средство, обладающее ранозаживляющей активностью
Классы МПК: | A61K31/4375 гетероциклическая система, содержащая шестичленное кольцо с азотом в качестве гетероатома, например хинолизины, нафтиридины, берберин, винкамин A61K36/714 Aconitum (борец, аконит) A61P17/02 для обработки ран, язв, ожогов, шрамов, келоидов или подобных заболеваний |
Автор(ы): | Зюзьков Глеб Николаевич (RU), Поветьева Татьяна Николаевна (RU), Семенов Аркадий Алексеевич (RU), Жданов Вадим Вадимович (RU), Суслов Николай Иннокентьевич (RU), Нестерова Юлия Владимировна (RU), Удут Елена Владимировна (RU), Мирошниченко Лариса Аркадьевна (RU), Крапивин Александр Владимирович (RU), Фомина Татьяна Ивановна (RU), Дыгай Александр Михайлович (RU) |
Патентообладатель(и): | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИ фармакологии" СО РАМН) (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2012-04-04 публикация патента:
20.05.2013 |
Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, к средству, обладающему ранозаживляющей активностью. Применение гипаконитина в качестве средства, обладающего ранозаживляющей активностью. Гипактонитин обладает выраженной ранозаживляющей активностью. 6 табл., 1 пр.
Формула изобретения
Применение гипаконитина в качестве средства, обладающего ранозаживляющей активностью.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии и клеточным технологиям.
Известно большое количество средств, обладающих ранозаживляющей активностью: метилурапил, солкосерил, облепиховое масло, натрия нуклеинат и др. [1, 2].
Недостатком данных средств является зачастую их низкая эффективность [2].
Задачей, решаемой настоящим изобретением, является расширение арсенала средств, обладающих выраженной ранозаживляющей активностью.
Поставленная задача достигается применением гипаконитина в качестве средства, обладающего ранозаживляющей активностью.
Новым в предлагаемом изобретении является использование гипаконитина в качестве средства, обладающего ранозаживляющей активностью.
Используемое оригинальное средство гипаконитина разработано и получено ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН (г. Томск) совместно с Национальным исследовательским Иркутским Государственным Техническим Университетом (г. Иркутск) и представляло собой 0,00025% водный раствор данного алкалоида. Гипаконитин извлекался из травы растений семейства лютиковых в виде свободных оснований экстракцией стандартным методом [3].
Важная роль в регенерации тканей принадлежит резидентным прогениторным, в том числе стволовым (СК), клеткам [4, 5]. При этом существует фармакологическая стратегия регенеративной медицины, заключающаяся в стимуляции эндогенных родоначальных элементов [5]. Причем активация последних может являться следствием как прямого воздействия фармакологических агентов на прогениторные элементы, так и результатом стимуляции клеток микроокружения тканей, опосредованно определяющей ускоренное течение репаративных процессов [5, 6].
Ранее авторами было показано ускорение заживления ран кожи комплексными экстрактами и алкалоидной фракцией живокости высокой [7]. При этом максимальный ранозаживляющий эффект наблюдался при использовании суммы алкалоидов, среди которых доминирующим является элатин [8]. В то же время с помощью метода тонкослойной хроматографии в алкалоидной фракции было установлено содержание других алкалоидов, в том числе гипаконитина. Гипаконитин (C33H45NO10),
представляет собой гетероциклическое азотсодержащее органическое соединение растительного происхождения. Чаще всего его извлекают из растений рода Аконит, хотя он встречается и в других растениях [7, 9]. Известно, что гипоаконитин, как и некоторые другие алкалоиды аконитиновой группы, обладает анальгетической активностью [10]. При этом способность гипаконитина стимулировать процессы регенерации, в том числе заживления ран, в литературе не описана. Эксперимент показал непредсказуемые результаты.
Факт применения гипоаконитина с достижением нового технического результата, заключающегося в стимуляции заживления ран, для специалиста не является очевидным.
Новые свойства не вытекают явным образом из уровня техники в данной области и не обнаружены в патентной и научно-технической литературе. Предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине.
Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».
Эксперименты были проведены на 86 беспородных мышах-самцах. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН.
