способ повышения специфичности обратной транскрипции

Формула изобретения

1. Способ повышения специфичности обратной транскрипции, включающий приготовление образца, предположительно содержащего целевую РНК-мишень и хотя бы один вид РНК, отличной от мишени, предварительную обработку указанного образца ферментом для снижения в нем содержания примесей нецелевых полинуклеотидов, осуществление обратной транскрипции всей РНК-мишени или ее части и анализ продуктов обратной транскрипции, отличающийся тем, что предварительная обработка образца предусматривает отжиг с мишень-специфичным защитным олигонуклеотидом, инкубацию с полинуклеотидфосфорилазой Thermus thermophilus (Tth ПНФазой) и инактивацию Tth ПНФазы, причем выбирают защитный олигонуклеотид, способный гибридизоваться с мишенью таким образом, что его 5'-конец находится не далее 8 нуклеотидов с 5'-стороны от 3'-конца защищаемого участка мишени, и образующий с мишенью гибрид, стабильный в условиях инкубации; инкубацию осуществляют при температуре 60-75°С и микромолярной (физиологической) концентрации магния, используя оптимальную для существенной деградации незащищенной и существенной сохранности защищенной РНК комбинацию концентрации фермента, концентрации фосфата и времени реакции, а обратную транскрипцию проводят с полученной на стадии предварительной обработки реакционной смесью без проведения ее дополнительной очистки.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что анализ продуктов обратной транскрипции включает их размножение с использованием бесклеточной ферментативной системы.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве бесклеточной ферментативной системы используют полимеразную цепную реакцию.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что защитный олигонуклеотид модифицируют с целью повышения стабильности его гибрида с РНК-мишенью.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что защитный олигонуклеотид модифицируют путем замены хотя бы одного из его нуклеотидов на LNA-аналог.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии, а именно к способам обнаружения специфических РНК-мишеней.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Одним из направлений молекулярной диагностики является размножение искомой молекулярной мишени с помощью подходящей бесклеточной ферментативной системы экспоненциального размножения полинуклеотидов. Как правило, для размножения специфических РНК-мишеней (например, вирусных РНК или определенных клеточных мРНК) осуществляют синтез комплементарных ДНК (кДНК) с помощью обратной транскриптазы (РНК-зависимой ДНК-полимеразы) и праймеров, способных гибридизоваться с искомыми мишенями с 3'-стороны от копируемого участка. В качестве праймеров можно использовать, например, специфические праймеры (то есть, олигонуклеотиды, комплементарные уникальным участкам копируемых мишеней), смесь случайных олигонуклеотидов (например, гексануклеотидов) или олиго(dT), если РНК-мишень содержит поли(А)-последовательность на 3'-конце. Полученную кДНК размножают до детектируемых количеств с использованием полимеразной цепной реакции (ПНР [1]) или одной из многочисленных изотермических систем размножения, таких как 3SR (Self-Sustained Sequence Replication [2]), SDA (Strand Displacement Amplification [3]), NASBA (nucleic acid sequence-based amplification [4]), RCA (rolling circle amplification [5, 6]) и LAMP (loop-mediated isothermal DNA amplification [7]). Термин "система размножения" означает полный набор реагентов и иных компонентов, необходимых для синтеза нуклеиновых кислот на определенного вида матрицах (мишенях), в том числе один или более ферментов, включающих по крайней мере одну полимеразу нуклеиновых кислот; субстраты полимеризации (рибо- и/или 2'-дезоксирибонуклеозидтрифосфаты); реакционный буфер; а также мишень-специфичные олигонуклеотидные праймеры, если синтез нуклеиновых кислот осуществляют с помощью праймер-зависимой полимеразы. Теоретически, с использованием такого подхода можно обнаружить единичные молекулы РНК данного вида. Однако на практике, при анализе клинических образцов, содержащих большое количество посторонних (отличных от мишени) нуклеиновых кислот, чувствительность оказывается в 100-1000 раз ниже вследствие неспецифического синтеза ДНК, происходящего из-за ограниченной специфичности гибридизации праймеров как на стадии обратной транскрипции, так и при последующем размножении кДНК. Размножение посторонних нуклеиновых кислот приводит также и к снижению специфичности диагностики, что в большой степени обесценивает результат анализа [8].

В технике известны различные способы понижения уровня неспецифического синтеза ДНК при определении РНК-мишеней.

Прежде всего, это снижение содержания ДНК в препарате РНК, используемом для обратной транскрипции. С этой целью используют методы выделения РНК, позволяющие удалить из препарата большую часть ДНК, такие как метод Хомчинского [9]. От остатков ДНК освобождаются, обрабатывая полученный препарат дезоксирибонуклеазой [10, 11]. Однако такая обработка не освобождает образец от многочисленных РНК, содержание которых может быть в миллионы и миллиарды раз больше, чем содержание искомой мишени.

Обогатить препарат РНК анализируемой мишенью можно с помощью аффинной очистки на носителях с иммобилизованным олиго(dT) (олиготимидилатом) [12]. Это позволяет выделить РНК, несущие поли(А)-последовательность на 3'-конце и, тем самым, освободиться от рибосомных РНК и тРНК, составляющих более 90% от суммарного препарата клеточной РНК. Однако осуществление этой стадии приводит к удорожанию процедуры анализа и связано с риском перекрестного загрязнения образцов. Кроме того, препарат оказывается загрязненным олиго(dT), который участвует в обратной транскрипции наряду со специфическим праймером [13].

Аналогичного результата можно добиться более простым способом, осуществляя обратную транскрипцию с использованием олиго(dT)-праймера [14], так как в этом случае исключается копирование РНК, лишенных поли(А)-последовательности (в частности, рибосомных РНК и тРНК). Однако у такого способа есть следующие недостатки. (1) Продуктом обратной транскрипции является сумма разнородных кДНК, из которых искомая кДНК составляет ничтожную часть. (2) Часть потенциальных РНК-мишеней лишены поли(А)-последовательности и не будут представлены в продуктах обратной транскрипции [15]. (3) Возможен синтез укороченных кДНК из-за гибридизации праймера с внутренними поли(А)-последовательностями [16].

Повысить специфичность обратной транскрипции можно используя термостабильные обратные транскриптазы и осуществляя обратную транскрипцию при повышенной температуре с целью разрушения гибридов праймера с посторонними РНК, обладающих меньшей стабильностью, чем совершенный гибрид с РНК-мишенью. Например, используя обратные транскриптазы, продаваемые фирмой Invitrogen (США) под торговыми марками Superscript и ThermoScript , можно осуществлять обратную транскрипцию при температуре 50 и 65°С, соответственно. Однако и в этом случае не удается полностью исключить гибридизацию праймера с посторонними матрицами и, следовательно, неспецифический синтез ДНК.

