекс стимуляции ГМ-КСФ составляет 10,0. Оценка биосовместимости: индекс функциональной активности клеток - 81%, индекс жизнеспособности - 100%.

Пример 4.

В качестве средства, стимулирующего ГМ-КСФ, использовали окисленный декстран средней молекулярной массы 65 кДа, заключенный в нанолипосомальную эмульсию.

Для получение нанолипосомальной эмульсии 4,0 г окисленного декстрана со средней молекулярной массой 65 кДа растворяют в 95,0 мл 0,85% растворе хлорида натрия. В полученный раствор вносят 1,0 г липосомообразующего агента (лецитина) и смесь выдерживают 24-36 часов при 4-8°С, после чего суспендируют и многократно пропускают через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. В результате получают нанолипосомальную эмульсию с размером нанолипосом в диапазоне 250-450 нм, содержащую 4 мас.% окисленного декстрана.

Методом эксплантации клеток перитонеального транссудата мышей линии BALB/c в культуру получают первичную культуру перитонеальных макрофагов, содержащую в своем составе моноциты (1-2%). Перитонеальные клетки вносят в чашки Петри и культивируют на покровных стеклах в течение 3 часов в среде 199, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров. Через 3 часа первичную инкубационную среду сливают, адгезированные клетки (моноциты/макрофаги) отмывают от неадгезированных клеток (неприлипающих к стеклу клеток - лимфоцитов и лаброцитов) двукратным ополоскиванием клеток в свежей среде 199, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров. После повторного отмывания клеточного монослоя, содержащего 98-99% макрофагов и 1-2% моноцитов, промывочную среду заменяют на свежую среду 199, содержащую 7% сыворотки эмбрионов коров и добавляют к ней заявляемое средство в виде нанолипосомальной эмульсии до конечной концентрации по окисленному декстрану 200 мкг на 1 мл культуральной среды. Клетки инкубируют при температуре 37° в атмосфере, содержащей 5% СО₂, в течение 24 часов. Через 24 часа культивирования проводят оценку индекса стимуляции продукции ГМ-КСФ в клетках СМФ при помощи иммуноцитохимического метода анализа с использованием компьютерной морфометрии. Индекс стимуляции ГМ-КСФ составляет 9,0. Оценка биосовместимости: индекс функциональной активности клеток - 82%, индекс жизнеспособности - 100%.

Список использованных источников информации

1. Ricardo S., Van Goor H. Eddy A. Macrophage diversity in renal injury and repair // J. Clin. Invest. 2008. Vol.18. № 11. P.3522-3530.

2. Новиков Д.К., Сергеев Ю.В., Новикова В.И. Характеристика иммунофармакотерапевтических препаратов // Иммунопатология, иммунология, аллергология. - 2002. - № 4. - С.7-27.

3. Пинегин Б.Ф., Андронова Т.М., Карсонова М.И. Препараты мурамилдипептидового ряда - иммунотропные лекарственные средства нового поколения // Int. J. Immunorehabilitation. - 1997. - № 6. - P.27-34.

4. Попович A.M. Иммунотерапия в онкологии. Справочник по иммунотерапии для практического врача. СПб: изд-во "Диалог", 2002. С.335-352.

5. Лазарева Д.Н., Сакаева Д.Д., Муфазалова Н.А., Бакиров А.Б. Иммуностимуляторы в онкологии // Рациональное использование лекарств: Материалы Российской научно-практической конференции (10-12 марта 2004 года, Пермь). - Пермь, 2004. Ч.2. С.18-23.

6. Новиков Д.К., Новикова В.И., Сергеев Ю.В. Иммунотерапия, иммунокоррекция и иммунореабилитация // Иммунопатология, иммунология, аллергология. - 2002. - № 3. - С.7-17.

7. Aggarwal В., Pocsik E. Cytokines: from clone to clinic // Arch. Biochem. Biophys., 1992, v.292, P.335-345.

8. Kerns H.M.M., Jutila M.A., Hedges J.F. The distinct response of Т cells to the Nod2 agonist muramyl dipeptide // Cell Immunol. 2009. V.257. N.1-2. P.38-43.

9. Пинегин Б.В., Андронова Т.М. Некоторые теоретические и практические вопросы клинического применения иммуномодулятора ликопида // Иммунология. 1998. № 4. С.60-63.

10. Патент на изобретение РФ № 2087146. Способ лечения генерализованного туберкулезного процесса в эксперименте. Дата публикации 20.08.1997. МПК А61К 31/455, А61К 31/70.

11. Патент на изобретение РФ № 2163120. Конъюгат изониазид-декстран и его применение в качестве противотуберкулезного препарата. Дата публикации 20.02.2001. МПК А61К 31/455, А61К 31/721.

12. Патент на изобретение РФ № 2168994. Средство для лечения туберкулеза с низкой гепатотоксичностью. Дата публикации 20.06.2001. МПК А61К 31/455, А61К 31/70.

13. Патент на изобретение РФ № 2185166. Средство для лечения туберкулеза с низким уровнем фибротических осложнений. Дата публикации 20.07.2002. МПК А61К 31/455, А61К 31/721, А61Р 31/06.

14. Патент на изобретение РФ № 2125451. Способ получения конъюгата изониазид-декстран. Дата публикации 27.01.1999. МПК А61К 31/715, А61К 31/455.

15. Евразийский патент на изобретение № 011718. Способ получения диальдегиддекстрана. Дата публикации 28.04.2009. МПК С08В 37/02.

16. Патент на изобретение РФ № 2143900. Способ получения изониазида пролонгированного действия. Дата публикации 10.01.2000. МПК А61К 31/455, А61К 47/48.

Таблица
Сравнительный анализ индекса стимуляции ГМ-КСФ, индекса функциональной активности клеток СМФ (моноциты/макрофаги) и их жизнеспособности при использовании в качестве индуктора ГМ-КСФ ликопида и раствора окисленного декстрана в диапазоне различных концентраций
Концентрация индуктора ГМ-КСФ в культуре мкг на 1 мл культуральной среды	Индуктор ГМ-КСФ
Ликопид	Раствор окисленного декстрана средней молекулярной массы 35 кДа в воде для инъекций, концентрация раствора 1 мас.%
Индекс стимуляции ГМ-КСФ	Индекс функциональной активности клеток (% распластанных форм)	Индекс жизнеспособности (% жизнеспособных клеток)	Индекс стимуляции ГМ-КСФ	Индекс функциональной активности клеток (% распластанных форм)	Индекс жизнеспособности (% жизнеспособных клеток)
2	4	30	90	2	20	100
10	8	40	80	3	40	100
125	0	0	0	8	60	100
250	0	0	0	10	80	100