способ приготовления суспензии эритроцитов для определения деформируемости эритроцитарных мембран

Формула изобретения

Способ приготовления суспензии эритроцитов для определения деформируемости эритроцитарных мембран, включающий забор венозной крови, проведение отмывки эритроцитов и ресуспензирование, отличающийся тем, что производят 3-кратную отмывку эритроцитов, каждую отмывку осуществляют в рефрижераторной центрифуге при скорости 2700 об/мин в течение 8 мин, при температуре 36,6°C в растворе низкой ионной силы Liss с pH 7,4, при этом в процессе второй отмывки эритроцитов в отличающийся раствор Liss добавляют трипсин в концентрации 2 мг/мл, при третьей отмывке эритроцитов происходит удаление трипсина, причем после каждой проведенной отмывки эритроцитов удаляют надосадочную жидкость и вновь добавляют на каждые 1,0 мл суспензии эритроцитов 5,0 мл раствора Liss, а после третьей отмывки 0,1 мл отмытых эритроцитов ресуспензируют в 1,9 мл раствора Liss.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для регистрации способности эритроцитов крови к деформации, степени сохранности донорских эритроцитов, а также для определения воздействия лекарственных препаратов на клеточную стенку эритроцитов.

Известен способ приготовления эритроцитарной массы, обедненной лейкоцитами и тромбоцитами, включающий отмывание эритоцитов с помощью отмывающего раствора (Руководство по военной трансфузиологии. Министерство обороны Российской Федерации, Главное военно-медицинское управление. М., 2005, с. 59-60).

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ приготовления эритроцитарной взвеси путем отмывания эритроцитов с целью удаления из эритроцитарной среды основной части лейкоцитов, тромбоцитов, что существенно улучшает условия хранения эритроцитов, снижается мембранотропное (гемолитическое) действие протеолитических ферментов, освобождающихся из быстро разрушающихся лейкоцитов.

Отмытую эритроцитарную массу, полученную после центрифугирования крови, удаления плазмы, повторно отмывают изотоническим раствором натрия хлорида (0,9 % р-ра NaCl) (Ю.Л.Шевченко, В.Н.Шаболин, М.Ф.Заривчацкий, Е.А.Селиванов. Руководство по общей и клинической трансфузиологии. Санкт-Петербург, Фолиант, 2003, с. 134-136).

Не умаляя достоинств известного способа, принятого за прототип, следует отметить недостаточную отмывку адсорбированных на мембранах белков, которые влияют на истинную деформируемость мембран клеток, а также высокий риск быстрого образования эхиноцитов при инкубации в физиологическом растворе без стандартизации pH и температурного режима. Кроме того, указанная в прототипе 60-70% суспензия отмытых эритроцитов не может быть использована для определения деформируемости мембран, так как для этого необходима 5-10% суспензия отмытых эритроцитов.

Техническим результатом, на достижение которого направлено создание данного изобретения, является повышение эффективности способа приготовления суспензии эритроцитов с минимально измененными мембранами для определения деформируемости последних.

Поставленный технический результат достигается тем, что в способе приготовления суспензии для определения деформируемости эритроцитарных мембран, включающем забор крови, проведение отмывки эритроцитов и ресуспензирование, производят 3-кратную отмывку эритроцитов. Каждую отмывку осуществляют в рефрижераторной центрифуге при скорости 2700 об/мин в течение 8 минут, при температуре 36,6°C в растворе низкой ионной силы Liss с pH 7,4. При этом в процессе второй отмывки эритроцитов в отличающийся раствор Liss добавляют трипсин в концентрации 2 мг/мл. При третьей отмывке эритроцитов происходит удаление трипсина, причем после каждой проведенной отмывки эритроцитов удаляют надосадочную жидкость и вновь добавляют на каждые 1,0 мл суспензии эритроцитов 5,0 мл раствора Liss, а после третьей отмывки 0,1 мл отмытых эритроцитов ресуспензируют в 1,9 мл раствора Liss.

Способ приготовления суспензии эритроцитов осуществляют следующим образом.

У пациента, в положении сидя, спустя 10-12 часов после приема пищи, при его минимальной физической активности производят взятие крови путем проведения пункции локтевой вены, а жгут накладывают не более чем на одну-две минуты, чем обеспечивается минимальный стаз, при котором не повреждаются клетки крови.

Забранную венозную кровь в количестве 5,0 мл помещают в пробирку с антикоагулянтом этилендиаминтетраацетатом (К₂ЭДТА) 7,2 мг, которую помещают в рефрижераторную центрифугу. Затем кровь 3-кратно центрифугируют в течение 8 минут при температуре 36,6°С и при скорости центрифуги 2700 об/мин.

Проводя 3-кратную отмывку эритроцитов в рефрижераторной центрифуге в отмывающем растворе низкой ионной силы Liss (Low Ionic Strength Solution) с pH 7,4, тщательно удаляют плазму с верхним слоем эритроцитарной суспензии с целью исключения попадания других форменных элементов крови.

При этом соотношение эритроцитов и отмывающего раствора Liss составляет 1:5.

В процессе второй отмывки эритроцитов в рефрижераторной центрифуге добавляют в отмывающий раствор Liss трипсин в концентрации 2 мг/мл.

При этом после каждой проведенной отмывки эритроцитов удаляют надосадочную жидкость и вновь добавляют на каждые 1,0 мл суспензии эритроцитов 5,0 мл отмывающего раствора низкой ионной силы Liss.

После третьей отмывки 0,1 мл отмытые эритроциты ресуспензируют в 1,9 мл раствора Liss и используют для определения деформируемости эритроцитарной мембраны с помощью установки «лазерный пинцет».