Исследования проводили в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом МЗСР РФ № 708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики», Федеральным Законом от 12 апреля 2010 г. № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств», «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Москва, 2005).
Пример 1
Ранозаживляющую активность предлагаемого средства и механизмы его действия изучали на модели плоскостной кожной раны [11]. На депилированном участке спины у мышей под легким эфирным наркозом вырезали лоскут кожи размером 10×10 мм. Для моделирования более длительного заживления струп с экспериментальной раны регулярно (через сутки) снимали.
Предлагаемое средство получали из травы аконита байкольского и живокости высокой. Надземная часть растений, собранная в период цветения в Иркутской области, измельчалась до размера частиц менее 5 мм, обрабатывалась раствором карбоната натрия и подвергалась непрерывной экстракции хлороформом в течение 5 суток. Хлороформный экстракт упаривали до небольшого объема и тщательно экстрагировали 5% серной кислотой. Кислотную вытяжку подщелачивали карбонатом натрия до рН 9-10 и экстрагировали сначала эфиром. Эфирный экстракт упаривали досуха, растворяли в небольшом количестве эфира и хроматографировали на дезактивированной окиси алюминия в системе гексан-ацетон (90 50%). При этом гипаконитин, дополнительно очищенный перекристаллизацией из смеси тех же растворителей, элюировался после мезаконитина. Вещество растворяли в дистиллированной воде до конечной концентрации 0,00025%.
Полученное средство применяли наружно, начиная с первого дня после моделирования раны, ежедневно в течение всего периода заживления. Раствор наносили в объеме 30 мкл. В качестве средств сравнения использовали гель «Солкосерил» (Ай Си Эн Швейцария АГ, Швейцария) и «Облепиховое масло» (ОАО Нижфарм, Россия), которые применяли по той же схеме и в эквивалентном количестве, что и раствор гипаконитина.
Критериями стимулирующего регенерацию действия служили средний диаметр раны и результаты гистологического исследования биоптатов кожи мышей, полученных на 15-е сутки из края раневого дефекта. Биопсийные образцы раневого дефекта кожи окрашивали гематоксилин-эозином. В каждом препарате оценивали: рельеф регенерата кожи, степень и характер инфильтрации, наличие и выраженность отека, количество новообразованных сосудов, волосяных фолликулов и потовых желез. Изучали такие патоморфологические процессы, как акантоз, гиперкератоз, дискератоз [12]. На 3-и и 5-е сут методом клонирования определяли содержание мезенхимальных клеток-предшественников (КОЕ-Ф) в раневой поверхности [13], а также методом колониеобразования в тест-системе изучали продукцию гуморальных факторов стромальными клетками кожи (колониеобразующую активность супернатантов адгезирующих клеток с раневой поверхности в отношении КОЕ-Ф костного мозга) [13]. Кроме того, определяли прямое влияние гипаконитина на КОЕ-Ф. Для этого его вносили в культуру миелокариоцитов в концентрации 100 нМоль/мл, после чего на 7-е сут подсчитывали количество колоний [13]. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t критерия Стьюдента и непараметрического U критерия Манна-Уитни.
В ходе эксперимента заживление ран у контрольных животных отмечалось к 18 сут опыта. Использование гипаконитина способствовало значительному ускорению процессов регенерации. Заживление дефекта при использовании предлагаемого средства наблюдалось к 14 сут опыта, в то время как при применении средств сравнения таковое отмечалось лишь к 16 сут. При этом в опытной группе (гипаконитин) имело место наиболее выраженное снижение размера ран (табл.1).