Из вышеизложенного следует, что существует потребность в усовершенствованных способах повышения специфичности размножения РНК-мишеней. Настоящее изобретение направлено на решение данной задачи посредством избирательной деградации РНК, отличных от искомой мишени.

Наиболее близким аналогом (прототипом) данного изобретения является вышеупомянутый способ удаления примесей ДНК из препаратов РНК с помощью дезоксирибонуклеазы [10].

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Указанная техническая задача повышения специфичности обратной транскрипции реализуется посредством нового способа избирательной деградации РНК с использованием препарата полинуклеотидфосфорилазы (ПНФазы), практически свободного от эндонуклеазной и гидролазной активностей.

Одним из аспектов изобретения является то, что до начала проведения обратной транскрипции образец, который содержит хотя бы один вид подлежащей обратной транскрипции РНК (мишени) и хотя бы один вид РНК, отличной от мишени, отжигают хотя бы с одним защитным олигонуклеотидом для защиты РНК мишени от действия полинуклеотидфосфорилазы (ПНФазы). При этом олигонуклеотид гибридизуют с соответствующей РНК-мишенью на 3'-стороне от участка, подлежащего обратной транскрипции. Обработанный образец инкубируют в растворе, содержащем термостабильную ПНФазу, ее косубстрат и кофактор, при таких значениях температуры, времени инкубации, концентрации ПНФазы, косубстрата и кофактора, которые обеспечивают существенно полную сохранность защищенных РНК-мишеней и существенно полную деградацию РНК, отличных от мишеней. При этом в качестве ПНФазы используют, например, ПНФазу Thermus thermophilus.

Другой аспект изобретения состоит в том, что защитный олигонуклеотид модифицируют с целью повышения стабильности его гибрида с РНК-мишенью. Модификацию олигонуклеотида осуществляют, например, путем замены хотя бы одного из его нуклеотидов на LNA-аналог.

Другим аспектом изобретения является то, что продукты обратной транскрипции размножают с использованием бесклеточной ферментативной системы экспоненциального размножения полинуклеотидов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг.1 демонстрирует зависимость фосфоролиза РНК Tth-ПНФазой от температуры.

Фиг.2 демонстрирует селективность и полноту деградации незащищенной РНК Tth-ПНФазой.

Фиг.3 демонстрирует защитный эффект олигонуклеотида, гибридизованного к внутреннему участку РНК, на ее деградацию Tth-ПНФазой.

Фиг.4 демонстрирует последовательность, защищаемую от Tth-ПНФазы олигонуклеотидом, гибридизованным к внутреннему участку РНК.

Фиг.5 демонстрирует эффективную защиту РНК олигонуклеотидом, содержащим LNA-модификации.

Фиг.6 демонстрирует кинетику и избирательность деградации Tth-ПНФазой незащищенной высокомолекулярной РНК.

Фиг.7 демонстрирует повышение специфичности ОТ-ПЦР защищенной РНК в результате обработки препарата РНК Tth-ПНФазой перед стадией обратной транскрипции.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕРМИНОВ

Термин «полинуклеотидфосфорилаза» («ПНФаза») используется здесь для обозначения 3' 5' экзорибонуклеазы, способной катализировать реакцию фосфоролиза полирибонуклеотида, отщепляя нуклеотиды от его 3'-конца, независимо от того, способен ли этот фермент также катализировать реакцию фосфоролиза поли-2'-дезоксирибонуклеотида или иного типа нуклеотидной последовательности.

Термин «LNA-аналог нуклеотида» используется здесь для обозначения нуклеотида, рибозное кольцо которого зафиксировано в 3'-эндо-конфигурации путем введения 2'-O, 4'-С-метиленового мостика.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Полинуклеотидфосфорилаза (ПНФаза) - это 3' 5' экзорибонуклеаза, осуществляющая обратимый фосфоролиз полирибонуклеотида (pN)_n с 3'-конца в соответствии с уравнением: (pN)_n+P_i (pN)_n-1+ppN, где P_i - неорганический ортофосфат (косубстрат фосфоролиза), а ppN - нуклеозид-5'-дифосфат [17]. Для функционирования ПНФазы необходимы кофакторы - ионы Mg²⁺, которые могут быть заменены другими двухвалентными катионами, такими как Со²⁺, Ni²⁺, Cd ²⁺, Cu²⁺ и Zn²⁺, но не Са²⁺ . Вместо P_i в качестве косубстрата ПНФаза может использовать арсенат. В этом случае реакция становится практически необратимой, так как образующиеся нуклеозид-5'-фосфориларсенаты спонтанно гидролизуются до нуклеозидмонофосфатов и арсената [18].

ПНФаза была обнаружена во всех типах бактерий [18], за исключением микоплазмы [19]. Хотя последовательностей, кодирующих ПНФазу, нет в геномах архей и дрожжей, изученных к настоящему времени (эти геномы, тем не менее, содержат гены похожего фермента - РНКазы РН), они присутствуют в высших эукариотах [20-22]. ПНФазы растений и животных кодируются ядерными генами, но локализуются, главным образом, в органеллах [23]. В растениях есть два вида ПНФазы, один из которых локализован в хлоропластах, а другой - в митохондриях [20, 24].

Ген ПНФазы (pnp) кодирует полипептид массой 75-100 кДа, состоящий из пяти эволюционно консервативных доменов: двух N-концевых «коровых» доменов, гомологичных РНКазе РН Е.coli, разделенных -спиральным доменом, и двух С-концевых РНК-связывающих доменов - КН и S1 [19-23, 25]. РНКаза РН, как и ПНФаза, представляет собой фосфоролитическую 3' 5' экзорибонуклеазу. В клетках Е.coli РНКаза РН ответственна за процессинг 3'-концов молекул предшественников тРНК [26]. Домен КН («K-homology») был исходно идентифицирован в РНК-связывающем белке К человека [27], а домен S1 назван так из-за гомологии с РНК-связывающим белком S1 рибосом Е.coli [28]. Молекулы ПНФаз бактерий Е.coli и Streptomyces antibioticus состоят из трех идентичных субъединиц, которые образуют структуру в виде бублика с отверстием в центре, где может помещаться цепь РНК [25, 29], а ПНФаза хлоропластов состоит из двух таких бубликов, положенных один на другой [20, 30].

В дрожжах и археях функциональными и структурными аналогами ПНФазы являются экзосомы. Экзосомы состоят из субъединиц, являющихся гомологами доменов ПНФазы, и выполняют такие же функции, катализируя обратимый фосфоролиз полирибонуклеотидов. Поэтому экзосома может быть рассмотрена как разновидность ПНФазы. В пользу этого говорит также то, что трехмерные структуры бактериальной ПНФазы [25] и РНКазы РН, составляющей «кор» (основу) архейной экзосомы [31], высоко гомологичны [32].

