способ получения белково-минеральной композиции, содержащей рекомбинантный белок collbd-bmp-2
Классы МПК: | C12N15/12 гены, кодирующие животные белки B82B1/00 Наноструктуры |
Автор(ы): | Лунин Владимир Глебович (RU), Карягина-Жулина Анна Станиславовна (RU), Котнова Алина Петровна (RU), Шарапова Наталья Евгеньевна (RU), Семихин Александр Сергеевич (RU), Соболева Любовь Александровна (RU), Полетаева Нина Николаевна (RU), Лаврова Наталья Витальевна (RU), Гинцбург Александр Леонидович (RU) |
Патентообладатель(и): | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство образования и науки (RU), Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России). (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2012-05-15 публикация патента:
10.09.2013 |
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения композиции на основе белково-минеральных компонентов. Сначала получают плазмиду pCollbd-BMP-2. Затем указанную плазмиду встраивают в штамм Escherichia coli M15/pREP4. После чего получают рекомбинантный белок Collbd-BMP-2 путем выращивания клеток штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-2], индукции синтеза белка Collbd-BMP-2, разрушения клеток, получения супернатанта, содержащего белок, иммобилизации белка путем добавления к супернатанту суспензии коллагенсодержащего сорбента, инкубирования, отмывания сорбента со связавшимся белком, последующей элюции белка с сорбента и диализа. Затем в ламинарном шкафу готовят две стерильные полипропиленовые пробирки и вносят в них суспензию гидроксиапатита, добавляют раствор соединительнотканного коллагена или ксеногенного костного коллагена в виде крошки, перемешивают на встряхивателе до получения однородной суспензии. Далее вносят 10% (по массе) желатиновых микросфер, содержащих рекомбинантный фактор роста костной ткани Collbd-BMP-2, перемешивают на встряхивателе. Полученная композиция представляет собой стерильную пасту белого, бежевого, сероватого или желтоватого цвета равномерной консистенции, содержит 5-20% синтетического наноструктурного гидроксиапатита, 0,1-15% коллагена I типа и 5-10% пролонгированной формы рекомбинантного фактора роста костной ткани Collbd-BMP-2 и обладает остеокондуктивными и остеоиндуктивными свойствами. Композиция по данному изобретению может использоваться для заполнения костных дефектов и нанесения на имплантируемые материалы. Изобретение может применяться в травматологии, ортопедии, челюстно-лицевой хирургии, стоматологии для лечения заболеваний и повреждений костной системы человека в качестве активного биодеградируемого материала, для регенерации костной ткани, остеоиндуктивного биологического покрытия металлических эндопротезов костной ткани. 4 пр.
Формула изобретения
Способ получения композиции на основе белково-минеральных компонентов, включающий получение плазмиды pCollbd-BMP-2, встраивание указанной плазмиды в штамм Escherichia coli M15/pREP4, получение рекомбинантного белка Collbd-BMP-2 путем выращивания клеток штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-2], индукции синтеза белка Collbd-BMP-2, разрушения клеток, получения супернатанта, содержащего белок, иммобилизации белка путем добавления к супернатанту суспензии коллагенсодержащего сорбента, инкубирования, отмывания сорбента со связавшимся белком, последующей элюции белка с сорбента и диализа, приготовление в ламинарном шкафу двух стерильных полипропиленовых пробирок и внесение в них суспензии гидроксиапатита, добавление раствора соединительнотканного коллагена или ксеногенного костного коллагена в виде крошки, перемешивание на встряхивателе до получения однородной суспензии, внесение 10% (по массе) желатиновых микросфер, содержащих рекомбинантный фактор роста костной ткани Collbd-BMP-2, перемешивание на встряхивателе, при этом полученная композиция (ГАМАЛАНТ-паста-ФОРТЕ) используется для заполнения костных дефектов и нанесения на имплантируемые материалы, представляет собой стерильную пасту белого, бежевого, сероватого или желтоватого цвета равномерной консистенции, обладает остеокондуктивными и остеоиндуктивными свойствами, содержит 5-20% синтетического наноструктурного гидроксиапатита, 0,1-15% коллагена I типа и 5-10% пролонгированной формы рекомбинантного фактора роста костной ткани Collbd-BMP-2.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к биохимии, биотехнологии, генной инженерии, нанотехнологиям и касается способа получения белково-минеральной композиции, содержащей рекомбинантный белок Collbd-BMP-2.