При гистологическом исследовании процессов, протекающих в области раневого дефекта кожи мышей, показал, что в контрольной группе имело место формирование неполноценного регенерата. В подавляющем большинстве случаев поверхностный эпителий наблюдался не на всем протяжении, встречались небольшие участки отслойки эпидермиса от дермы с наличием субэпидермальных щелей, отмечалось резкое утолщение эпителиального пласта с нечеткой дифференцировкой слоев и увеличение количества базального, зернистого и рогового слоев. Внутриэпителиально обнаруживались нейтрофильные лейкоциты с формированием микроабсцессов, наблюдались слабовыраженные явления акантоза, гипер- и дискератоза. Подлежащая ткань была представлена созревающими грануляциями с умеренной гистиоцитарно-лейкоцитарной инфильтрацией, явлением отека и очагами кровоизлияний в верхних слоях дермы. Во всех образцах в прилежащей к зоне дефекта ткани отмечается малое количество волосяных фолликулов и потовых желез. Регенерат кожи у животных контрольной группы характеризовался умеренным воспалением, что привело к усиленной пролиферации эпителия, для которой характерны атипические разрастания и изменения эпителия в виде акантоза, гипер- и дискератоза. Изучение гистоструктуры раневого дефекта в группе животных, получавших терапию гипаконитином, показало формирование полноценного соединительнотканного рубца, покрытого эпителием. В остальных образцах (группы сравнения) эпителиальный слой был резко неравномерный, с утолщением в зоне дефекта за счет клеток базального слоя. Подлежащая ткань - грануляционная, местами с очаговой умеренной нейтрофильной инфильтрацией. В области, прилежащей к дефекту, во всех образцах ткани отмечалось умеренное количество волосяных фолликулов и потовых желез. При этом количество животных, у которых произошла полная эпителизация при использовании предлагаемого средства было достоверно выше, чем в контроле (табл.2).
Исследование механизмов регенеративной активности данного средства выявило ряд уникальных феноменов. Применение алкалоида сопровождалось существенным увеличением числа КОЕ-Ф в раневой поверхности (табл.3) и ускорением их дифференцировки (табл.4). При этом выявленные изменения наблюдались на фоне возрастания продукции ростовых факторов стромальными клетками кожи (табл.5). В то же время отмечалось и прямое действие данного алкалоида на прогениторные клетки. Его внесение в культуру миелокариоцитов сопровождалось значительным увеличением выхода в метилцеллюлозной среде числа КОЕ-Ф (табл.6). При этом средства сравнения на данные параметры влияния не оказывали (табл.3-6).
В целом полученные результаты свидетельствуют о наличии способности у гипаконитина значительно стимулировать процессы заживления ран. Механизмами действия алкалоида является активация резидентных мезенхимальных клеток-предшественников, связанная как с его прямым влиянием на прогениторные клетки, так и с опосредованным повышением выработки ростовых факторов стромальными клетками кожи действием.
Таблица 1 | ||||
Динамика среднего диаметра ран, в см (Х±т) | ||||
Сроки исследования/сутки | Контроль | Гипаконитин | Солкосерил | Облепиховое масло |
1 | 1,09±0,01 | 1,12±0,02 | 1,06±0,03 | 1,03±0,02 |
3 | 0,98±0,02 | 0,94±0,03 | 1,0±0,02 | 0,92±0,04 |
5 | 0,9±0,02 | 0,79±0,02* | 0,78±0,03* | 0,9±0,03 |
7 | 0,76±0,03 | 0,61±0,04 | 0,73±0,02 | 0,67±0,02* |
9 | 0,57±0,02 | 0,52±0,03 | 0,51±0,01* | 0,54±0,03 |
12 | 0,28±0,03 | 0,17±0,02* | 0,21±0,01* | 0,2±0,01* |
13 | 0,20±0,02 | 0,06±0,01* | 0,14±0,01* | 0,16±0,02 |
14 | 0,1±0,03 | 0,0±0,0 | 0,07±0,01 | 0,06±0,02 |
16 | 0,06±0,03 | 0,0±0,0 | 0,0±0,0 | 0,0±0,0 |
* - отмечена достоверность относительно контроля при р<0,05 |
Таблица 2 | |||
Доля животных с полной эпителизацией места дефекта кожи, в % (Х±m) | |||
Контроль | Гипаконитин | Солкосерил | Облепиховое масло |