Настоящее изобретение основано на результатах работы по клонированию гена Tth-ПНФазы, его экспрессии в клетках Е.coli и изучению биохимических свойств выделенного фермента [33, 34]. Фермент выделяли как описано в источнике [33]. В процессе исследования биохимических свойств выделенного фермента неожиданно было установлено, что выделенная Tth-ПНФаза явилась первой очищенной термостабильной ПНФазой, способной к осуществлению реакции фосфоролиза полирибонуклеотидов.

В присутствии 40 мкМ Mg ²⁺ оптимальная температура фосфоролиза составляет 65°С, тогда как в отсутствие ПНФазы РНК остается практически целой даже при 85°С (фиг.1). Фиг.1 также демонстрирует, что рабочий диапазон температур, в котором Tth-ПНФаза проявляет существенную фосфорилазную активность, составляет 60-75°С. Это выше, чем максимальная температура, при которой проявляют фосфорилазную активность мезофильные ПНФазы, такие как ПНФаза Е.coli, - 55°С [18].

С помощью ОТ-ПЦР (обратной транскрипции и последующей ПЦР) установлено, что в оптимальных условиях (температура, концентрации Mg²⁺ и EDTA, соотношение фермента к РНК, время реакции) Tth-ПНФаза разрушает более 99% высокоструктурированной РНК, не повреждая РНК, 3'-конец которой защищен комплементарным олигодезоксирибонуклеотидом (фиг.2А). Этот результат указывает на то, что олигонуклеотид, гибридизованный с 3'-концом РНК, мог бы селективно защищать ее от Tth-ПНФазы. Следующий эксперимент (фиг.2Б) демонстрирует, что это действительно так. В этом эксперименте смесь двух видов РНК - 5'- и 3'-фрагментов RQ135 РНК [35, 36] - отожгли с олигодезоксирибонуклеотидом, комплементарным 3'-концу 3'-фрагмента. Последующий фосфоролиз с Tth-ПНФазой привел к полной деградации 5'-фрагмента и получению практически чистого 3'-фрагмента (если не считать сам олигонуклеотид, который можно удалить разными способами, например, с помощью хроматографии, электрофореза или обработки ДНКазой).

На фиг.3 представлены результаты деградации трех РНК, имеющих одинаковую 5'-концевую часть, но в разной мере удлиненных на 3'-конце. Все три РНК подвергли фосфоролизу Tth-ПНФазой после отжига в присутствии или в отсутствие 38-нт олигодезоксирибонуклеотида, комплементарного 3'-концевой последовательности наиболее короткой РНК («SmaI») и внутренним последовательностям более длинных РНК («EcoRI» и «PvuII»). Видно, что олигонуклеотид полностью защищает самую короткую РНК и частично защищает более длинные РНК. Деградация последних дает устойчивый продукт, подвижность которого при неденатурирующем электрофорезе несколько меньше, чем подвижность гибрида олигонуклеотида с РНК SmaI (фиг.3, слева). Такой продукт не образуется в отсутствие олигонуклеотида (фиг.3, справа).

Тонкую структуру продуктов фосфоролиза анализировали с помощью электрофореза высокого разрешения в денатурирующих условиях (фиг.4). Перед фосфоролизом каждую из трех РНК дефосфорилировали и затем метили на 5'-конце с помощью [ -³²P]ATP и полинуклеотидкиназы. Из фиг.4А видно, что устойчивый продукт деградации более длинных РНК имеет довольно гетерогенный 3'-конец и до 8 нт длиннее, чем РНК с защищенной концевой последовательностью. Последняя также имеет гетерогенный 3'-конец, но это обычно для РНК, полученных с помощью транскрипции обрезанных ДНК («run-off transcription») [37]. Наблюдаемая гетерогенность продуктов фосфоролиза по большей части является следствием гетерогенности защитного олигонуклеотида, так как ее удается существенно уменьшить при использовании олигонуклеотида с точным 5'-концом. Такой защитный олигонуклеотид получали обрезая с помощью эндонуклеазы рестрикции олигонуклеотид, удлиненный на 5'-конце [33, 34]. Фосфоролиз EcoRI- и PvuII-PHK, гибридизованных с таким 5'-обрезанным олигонуклеотидом, давал продукт, чья 3'-концевая гетерогенность была сравнима с гетерогенностью продукта транскрипции, и который был на 8 нт длиннее, чем РНК SmaI с защищенной концевой последовательностью (фиг.4Б). Отсюда следует, что Tth-ПНФаза останавливается на разрушаемой РНК на расстоянии 8 нт от 5'-конца олигонуклеотида, гибридизованного с внутренней последовательностью РНК. Присутствие фосфатной группы на 5'-конце олигонуклеотида не влияло на длину защищаемого участка РНК (фиг.4Б; ср. дорожки 3 и 4 с дорожками 7 и 8).

С одной стороны, полученные результаты позволяют надеяться, что избирательную деградацию ПНФазой незащищенной РНК можно использовать для уничтожения РНК, отличных от мишени, и, следовательно, для повышения специфичности обратной транскрипции. С другой стороны, результаты, представленные на фиг.2, показывают, что олигонуклеотид, гибридизованный с внутренней последовательностью РНК, защищает ее не полностью. Действительно, в отличие РНК SmaI, гибридизованной с олигонуклеотидом своей 3'-концевой последовательностью, количество РНК EcoRI и - в еще большей степени - более длинной РНК PvuII заметно падает после обработки Tth-ПНФазой (см. полосы, отмеченные белыми стрелками). Это наблюдение существенно ограничивает применимость данного подхода для молекулярной диагностики, так как, с одной стороны, анализируемые мишени часто не имеют строго определенных 3'-концов, а, с другой стороны, последовательность мишени, представляющая интерес для диагностики, часто находится вдали от 3'-конца. В последнем случае, результат анализа будет подвержен действию даже ничтожных примесей эндонуклеаз, поскольку даже одиночный разрыв в области, лежащей между 3'-концом и анализируемой последовательностью, приведет к полному снятию защиты.

Оказалось, что простое увеличение длины защитного олигонуклеотида (и, следовательно, температуры плавления гибрида) не улучшает ситуацию. Мы предположили, что неполнота защиты является следствием двух факторов: (1) известно, что ПНФаза является высокопроцессивным ферментом (то есть, не диссоциирует от РНК, пока не разрушит ее полностью, вплоть до 5'-конца) [18], и (2) вероятно, что, даже в отсутствие полной диссоциации защитного олигонуклеотида, гибрид может "дышать": иногда 5'-конец защитного олигонуклеотида отходит от РНК. В этот момент молекула ПНФазы, остановленная на расстоянии 8 нт от 5'-конца олигонуклеотида, может занять временно освободившееся место. После ряда таких событий ПНФаза разрушит весь сегмент РНК, комплементарный защитному олигонуклеотиду, а затем и остальную часть РНК. Такой механизм помогает объяснить зависимость защитного эффекта олигонуклеотида от того, гибридизован он с 3'-концевой или с внутренней последовательностью РНК.