Белок Collbd-BMP-2 является рекомбинантным и помимо функционального домена костного морфогенетического белка содержит также коллагенсвязывающий домен, упрощающий очистку и иммобилизацию фактора роста в композиционном материале. Белок состоит из коллагенсвязывающего домена Collbd (SPARC(w)) из внеклеточного кальций-зависимого белка SPARC (ВМ-40 или остеонектина) человека и спейсерной последовательности GGS. Белок получают путем бактериального синтеза в клетках штамма E.coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-2]. Рекомбинантную плазмиду pCollbd-BMP-2 размером 3447 п.н., обеспечивающую экспрессию рекомбинантного белка Collbd-BMP-2, состоящего из коллагенсвязывающего домена Collbd, из внеклеточного кальций-зависимого белка SPARC человека, спейсера из остатков глицина и серина и костного морфогенетического белка ВМР-2, и содержащую:
- искусственный бактериальный оперон химерных белков, включающий: промоторную область раннего промотора бактериофага Т5 (7-87 п.н.), обеспечивающую эффективную транскрипцию контролируемой мРНК; рекомбинантный ген, обеспечивающий экспрессию целевого химерного белка (коллагенсвязывающий домен Collbd - спейсер - костный морфогенетический белок BMP-2) (117-545 п.н.); нетранслируемую область терминации транскрипции бактериального оперона, обеспечивающую эффективное окончание транскрипции (585-679 п.н.);
- бактериальный оперон bla (3232-2382 п.н. комплементарной цепи), кодирующий белок бета-лактамазу, являющуюся селективным маркером для отбора клонов-трансформантов E.coli методом контрселекции;
- бактериальный участок инициации репликации типа ColE1, обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах E.coli (1630 п.н.), встраивают в штамм Escherichia coli M15/pREP4, получая штамм Escherichia coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-2]. Полученный штамм является продуцентом рекомбинантного белка Collbd-BMP-2, состоящего из коллагенсвязывающего домена Collbd из внеклеточного кальций-зависимого белка SPARC человека, спейсера из остатков глицина и серина и костного морфогенетического белка ВМР-2.
Рекомбинантный белок Collbd-BMP-2, состоящий из коллагенсвязывающего домена Collbd, из внеклеточного кальций-зависимого белка SPARC человека, спейсера из остатков глицина и серина и костного морфогенетического белка BMP-2, обладает биологическими свойствами белка BMP-2 и способностью самопроизвольно связываться с коллагенсодержащим сорбентом.
Способ получения рекомбинантного белка Collbd-BMP-2 включает выращивание клеток штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-2], индукцию синтеза белка Collbd-BMP-2, разрушение клеток, получение супернатанта, содержащего белок, иммобилизацию белка путем добавления к супернатанту суспензии коллагенсодержащего сорбента, инкубирование, отмывание сорбента со связавшимся белком, последующую элюцию белка с сорбента и диализ.