4,6±0,9 | 91,2±5,47* | 56,4±10,3* | 51,7±9,4* |
* - отмечена достоверность относительно контроля при р<0,05 |
Таблица 3 | ||||
Содержание мезенхимальных клеток-предшественников в раневой поверхности, на 2,5×105 нуклеаров, (Х±m) | ||||
Сроки исследования/сутки | Контроль | Гипаконитин | Солкосерил | Облепиховое масло |
3 | 0,67±0,21 | 2,83±0,31* | 0,7±0,3 | 0,65±0,19 |
5 | 1,17±0,3 | 3,0±0,37* | 1,0±0,22 | 0,92±0,43 |
* - отмечена достоверность относительно контроля при р<0,05 |
Таблица 4 | ||||
Индекс дифференцировки клеток-предшественников (отношение кластреробразующих единиц фибробластов к колониеобразующим единицам фибробластов) в раневой поверхности, в усл. ед., (Х±m) | ||||
Сроки исследования/сутки | Контроль | Гипаконитин | Солкосерил | Облепиховое масло |
3 | 1,33±0,21 | 1,82±0,2 | 1,34±0,19 | 1,42±0,37 |
5 | 1,42±0,27 | 2,4±0,26* | 1,36±0,22 | 1,41±0,16 |
* - отмечена достоверность относительно контроля при р<0,05 |
Таблица 5 | ||||
Колониестимулирующая активность супернатантов стромальных клеток кожи, в усл. Ед. ×105, (Х±m) | ||||
Сроки исследования/сутки | Контроль | Гипаконитин | Солкосерил | Облепиховое масло |
3 | 8,08±0,57 | 13,25±0,88* | 11,3±2,42 | 7,65±0,78 |
5 | 0,17±0,11 | 2,75±0,28* | 1,0±0,57 | 0,19±0,03 |
* - отмечена достоверность относительно контроля при р<0,05 |
Таблица 6 | |||
Число КОЕ-Ф в культуре клеток костного мозга при добавлении стимуляторов регенерации, на 2,5×105 миелокариоцитов, (Х±m) | |||
Контроль | Гипаконитин | Солкосерил | Облепиховое масло |
12,25±0,85 | 17,6±0,33* | 13,7±0,64 | 10,32±0,79 |
* - отмечена достоверность относительно контроля при р<0,05 |
Литература
1. Машковский М.Д. Лекарственные средства: 15-е изд. - М.: OO «Изд-во Новая Волна», 2008. - 1206 с.
2. Котельников В.П. Раны и их лечение. - М.: Знание. 1991. - 123 с.
3. Погодаева Н.Н., Жапова Ц., Верещагин А.Л., Горшков А.Г., Семенов А.А. / Изучение алкалоидного состава некоторых видов сибирских аконитов // Раст. ресурсы, вып.2, 2000 г., с.79-84.
4. Бабаева А.Г. Регенерация: факты и перспективы. - М.: Изд-во РАМН, 2009. - 336 с.
5. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Иммобилизированный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Фармакологические свойства и перспективы использования. - Томск: ООО «Печатная мануфактура», 2011. - 149 с.
6. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Клеточная терапия: новые подходы // Наука в России. - М.: Наука, 2009. - Том. 169. - № 1. - С.4-8.
7. Нестерова Ю.В., Поветьева Т.Н., Нагорняк Ю.Г., Перова А.В., Андреева Т.И., Рослякова Е.П., Суслов Н.И. Механизмы влияния комплексных и выделенных веществ на репаративную активность тканей в эксперименте // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2009. - Т.72, № 3. - С.40-43.
8. Муравьева Д.А., Самылина И.А., Яковлев Г.П. Фармакогнозия: Учебник 3-е изд. М.: Медицина, 2002.
9. Осадчий С.А., Ганбаатар Ж., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. Алкалоиды сибирских видов живокости и аконита и их превращения // Материалы Первой Международной конференции "Химия и биологическая активность азотистых гетероциклов и алкалоидов" (том 1) Москва, 9-12 октября 2001 г.
10. Алефиров А.Н. Борец за жизнь. Аконит / А.Н.Алефиров. - СПб.: ИД «Весь», 2002. - 192 с.
11. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей редакцией член-корр. РАМН, проф. Р.У.Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство "Медицина"», 2005. - 832 с.
12. Микроскопическая техника / Под ред. Д.С.Саркисова. М., 1996.
13. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск, 1992.
Класс A61K31/4375 гетероциклическая система, содержащая шестичленное кольцо с азотом в качестве гетероатома, например хинолизины, нафтиридины, берберин, винкамин
Класс A61K36/714 Aconitum (борец, аконит)
Класс A61P17/02 для обработки ран, язв, ожогов, шрамов, келоидов или подобных заболеваний