Если предложенный механизм верен, то защитный эффект олигонуклеотида, гибридизованного с внутренней последовательностью, можно увеличить, повысив стабильность гибрида. Известно несколько модификаций олигонуклеотидов, повышающих стабильность их гибридов с комплементарными цепями РНК и ДНК. Например, температура плавления гибридов, образованных PNA (peptide nucleic acid)-аналогами олигонуклеотидов, в которых сахарофосфатный остов заменен на полиамидный [38-40], существенно выше, чем гибридов, образованных обычными (природными) олигонуклеотидами с такой же длиной и нуклеотидной последовательностью [41]. К существенному повышению стабильности гибридов приводит также замена обычных рибозных колец нуклеотидов на некоторые их би-три- или полициклические аналоги; многие из таких модификаций раскрыты в патентах [42-44]. Наиболее популярными стали так называемые LNA (locked nucleic acid)-аналоги нуклеотидов, рибозные кольца которых зафиксированы в 3'-эндо-конфигурации, характерной для А-формы двойной спирали РНК, путем введения 2'-O, 4'-С-метиленового мостика [45]. Введение одного LNA-аналога вместо обычного нуклеотида приводит к повышению на 2-10°С температуры плавления гибрида длиной до 10 нт, причем суммарное повышение температуры плавления может достигать несколько десятков градусов [46].

Фиг.5 демонстрирует, что замена 6 из 38 нуклеотидов олигодезоксирибонуклеотида на их LNA-аналоги приводит к существенному повышению защиты комплементарной РНК от Tth-ПНФазы. В данном эксперименте приблизительно одинаковую эффективность показали как олигонуклеотид, в котором все замены были сгруппированы вблизи 5'-конца (LNA-1), так и олигонуклеотид, в котором замены были рассредоточены по длине (LNA-2).

Фиг.6 демонстрирует результаты эксперимента, в котором Tth-ПНФазой обрабатывали смесь высокомолекулярных рибосомных РНК Е.coli (длиной 1542 и 2904 нт) и мРНК маммаглобина (маркера рака молочной железы) длиной 486 нт, защищенной LNA-модифицированным олигонуклеотидом на расстоянии 18 нт от 3'-конца. Видно, что рибосомные РНК практически полностью разрушаются в течение 5 мин, в то время как защищенная РНК остается целой. При дальнейшей инкубации олигонуклеотид, в котором LNA-аналоги сгруппированы у 5'-конца (LNA-2), демонстрирует лучшую защиту.

Наконец, фиг.7 демонстрирует эффективность предложенного здесь подхода в подавлении неспецифического синтеза ДНК при обратной транскрипции и последующей ПНР (ОТ-ПЦР). Осуществление ОТ-ПЦР с использованием суммарной РНК, выделенной из цельной крови, и праймеров, специфичных к мРНК теломеразы человека (hTERT, вероятного универсального маркера рака), дает гетерогенный набор неспецифических продуктов (дорожка 2), в том числе существенно большего размера, чем искомый фрагмент кДНК hTERT (203 п.о, дорожка 1). Обработка препарата суммарной РНК крови Tth-ПНФазой перед стадией обратной транскрипции резко снижает количество неспецифических продуктов (дорожка 3). В то же время, обработка фрагмента мРНК hTERT длиной 486 нт, защищенной LNA-модифицированным олигонуклеотидом на расстоянии 36 нт от 3'-конца, не снижает выход специфического продукта (дорожка 4).

Таким образом, благодаря деградации незащищенных РНК Tth-ПНФазой можно существенно подавить неспецифический синтез ДНК при обратной транскрипции и тем самым повысить специфичность размножения (а, следовательно, и чувствительность детекции) РНК-мишени, которую защищают от ПНФазы олигонуклеотидом, гибридизующимся с РНК-мишенью по 3'-сторону от участка, подлежащего обратной транскрипции. Конечно, сам защитный олигонуклеотид может быть использован в качестве праймера при обратной транскрипции, а также при возможном последующем размножении кДНК с помощью выбранной бесклеточной ферментной системы экспоненциального размножения полинуклеотидов. В то же время, для защиты от ПНФазы можно использовать отдельный олигонуклеотид, при этом предпочтительно удалять или блокировать его 3'-гидроксильную группу (например, путем фосфорилирования), чтобы исключить его последующее использование полимеразами в качестве праймера.

Хотя в приведенных примерах для защиты РНК использовали олигодезоксирибонуклеотиды, такую же защиту могут обеспечить олигорибонуклеотиды, смешанные олигонуклеотиды, в которых присутствуют дезоксирибо- и рибонуклеотидные звенья, а также аналоги олигонуклеотидов, в которых природный сахарофосфатный остов заменен на неприродный полимер, например, содержащий модифицированные фосфодиэфирные связи, неприродный сахарный компонент, химические аналоги фосфодиэфирной связи, полностью измененный остов, остов с 2'-5'-межнуклеотидными связями или составленный из -нуклеотидных аномеров. Многочисленные примеры такого рода представлены в Патенте США № 6329144 [47]. Примеры неприродных олигомеров, которые способны к правильному спариванию по Уотсону и Крику с комплементарным участком нуклеиновой кислоты-мишени, включают, но не исчерпываются такими химическими аналогами, как фосфоротиоатные, метилфосфонатные, боранфосфонатные производные нуклеиновых кислот [48, 49], уже упомянутые пептидные нуклеиновые кислоты [38-40], морфолиновые олигонуклеотиды [50, 51]. Для защитного действия олигонуклеотида или его аналога необходимо и достаточно, чтобы он был способен гибридизоваться с РНК посредством спаривания азотистых оснований по Уотсону и Крику и чтобы образующийся гибрид имел существенную стабильность при температуре реакции фосфоролиза.

Очевидно, что, помимо Tth-ПНФазы, с той же целью могут быть использованы другие термостабильные ПНФазы, например, ПНФаза T.aquaticus. Более того, учитывая большое структурное и функциональное сходство бактериальных ПНФаз [25] и экзосом архей S. solfataricus [31] и Archaeoglobus fulgidus [52], можно ожидать, что архейные экзосомы обладают биохимическими свойствами, подобными свойствам Tth-ПНФазы, и также могут быть использованы для указанной выше цели. Было показано, что РНКаза РН S. solfataricus и A. fulgidus, формирующая «кор» экзосомы, сохраняет фосфорилазную активность при 60°С [31, 52] и даже при 70°С [53].