На сегодняшний день известно около 20-ти видов костных морфогенетических белков, которые играют важную роль в регуляции роста, дифференцировки и апоптоза клеток различных типов, включая остеобласты, хондробласты, нервные клетки, эпителиальные клетки и др. [Sakou Т. 1998. Bone morphogenetic proteins: from basic studies to clinical approaches. Bone. 22, 591-603]. Нативные костные морфогенетические белки содержатся в кости в небольших количествах (по разным источникам, от 2 до 180 мкг костных морфогенетических белков на 1 кг кости) [Iwata И, Sakano S, Itoh Т, Bauer TW. Demineralized bone matrix and native bone morphogenetic protein in orthopaedic surgery. // Clin Orthop Relat Res. 2002 Feb; (395): 99-109]. Они очень консервативны и практически не отличаются по первичной структуре у человека и животных [Alaoui-Ismaili MH, Falb D. Design of second generation therapeutic recombinant bone morphogenetic proteins. // Cytokine Growth Factor Rev. 2009 Oct-Dec; 20(5-6): 501-507].
Следует отметить, что, несмотря на значительное разнообразие остеогенных композитных материалов, представленных на мировом рынке, биомедицинские продукты с применением рекомбинантного морфогенетического белка ВМР-2 производит лишь одна зарубежная компания: коммерческий рекомбинантный человеческий BMP-2 с названием «INFUSE» rhBMP-2/ACS, производимый компанией «Medtronic Biologics» (Мемфис, США), разрешен к применению FDA с 2002 года. На российском рынке препараты, содержащие рекомбинантные костные морфогенетические белки, полностью отсутствуют.
Таким образом, композиция, получаемая способом по изобретению, может применяться в травматологии, ортопедии, челюстно-лицевой хирургии, стоматологии для лечения заболеваний и повреждений опорно-двигательной системы человека в качестве активного биодеградируемого материала, для регенерации костной ткани, остеоиндуктивного биологического покрытия металлических эндопротезов костной ткани.
Современные материалы и покрытия - это биодеградируемые и биосовместимые матриксы или подложки разнообразной формы, несущие биологически активные компоненты (антибиотики, ростовые факторы, витамины и др.). Они обеспечивают благоприятную среду для восстановления поврежденных тканей и могут иметь самые разнообразные способы применения. Создание нового поколения биосовместимых наполнителей, покрытий, тканевых протезов, подходящих для использования во всех фазах раневого процесса при ожогах, травмах различного размера и глубины, является одной из актуальных задач современной реконструктивной хирургии. Идеальное покрытие должно отвечать следующим требованиям: биосовместимость, биоабсорбция, способность к биодеградации, обеспечение клеточной адгезии, обеспечение васкуляризации и приживления тканей, торможение развития бактерий. В качестве биосовместимых материалов широко применяются препараты на основе коллагена. К ценным свойствам коллагена относятся его способность стимулировать фибриллогенез, рассасываться и замещаться живой тканью. Кроме того, следует отметить его низкую токсичность и антигенность, высокую механическую прочность и устойчивость к тканевым протеазам. В целом, однако, следует подчеркнуть, что как в мире, так и в нашей стране в области разработки биосовместимых костнопластических материалов основное внимание сосредоточено на получении имплантатов и покрытий на основе гидроксиапатита или коллагена типа I, а также их комбинации. Введение в состав белково-минеральных костнопластических материалов биологически активных компонентов является весьма перспективным подходом для развития методов реконструктивной хирургии.
Медицинским сообществом отмечается значительное преимущество имплантируемых композитных материалов, содержащих рекомбинантные белковые факторы, в частности, BMP-2 (Bone Morphogenetic Protein, костный морфогенетический белок 2), перед другими видами имплантатов, вследствие того, что они существенно ускоряют регенерацию костной ткани и сокращают сроки реабилитации больных, исключая многочисленные проблемы, связанные с применением ауто- и аллотрансплантатов. Костные морфогенетические белки являются одним из ключевых компонентов современных костнопластических материалов, обеспечивающих их высокую остеоиндуктивность.
Известен биокомпозиционный материал для пластики костных дефектов (заявка № 97118288), содержащий в качестве компонентов гидроксиапатит (50-90% по массе), коллаген (2-48%) и антисептик (2-8%). При этом он обладает остеокондуктивными, но не обладает остеоиндуктивными свойствами.
Известно вещество для возмещения дефектов кости (патенты № 2005133592 и № 2303436), содержащее в качестве компонентов гидроксиапатит, трикальцийфосфат и незначительное количество коллагена, а также неколлагеновые белки костной ткани, обладающие остаточной остеоиндуктивностью. Однако она несопоставима с регенеративным потенциалом рекомбинантных факторов роста костной ткани.
За наиболее близкий к белково-минеральной композиции, получаемой способом по изобретению, аналог может быть принят остеоиндуктивный материал «ИНДОСТ» (патент № 2317088), включающий в зависимости от варианта исполнения гидроксиапатит, трикальцийфосфат и/или коллаген, причем во всех случаях материал дополнительно содержит композицию неколлагеновых белков костной ткани, стимулирующую остеогенез, при определенном соотношении компонентов на 100 г материала. Однако следует отметить, что предложенные способы получения неколлагеновых белков из костной ткани приводят к значительному снижению их биологической активности и, соответственно, остеоиндуктивного потенциала всего материала в целом.
Задачей настоящего изобретения является создание композиционного костнопластического материала, обладающего, в зависимости от вида исполнения, повышенным остеокондуктивным, либо остеокондуктивным и остеоиндуктивным потенциалом и содержащего компоненты костной ткани, свойства которых максимально приближены к природным.
Упомянутая задача решается за счет оптимального соотношения компонентов материала: нанокристаллического гидроксиапатита, коллагена, рекомбинантного фактора роста и регенерации костной ткани. Получаемая способом по изобретению композиция имеет наименование ГАМАЛАНТ-паста-ФОРТЕ.
Кроме того, упомянутая задача решается за счет введения в материал в качестве одного из компонентов нанокристаллического гидроксиапатита, который является основным минеральным компонентом костной ткани. Кристаллы синтетического гидроксиапатита, входящие в состав ГАМАЛАНТ-пасты-ФОРТЕ, постепенно разлагаются путем химических превращений до ионов кальция и фосфора с их последующей интеграцией в структуру новообразованной костной ткани. На их частицах путем эпитаксиального роста прикрепляется собственный нативный гидроксиапатит организма, составляющий минеральную основу новообразованной кости.
Помимо этого, упомянутая задача решается за счет введения в материал в качестве компонента коллагена I - основного белкового компонента костной ткани. Правильная пространственная структура белковых фибрилл коллагена, входящего в состав ГАМАЛАНТ-пасты-ФОРТЕ, обеспечивает клеткам организма наиболее благоприятные условия для интеграции внутрь композиционного материала и возможность формирования новых коллагеновых волокон, заполняющих полость в области костного дефекта или имплантации. Тем самым предотвращается формирование фиброзной ткани и значительно ускоряется восстановление костного дефекта.
Упомянутая задача также решается за счет иммобилизации в материале рекомбинатного фактора роста костной ткани Collbd-BMP-2, который помимо функциональных доменов костного морфогенетического белка, содержит также коллагенсвязывающий домен, упрощающий очистку и иммобилизацию фактора роста в композиционном материале.
Кроме того, упомянутая задача также была решена за счет инкапсулирования фактора роста костной ткани в желатиновые микросферы. Такой способ упаковки факторов роста обеспечивает их пролонгированное действие в области введения за счет постепенной деградации желатина эндогенными ферментами и высвобождения молекул факторов, что позволяет предотвратить их быструю диффузию из области введения. Как показали ранее проведенные авторами исследования [М.З Федорова, С.В. Надеждин, А.С. Семихин, М.А. Лазебная, Г.В. Храмов, Ю.Р. Колобов, А.В. Громов, М.С. Бартов, В.Г. Лунин, А.С. Карягина, Д.В. Гундеров «Экспериментальная оценка композиционного материала на основе белково-минеральных компонентов и рекомбинантного костного морфогенетического белка-2 в качестве покрытия титановых имплантатов», ТРАВМАТОЛОГИЯ И ОРТОПЕДИЯ РОССИИ, 2011-2(60)], композиционный материал с добавлением инкапсулированных факторов роста костной ткани обладает высоким остеоиндуктивным потенциалом и эффективно стимулирует образование костной ткани.