Однако фосфорилазная активность была продемонстрирована только в отношении неструктурированных олиго(А) последовательностей, в то время как РНКаза РН S. solfataricus оказалась неспособной разрушить шпильку с черешком из 8 G:C-пap даже при инкубации в течение 30 мин при 70°С [53]. Возможно, неспособность разрушать структурированные РНК является результатом того, что в «кор» экзосомы отсутствуют субъединицы, гомологичные РНК-связывающим доменам КН и S1 ПНФазы. Можно надеяться, что полная архейная экзосома, содержащая также КН- и S1-подобные субъединицы, будет эффективно разрушать структурированные РНК при высокой температуре.

Для применения предложенного способа важно использовать термостабильную ПНФазу и осуществлять реакцию в условиях [температура, концентрация ПНФазы, ее косубстратов (помимо РНК, таких как P_i) и кофакторов (таких как Mg²⁺), продолжительность инкубации], при которых достигается полная деградация незащищенной РНК. Не существенно, обладает ли термостабильностью ПНФаза, выделенная из природного источника, или ее термостабильность повышена с помощью методов генетической инженерии, в результате селекции, химической модификации или иными способами, известными в технике.

Хотя в приведенных здесь примерах стадия инкубации РНК с ПНФазой предшествует стадии обратной транскрипции, возможно частичное перекрывание этих стадий во времени (то есть, начало обратной транскрипции до окончания реакции фосфоролиза), особенно при использовании термостабильной обратной транскриптазы, такой как ThermoScript (Invitrogen, США), способной работать при температуре, оптимальной для Tth-ПНФазы (65°С).

Предложенный способ поясняется, но не ограничивается, следующими конкретными примерами его осуществления.

Пример 1. Препараты РНК

В данной работе использовали следующие препараты РНК:

(1) CT1n1 РНК, вариант RQ135^-1 РНК [35], несущий 43-нт вставку (подчеркнута), выделенный из продуктов межмолекулярной рекомбинации РНК:

Препарат CT1n1 РНК получают транскрипцией плазмиды, несущей рекомбинантную кДНК, расщепленной по сайту SmaI.

(2) 5'-фрагмент RQ135 РНК: 5'-концевой фрагмент RQ135^-1 РНК [35] длиной 52 нт, несущий чужеродный довесок длиной 23 нт (подчеркнут):

Препарат 5' фрагмента получают транскрипцией плазмиды, кодирующей 5'-фрагмент [54], расщепленной по сайту BamHI.

(3) 3'-фрагмент RQ135 РНК (транскрипт SmaI): 3'-концевой фрагмент RQ135^-1 RNA [35] длиной 81 нт, несущий чужеродный довесок длиной 28 нт (подчеркнут):

Препарат 3' фрагмента получают транскрипцией плазмиды, кодирующей 3'-фрагмент [54], расщепленной по сайту SmaI.

(4) Транскрипт EcoRI [3'-фрагмент RQ135 РНК, удлиненный на 3'-конце последовательностью длиной 18 нт (подчеркнута)]:

Препарат этой РНК получают транскрипцией плазмиды, кодирующей 3'-фрагмент [54], расщепленной по сайту EcoRI.

(5) Транскрипт PvuII [3'-фрагмент RQ135 РНК, удлиненный на 3'-конце последовательностью длиной 194 нт (подчеркнута)]:

Препарат этой РНК получают транскрипцией плазмиды, кодирующей 3'-фрагмент [54], расщепленной по сайту PvuII.

(6) мРНК маммаглобина (секретоглобина SCGB2A2; подчеркнута последовательность, комплементарная защитному олигонуклеотиду):

Препарат этой РНК получают транскрипцией плазмиды, кодирующей 8ССВ2А2-кДНК, расщепленной по сайту EcoRI.

(7) Фрагмент мРНК теломеразы человека [hTERT; одинарной линией подчеркнута последовательность, комплементарная защитному олигонуклеотиду; двойными линями подчеркнуты участки, соответствующие ОТ-ПЦР-праймерам]:

Препарат этой РНК получают транскрипцией плазмиды, кодирующей hTERT-кДНК, расщепленной по сайту HindIII.

Все препараты РНК получают с помощью Т7 РНК-полимеразы и очищают с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, как описано ранее [54].

Пример 2. Выделение суммарной РНК из цельной крови человека

Метод является модификацией известного метода Хомчинского [9], разработанного для выделения РНК из гомогенизированных тканей. С учетом специфики крови, мы ввели в лизирующий раствор ЭДТА, дополнительно добавляли 2-меркаптоэтанол (перед размораживанием образцов), а также ввели дополнительную экстракцию фенолом из водного раствора и стадию переосаждения РНК смесью ацетона и этанола. Эти изменения повысили выход и сохранность РНК, улучшили растворимость конечного препарата, а также понизили содержание примесей, ингибирующих ОТ и ПЦР.

Если не указано иное, все операции проводят при комнатной температуре в микроцентрифужных пробирках типа "Эппендорф", а центрифугирования осуществляют на холоде (0-4°С) в центрифугах MiniSpin (Eppendorf, Германия) на максимальной скорости (13400 об/мин), используя для выделения аликвоты лизата, полученного следующим образом.

В пробирку с 1,5 мл консервирующего раствора [5,33 М тиоцианат гуанидина, 33,3 мМ цитрат натрия (рН 7,5), 0,67% саркозил, 17,8 мМ ЭДТА, 1,8% 2-меркаптоэтанол (конечные концентрации: 4 М тиоцианат гуанидина, 25 мМ цитрат натрия, 0,5% саркозил, 13 мМ ЭДТА, 1,3% 2-меркаптоэтанол] добавляют 0,5 мл свежесобранной крови и перемешивают. Полученную суспензию хранят при температуре -20°С в темноте.

Ниже описана детальная процедура для выделения РНК из 0,6 мл лизата; при использовании другого объема лизата объемы всех реагентов пропорционально увеличивают. Все растворы и воду автоклавируют. Все перемешивания осуществляют на встряхивателе Reax-Top (Heidolph, Германия) при максимальной интенсивности (2500 об/мин).

Размораживание лизата. К замороженному лизату (2 мл) добавляют 26,7 мкл 2-меркаптоэтанола (из расчета 8 мкл на 600 мкл лизата). Лизат размораживают, перемешивают, центрифугируют в течение 15 с, отбирают в чистую пробирку 608 мкл; остальное замораживают и хранят при -20°С.

Первая экстракция фенолом. Добавляют 68 мкл 2 М ацетата натрия рН 4,0 (до 200 мМ), перемешивают в течение 10 с; добавляют 600 мкл фенола (рН 4,5, насыщенного водой), перемешивают в течение 10 с; добавляют 180 мкл смеси хлороформ/изоамиловый спирт (49: 1), перемешивают в течение 1 мин; инкубируют во льду в течение 15 мин, перемешивают в течение 10 с, центрифугируют при комнатной температуре в течение 20 мин; отбирают водную фазу (верхнюю) в чистую пробирку: 3 раза по 164 мкл (всего 492 мкл).

Осаждение изопропанолом. К водной фазе добавляют 690 мкл изопропанола, охлажденного до -20°С, смешивают переворачиванием 8-10 раз, перемешивают в течение 10 с, центрифугируют при 4°С в течение 15 сек; инкубируют при -20°С в течение 60 мин, центрифугируют при 4°С в течение 20 мин, надосадочную жидкость удаляют.

Промывание осадка. К осадкам добавляют на льду 1 мл охлажденной (-20°С) смеси этанола и 0,1 мМ ЭДТА (4:1), обмывают крышечку переворачиванием пробирки 4-5 раз, центрифугируют при 4°С в течение 10 мин, надосадочную жидкость удаляют, осадок высушивают при 45°С в течение 5 мин.

Вторая экстракция фенолом. Осадок растворяют в 180 мкл 0,5% SDS, добавляют 20 мкл 3М NaCl (до 300 мМ), перемешивают в течение 10 с; добавляют 200 мкл фенола (рН 4,5, насыщенного водой), перемешивают в течение 1 мин, центрифугируют при 22°С в течение 10 мин; отбирают 175 мкл водной фазы (верхней) в чистую пробирку.

Промывание экстракта. К водной фазе добавляют 175 мкл хлороформа, перемешивают в течение 1 мин, центрифугируют при 22°С в течение 1 мин; отбирают 165 мкл водной фазы (верхней) в чистую пробирку.

Осаждение смесью ацетона и спирта. К водной фазе добавляют 990 мкл охлажденной (-20°С) смеси ацетон : этанол (1:1), смешивают переворачиванием 8-10 раз, перемешивают в течение 10 сек, центрифугируют при 4°С в течение 15 с; инкубируют при -20°С в течение 20 мин; центрифугируют при 4°С в течение 20 мин, надосадочную жидкость удаляют.

Промывание осадка. К осадкам добавляют на льду 1 мл охлажденной (-20°С) смеси ацетон : этанол (1:1), обмывают крышку пробирки переворачиванием пробирки 4-5 раз, центрифугируют при 4°С в течение 10 мин, надосадочную жидкость удаляют, осадок высушивают при 45°С в течение 10 мин.

Растворение осадка. Осадок растворяют в 30 мкл 0,1 мМ ЭДТА, инкубируют при 65°С в течение 10 мин, перемешивают в течение 5 мин, центрифугируют в течение 1 мин; нагревают в течение 3 мин при на водяной бане, быстро переносят на лед; инкубируют в течение 5 мин, центрифугируют в течение 2 мин, перемешивают 3 раза в течение 1 с.

Гель-фильтрация. Полученный образец пропускают (с помощью центрифугирования) через уравновешенную в 0,1 мМ ЭДТА 0,6-мл колонку Sephadex G-25 DNA Grade (Amersham Biosciences), приготовленную в микроцентрифужной пробирке с прорезанным бритвой дном. Перед пропусканием образца всю свободную жидкость удаляют из колонки с помощью центрифугирования в тех же условиях. Образец хранят при -70°С.

Пример 3. Исследование зависимости деградации РНК от температуры

Реакция фосфоролиза. Реакционная смесь объемом 10 мкл имеет следующий состав: 50 мМ Hepes-KOH (рН 8,1), 75 мМ КС1, 0,1 мМ MgCl ₂, 1 мМ дитиотрейтол, 1 мМ Na-фосфат, 0,5 пмоль 3'-фрагмента RQ135 РНК. Сверх того, в каждый образец вместе с препаратами ПНФазы и РНК вносят 0,056 мМ EDTA. Реакцию осуществляют в течение 15 мин при указанных на фиг.1 температурах в присутствии или в отсутствие 0,5 пмоль Tth-ПНФазы и останавливают добавлением 10 мкл 10мМ Na-EDTA.

Анализ продуктов реакции. Нуклеиновые кислоты выделяют с помощью фенольной экстракции [55] и разделяют с помощью электрофореза в денатурирующих условиях: в полиакриламидном геле, содержащем 7М мочевину, в буфере ТВЕ (100 мМ Tris-OH, 100 мМ борная кислота, 2 мМ Na-EDTA). После электрофореза гель окрашивают серебром [56]. Фиг.1 демонстрирует результат эксперимента.

Пример 4. Гибридизация РНК с защитным олигонуклеотидом

Расплавление образцов. Непосредственно перед экспериментом, РНК [в 0,1 мМ Na-EDTA] и олигодезоксирибонуклеотид [в 10 мМ Tris-HCl (рН 9,0), 0,01 мМ Na-EDTA] раздельно расплавляют в кипящей водяной бане в течение 2 мин, после чего быстро охлаждают на льду.

Гибридизация РНК с олигонуклеотидом. Расплавленные РНК и олигодезоксирибонуклеотид (2,5 пмоль) смешивают в 5 мкл раствора, также содержащего 80 мМ Hepes-KOH (рН 8,1), 150 мМ KCl, 0,2 мМ Na-EDTA и инкубируют в течение 15 мин при 65°С.

Пример 5. Определение полноты деградации РНК

Обработка ПНФазой. CT1n1 РНК (SEQ ID NO:1) либо ее гибрид с олигонуклеотидом R-38 [5'-GGGCTAACAGTGCGGTAACACGCACTGGA-GGTCCGAAA-3' (SEQ ID NO:8) синтезирован ЗАО "Синтол", Россия], полученный как описано в примере 4, инкубируют в присутствии или в отсутствии 2 пмоль Tth-ПНФазы в условиях реакции фосфоролиза (пример 3) при 65°С. Затем образцы экстрагируют фенолом [55], водную фазу смешивают с 6 объемами смеси этанол : ацетон (1:1 по объему) в присутствии 20 мкг линейного полиакриламида [57] и 300 мМ KCl, нуклеиновые кислоты осаждают в микроцентрифуге при 12000 g, осадок дважды промывают 80% этанолом и растворяют в 6 мкл воды. Остаточное количество CT1n1 РНК определяют с помощью ОТ-ПЦР следующим образом.

Обратная транскрипция (ОТ). Реакционная смесь объемом 10 мкл содержит 50 мМ Tris-HCl (рН 8,3), 79 мМ KCl, 3 мМ MgCl ₂, 10 мМ дитиотрейтол, 0,2 мМ каждого из dATP, dGTP, dTTP и dCTP, 0.5 мкМ праймера R-38 (SEQ ID NO:8), 50 нг поли(А), 50 ед обратной транскриптазы M-MLV (Amersham Biosciences) и анализируемый образец РНК. После инкубации в течение 60 мин при 45°С образцы осаждают смесью этанол: ацетон как описано выше.