Сущность изобретения заключается в том, что получаемая способом по изобретению композиция на основе белково-минеральных компонентов для заполнения костных дефектов и нанесения на имплантируемые материалы ГАМАЛАНТ-паста-ФОРТЕ представляет собой стерильную пасту белого, бежевого, сероватого или желтоватого цвета равномерной консистенции, обладающую, в зависимости от вида исполнения, остеокондуктивными либо остеокондуктивными и остеоиндуктивными свойствами, состоящую из компонентов костной ткани, свойства которых максимально приближены к природным: синтетического наноструктурного гидроксиапатита (5-20%, в зависимости от вида исполнения), коллагена I типа (в виде раствора, полученного из соединительных тканей животных, либо крошки костной; 0,1-15%, в зависимости от вида исполнения) и отличающуюся содержанием пролонгированной формы рекомбинантного фактора роста костной ткани Collbd-BMP-2 (5-10%, присутствует в двух видах исполнения), обладающего высоким остеоиндуктивным потенциалом, а также способностью связываться с коллагенсодержащими материалами, благодаря наличию коллаген-связывающего функционального домена Collbd.
Техническим результатом, достигаемым способом по изобретению, является получение композиции на основе белково-минеральных компонентов для заполнения костных дефектов и нанесения на имплантируемые материалы ГАМАЛАНТ-паста-ФОРТЕ, обладающей в зависимости от вида исполнения повышенным остеокондуктивным, либо остеокондуктивным и остеоиндуктивным потенциалом, а также пролонгированным воздействием содержащегося в ней рекомбинантного фактора роста костной ткани на область костного дефекта.
Указанный технический результат достигается за счет того, что разработан способ получения ГАМАЛАНТ-пасты-ФОРТЕ, содержащей компоненты костной ткани, свойства которых максимально приближены к нативным:
1) ГАМАЛАНТ-паста-ФОРТЕ+ - содержит синтетический наноструктурный гидроксиапатит, ксеногенный костный коллаген в виде крошки и фактор роста костной ткани, инкапсулированный в желатиновые микросферы.
2) ГАМАЛАНТ-паста-ФОРТЕ-К - содержит синтетический наноструктурный гидроксиапатит, коллаген из соединительных тканей животных и фактор роста костной ткани, инкапсулированный в желатиновые микросферы.
Существует и третий вид исполнения - ГАМАЛАНТ-паста-ФОРТЕ - содержащий синтетический наноструктурный гидроксиапатит и ксеногенный костный коллаген в виде крошки, который обладает только остеокондуктивным потенциалом и применяется в случаях, когда использование ростовых факторов противопоказано. Например, наличие опухолевых заболеваний, детский возраст, беременность.
Однако виды исполнения ГАМАЛАНТ-паста-ФОРТЕ+ и ГАМАЛАНТ-паста-ФОРТЕ-К, получаемые способом по изобретению, проявляют высокие остеоиндуктивные свойства за счет пролонгированного выделения содержащихся в них рекомбинатного фактора роста костной ткани Collbd-ВМР-2.
Основные преимущества изобретения.
Основным преимуществом изобретения является наличие выраженных остеоиндуктивных свойств, обусловленное наличием в его составе пролонгированной формы рекомбинантного фактора роста костной ткани Collbd-BMP-2, способного связываться с коллагенсодержащими материалами за счет наличия у него коллагенсвязывающего домена.
Примеры
Пример 1. Получение плазмиды pQE6-BMP-2.
а) Химический синтез олигодезоксирибонуклеотидов.
Олигодезоксирибонуклеотиды были синтезированы твердофазным фосфорамидитным методом с помощью синтезатора АСМ 100-2 (Новосибирск) и очищены методом электрофореза в 12%-ном ПААГ.
б) Получение гена ВМР-2 с последующим его клонированием.
Копию гена BMP-2 получали методом полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Для этого проводили выделение тотальной РНК человека из скелетной мышцы человека. кДНК получали путем обработки 100 нг полиаденилированной РНК скелетной мышцы человека с помощью ImProm-II обратной транскриптазы Promega, согласно протоколу производителя.
Для последующей ПЦР были выбраны праймеры, соответствующие началу и концу гена ВМР-2. В прямой праймер был введен сайт BamHI, а в обратный - сайты BglII, Kpn2I и стоп-кодон.
Dir
5'GGATCCAGATCCCAAGCCAAACACAAACAGCGGAAACGCCT3'
Rev:
5'TCCGGACTAAGATCTACACCCACAACCCTCCACAACCATGTCCTG3'
2 мкл полученной в результате обратной транскрипции смеси вносили в реакционную смесь для ПЦР, которая содержала 10 пкМ каждого праймера (Dir и Rev), 67 мМ трис-HCl (рН 8,8 при 25°C), 15 мМ сульфата аммония, 2,5 мМ хлористого магния, 0,01% Твин-20, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ по 2,5 мМ) и 1 ед. полимеразы Native Pfu Polymerase (Stratagene). Реакцию амплификации проводили в объеме 25 мкл под вазелиновым маслом: 1 цикл 95°C - 3 мин; 35 циклов: 95°C - 15 сек, 72°C - 1 мин.
Продукт амплификации размером 357 п.н. обрабатывали хлороформом, переосаждали этиловым спиртом и растворяли в воде. Для клонирования данного продукта полученную ДНК BMP-2, а также ДНК плазмиды pQE6 («Qiagen», США) гидролизовали рестрикционными эндонуклеазами BamHI и Kpn21 при 37°C в буфере, содержащем 66 мМ Трис-ацетата (рН 7,9 при 37°C), 20 мМ ацетата магния, 132 мМ ацетата калия и 0,2 мг/мл BSA в течение 1,5 ч.
Выделенные из геля рестрикционные фрагменты: фрагмент ДНК, соответствующий гену BMP-2, размером 354 п.н. и фрагмент плазмиды pQE6 размером 3024 п.н., лигировали с помощью ДНК-лигазы бактериофага Т4. Эту конструкцию использовали для трансформации клеток E.coli M15 [pREP4] методом электропорации. Трансформированные клетки отбирали на агаризованной среде LB с антибиотиками - ампициллином и канамицином. Плазмидную ДНК рВМР-2 выделяли методом щелочного лизиса, анализировали с помощью рестриктаз BamHI и BspEl, а также рестриктаз, находящихся внутри клонируемых фрагментов, и отбирали клоны, плазмидная ДНК которых рВМР-2 размером 3447 п.н. содержит последовательность гена ВМР-2.
Первичную структуру полученной плазмиды подтверждали секвенированием.
в) Получение фрагмента гена SPARC, содержащего последовательность коллагенсвязывающего домена, с последующим его клонированием в плазмидную конструкцию рВМР-2.
Коллагенсвязывающий домен Collbd из внеклеточного белка SPARC (ВМ-40 или остеонектин) человека был синтезирован с использованием 4 олигонуклеотидов следующего состава:
Dir1:
CATGGGATCCCTGGACTCTGAACTGACCGAATTCCCGCTGCGCATGCGT
Dir2: GACTGGCTGAAAAACCCGGGTGGTTCTA
Rev1: GATCTAGAACCACCCGGGTTTTTCAGCCAGTCACGCATG
Rev2:CGCAGCGGGAATTCGGTCAGTTCAGAGTCCAGGGATCC.