ПЦР. Реакции осуществляют в ДНК-амплификаторе RapidCycler (Idaho Technology, США) в капиллярах объемом 10 мкл, содержащих 50 мМ Tris-HCl (рН 8,7), 2,5 мМ MgCl₂, 0,2 мМ каждого из dATP, dGTP, dTTP и dCTP, 0,2 мкМ каждого из праймеров R-38 (SEQ ID NO:8) и F-39 [5'-AAGCTTAATACGACTCACTATA-GGGGTTCCAACCGGAAG -3' (SEQ ID NO:9), подчеркнут участок, совпадающий с 5'-концевой последовательностью RQ135 кДНК], 10 мкг казеина, 12 нг His ₆-модифицированной Taq ДНК-полимеразы [58] и часть полученного на стадии ОТ препарата кДНК, соответствующую указанному на фиг.5А стартовому числу молекул CT1n1 РНК. Препарат кДНК разводят в буфере 10 мМ Tris-HCl (рН 9,0), 0,1 мМ Na-EDTA, 0,1% полиэтиленгликоль 6000, 10нг/мкл поли(А). После пяти начальных циклов ПЦР (расплавление при 94°С в течение 10 с, отжиг при 60°С в течение 10 с, элонгация при 70°С в течение 30 с) выполняют 35 циклов, в которых температуру расплавления понижают до 88°С, а температуру отжига повышают до 65°С.

Продукты ОТ-ПЦР разделяют с помощью электрофореза в неденатурирующих условиях в буфере ТВЕ и окрашивают бромистым этидием. Результаты представлены на фиг.2А. ПНФаза присутствовала во всех образцах, кроме помеченных «-ПНФаза».

Пример 6. Селективная деградация РНК, не защищенной комплементарным олигонуклеотидом

Смесь 0,5 пмоль 3'-фрагмента и 0,5 пмоль 5'-фрагмента RQ135 РНК гибридизуют с олигонуклеотидом R-38 (SEQ ID NO:8) (пример 4), инкубируют в присутствии или в отсутствии 2 пмоль Tth-ПНФазы в условиях реакции фосфоролиза (пример 3) при 65°С и анализируют в неденатурирующих условиях, как описано в примере 5. Результат представлен на фиг.2Б.

Пример 7. Защита РНК олигонуклеотидом, гибридизованным с внутренней последовательностью

Фиг.3 демонстрирует результаты эксперимента, в котором РНК-транскрипты одной и той же плазмиды, расщепленной по сайтам рестрикции SmaI (длина транскрипта 109 нт, SEQ ID NO:3), EcoRI (127 нт, SEQ ID NO:4) или PvuII (303 нт, SEQ ID NO:5) (каждый более длинный фрагмент целиком содержит в себе последовательности более коротких фрагментов, то есть 1-109 нуклеотиды во всех фрагментах одинаковы, пример 1), либо обрабатывают («+»), либо не обрабатывают («-») с помощью 2 пмоль Tth-ПНФазы при 65°С после отжига этих транскриптов, поодиночке или в присутствии олигонуклеотида R-38 (SEQ ID NO:8), комплементарного нуклеотидам 72-109. Для осуществления эксперимента используют условия и процедуры, изложенные в примерах 3 и 4.

С целью определения точной длины укороченных фрагментов используют транскрипты, [³²Р]-меченные на 5'-конце, и продукты деградации разделяют с помощью электрофореза высокого разрешения в денатурирующих условиях, применяемого для секвенирования нуклеиновых кислот [55, 59]. Для приготовления 5'-меченых транскриптов, немеченые транскрипты (пример 1) обрабатывают фосфатазой с целью удаления 5'-трифосфата, а затем фосфорилируют, используя полинуклеотидкиназу и [ -³²Р]АТР [55]. После электрофореза гель экспонируют в течение ночи на экран MS и получают изображение радиоактивных полос, сканируя экран на фосфоримиджере Cyclone (Packard Instrument, США). Результаты приведены на фиг.4.

Часть А демонстрирует результаты, полученные с использованием олигонуклеотида R-38 (SEQ ID NO:8), химически синтезированного ЗАО "Синтол" (Россия), без каких-либо дополнительных обработок. Дорожки 1 и 2 содержат полноразмерные транскрипты SmaI и EcoRI, а дорожки 3 и 4 - обработанные Tth-ПНФазой транскрипты EcoRI и PvuII, соответственно.

Часть Б демонстрирует результаты, полученные с использованием олигонуклеотида R-38 с точным 5'-концом, полученного из более длинного олигонуклеотида с помощью эндонуклеазы рестрикции SmaI, как описано ранее [33]. Дорожка 1 содержит полноразмерный транскрипт SmaI, дорожка 5 - транскрипт EcoRI, частично деградированный слабой щелочью с целью генерации 1-нуклеотидной «лесенки» [59]. Дорожки 1-А содержат продукты деградации транскриптов SmaI, EcoRI и PvuII, соответственно, гибридизованных с олигонуклеотидом R-38, 5'-конец которого фосфорилирован, так как эндонуклеаза рестрикции расщепляет межнуклеотидную связь между фосфатом и 3'-гидроксилом [55]. Дорожки 6-8 содержат продукты деградации тех же транскриптов, гибридизованных с тем же олигонуклеотидом, дополнительно обработанным фосфатазой [55] для удаления 5'-фосфата.

Пример 8. Синтез LNA-модифицированных олигонуклеотидов

Модифицированные LNA олигонуклеотиды синтезируют по методике поставщика амидофосфитов - компании GlenResearch (США). Готовят 0,1 М растворы соответствующих амидофосфитов: для dA, dG, Т - в безводном ацетонитриле, для dC в растворе тетрагидрофуран/ацетонитрил 1:4. Время конденсации - 3 мин. Время окисления увеличивают в три раза по сравнению с условиями, рекомендуемыми для стандартных амидофосфитов (http://www.glenresearch.com/ProductFiles/10-2011.html).

Очистку олигонуклеотидов осуществляют с помощью денатурирующего гель-электрофореза в 15% полиакриламидном геле (пример 3) при комнатной температуре и напряжении 1 кВ. Продукт обнаруживают с помощью облучения геля УФ-светом с длиной волны 254 нм. Соответствующий целевому фрагмент элюируют из геля раствором 2М перхлората лития (в течение ночи при комнатной температуре) и осаждают ацетоном в течение 15 мин при -20°С, с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 16000 об/мин в микроцентрифуге Eppendorf (Германия). Осадок растворяют в воде MilliQ (Millipore, США) и измеряют концентрацию олигонуклеотида по оптической плотности при 260 нм [55].

Пример 9. Защита РНК LNA-модифицированными олигонуклеотидами

Фиг.5 демонстрирует результат эксперимента, в котором транскрипт PvuII (303 нт, SEQ ID NO:5) либо обрабатывают («+»), либо не обрабатывают («-») с помощью 2 пмоль Tth-ПНФазы в течение 5 мин при 65°С после отжига в присутствии немодифицированного олигонуклеотида R-38 (SEQ ID NO:8) («н/м»), комплементарного нуклеотидам 72-109, либо в присутствии LNA-модифицированного олигонуклеотида R-38, в котором LNA-аналоги нуклеотидов (помечены надстрочной буквой «L») сгруппированы недалеко от 5'-конца: 5'-GGGC^LT^LA^LA^L C^LA^LGTGCGGTAACACGCACTGGAGGTCCGAAA-3' (LNA-1) или рассредоточены по длине: 5'-GGGC^LTAAC ^LAGTGC^LGGTAAC^LACGC^LACTGGAGGTC ^LCGAAA-3' (LNA-2).

Для осуществления эксперимента используют условия и процедуры, изложенные в примерах 3 и 4. Продукты реакции разделяют в неденатурирующих условиях (пример 5).

Пример 10. Кинетика деградации Tth-ПНФазой незащищенной высокомолекулярной РНК

Фиг.6 демонстрирует результат эксперимента, в котором смесь 50 нг рибосомных РНК Е.coli (длиной 1542 и 2904 нт) и 20 нг мРНК маммаглобина длиной 486 нт (пример 1, SEQ ID NO:6) (дорожка 1) обрабатывают с помощью 2 пмоль Tth-ПНФазы в течение указанного времени при 65°С после отжига либо в отсутствие (дорожка 2), либо в присутствии LNA-модифицированного олигонуклеотида 5'-GAAAGAGAAGGTGTGGTTTGCAGCAATCCGTAGTTGG-P-3' (SEQ ID NO:10), комплементарного нуклеотидам 432-468, в котором LNA-аналоги нуклеотидов (помечены надстрочной буквой «L») рассредоточены по длине: 5'-G^LAAA^LGAG ^LAAG^LGTG^LTGG^LTTTG ^LCAGCAATCCGTAGTTGG-P-3' (LNA-1) или сгруппированы у 5'-конца: 5'-G^LA^LA^LA ^LG^LA^LG^LAAGGTGTGGTTTGCAGCAATCCGTAGTTGG-p-3' (LNA-2).

Для осуществления эксперимента используют условия и процедуры, изложенные в примерах 3 и 4. Продукты реакции разделяют в неденатурирующих условиях (пример 5).

Пример 11. Влияние обработки препарата РНК Tth-ПНФазой на специфичность ОТ-ПЦР

Фиг.7 демонстрирует результат эксперимента, в котором фрагмент мРНК теломеразы человека длиной 486 нт (пример 1, SEQ ID NO:7) (дорожки 1 и 4) либо суммарную РНК, выделенную из цельной крови здорового донора, как описано в примере 2 (дорожки 2 и 3), либо обрабатывают (дорожки 3 и 4), либо не обрабатывают (дорожки 1 и 2) с помощью 2 пмоль Tth-ПНФазы в течение 5 мин при 65°С после отжига этих РНК в присутствии LNA-модифицированного олигонуклеотида 5'-G^LA^LG^L C^LC^LA^LC^LG^L A^LA^LCTGTCGCATGTACGGCTGGAGGTCTGTC-3' (SEQ ID NO:11), комплементарного нуклеотидам 413-450 фрагмента мРНК теломеразы. Отжиг осуществляют как описано в примере 4, а реакцию фосфоролиза - как в примере 3. Затем ПНФазу инактивируют, для чего смесь инкубируют при 96°С в течение 2 мин. После обработки образцы РНК подвергают процедуре ОТ-ПЦР, которую осуществляют следующим образом.

Обратная транскрипция (ОТ). Реакционная смесь объемом 10 мкл содержит 50 мМ Tris-HCl (рН 8,3), 75 мМ KCl, 3 мМ MgCl₂, 10 мМ дитиотрейтол, 0,5 мМ каждого из dATP, dGTP, dTTP и dCTP, 0,2 мкМ праймер 5'-CATGTACGGCTGGAGGTCTGTC-3' (SEQ ID NO:12), 500 нг поли(А), 2 ед. обратной транскриптазы M-MLV SuperScriptII (Invitrogen) и анализируемый образец РНК: мРНК hTERT (20 нг или 10¹¹ молекул до обработки ПНФазой, образцы 1 и 4) или суммарную РНК, выделенную из 10 мкл цельной крови ( 100 нг до обработки ПНФазой, образцы 2 и 3). После инкубации в течение 60 мин при 50°С образцы пропускают через 200 мкл колонку Sephadex G-25 (насыщенный 10 мМ TrisHCI рН 9,0; 0,1 мМ ЭДТА).

ПЦР. Реакции осуществляют в ДНК-амплификаторе RapidCycler (Idaho Technology, США) в капиллярах объемом 10 мкл, содержащих 50 мМ Tris-HCl (рН 8,7), 2,5 мM MgCl₂, 0,2 мМ каждого из dATP, dGTP, dTTP и dCTP, 0,2 мкМ каждого из праймеров [обратного (SEQ ID NO:12) и прямого 5'-TGTACTTTGTCAAGGTGGATGTG-3' (SEQ ID NO:13)], 10 мкг бычьего сывороточного альбумина (фракция V, Behringer Mannheim, Германия), 39 нг His₆-модифицированной Taq ДНК-полимеразы [58] и часть полученного на стадии ОТ препарата кДНК, соответствующую 100 молекулам мРНК hTERT (образцы 1 и 4) или 5 мкл цельной крови (образцы 2 и 3). Препарат кДНК разводят в буфере 10 мМ Tris-HCl (рН 9,0), 0,1 мМ Na-EDTA, 0,1% полиэтиленгликоль 6000, 10 нг/мкл поли(А). Осуществляют 43 цикла ПЦР в следующем режиме: расплавление при 94°С в течение 15 с, отжиг при 68°С в течение 15 с, элонгация при 72°С в течение 1 мин.

Продукты ОТ-ПЦР разделяют в неденатурирующих условиях (пример 5) и окрашивают бромистым этидием. На фиг.7 показаны негативные изображения геля.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

Осуществление изобретения в соответствии с настоящими описанием, примерами и формулой позволяет существенно повысить специфичность обратной транскрипции в случаях, когда анализируемый образец содержит большое количество посторонней (отличной от мишени) РНК. Предлагаемый способ не исключает, а дополняет известные в технике способы понижения уровня неспецифического синтеза ДНК при определении РНК-мишеней и может быть использован как наряду с ними, так и отдельно.

Предлагаемый способ может быть использован для повышения чувствительности и специфичности молекулярной диагностики, основанной на размножении РНК-мишеней, а также в любых других приложениях молекулярной биологии и биотехнологии, для которых повышение специфичности обратной транскрипции является важным фактором.

Источники информации