Олигонуклеотиды были спланированы таким образом, что при гибридизации они образуют двуцепочечный фрагмент ДНК, содержащий липкие концы, соответствующие сайтам гидролиза рестриктаз NcoI и BglII. При синтезе олигонуклеотиды были фосфорилированы по 5 - концу.
Для получения двухцепочечного фрагмента ДНК смесь олигонуклетидов (по 20 пкМ), прогревали при 95°C (10 мин) и в течение 4 часов охлаждали до 25°C. Полученную смесь объединяли с фрагментом плазмиды рВМР-2 (3376 п.н.), гидролизованной эндонуклеазами рестрикции NcoI и BamHI при 37°С в буфере, содержащем 66 мМ Трис-ацетат (pH 7,9 при 37°C), 20 мМ ацетат магния, 132 мМ ацетат калия в течение 1,5 часов. Лигирование проводили с помощью ДНК-лигазы фага Т4 в буфере, содержащем 40 мМ Трис-HCl (pH 7,8 при 25°C), 10 мМ хлористого магния, 10 мМ ДТТ и 5 мМ АТФ. Лигированную смесь ДНК использовали для трансформации клеток E.coli M15 [pREP4] методом электропорации. Трансформированные клетки отбирали на агаризованной среде LB с антибиотиками канамицином (25 мкг/мл) и ампициллином (100 мкг/мл). Из отобранных рекомбинантных клонов выделяли плазмидную ДНК pCollbd-ВМР-2 методом щелочного лизиса. Отобранные клоны секвенировали и подтвердили наличие вставки, соответствующей коллагенсвязывающему домену Collbd из внеклеточного белка SPARC (ВМ-40 или остеонектина) человека.
Пример 2. Получение штамма E.coli - продуцента рекомбинантного белка Collbd-BMP-2, состоящего из ВМР-2, спейсера, коллагенсвязывающего домена Collbd.
Для получения штамма E.coli - продуцента рекомбинантного белка Collbd-BMP-2 - клетки штамма E.coli M15 [pREP4] (Nals, Strs, rifs, lac-, ara-, gal-, mtl-, F-, recA+, uvr+) трансформировали плазмидой pCollbd-BMP-2. Трансформированные клетки выращивали в 500 мл среды LB при 37°C до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 600 нм, индуцировали 150 мкл 0,1 М раствора изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида и выращивали в течение 4 часов.
Для контроля продукции рекомбинантного белка Collbd-BMP-2 клетками штамма E.coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-2] применяли метод электрофореза в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия. Разделение белков проводили в 12%-ном полиакриламидном геле в стандартной системе буферов (электродный буфер: 25 мМ Трис-HCl, 192 мМ глицина, 0,1% додецилсульфата натрия, pH 8,3; буфер для геля: 375 мМ Трис-HCl, рН 8,8). По окончании электрофореза гели окрашивали 0,15% раствором Кумасси G250 в 25% изопропаноле и 10% уксусной кислоте и отмывали в 10% уксусной кислоте. При сравнении спектра белков у штаммов E.coli M15 [pREP4] и E.coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-2] обнаруживали появление дополнительной белковой полосы с молекулярной массой 16 кДа, что соответствует молекулярной массе рекомбинантного белка Collbd-BMP-2. Уровень синтеза белка Collbd-BMP-2 определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка - стандарта молекулярной массы. Согласно полученным данным клетки штамма E.coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-2] синтезируют около 12% Collbd-BMP-2 от общего белка клеток.
Пример 3. Способ получения препарата белка Collbd-BMP-2, иммобилизованного на коллагенсодержащем сорбенте.
Клетки E.coli M15 [pREP4], трансформированные плазмидой pCollbd-BMP-2, выращивали в 3,5 мл среды LВ с ампициллином и канамицином при 37°C до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 600 нм, добавляли 3 мкл 0,1 М раствора изопропил-бета-Б-тиогалактопиранозида и выращивали в течение 4 ч. Культуру разводили до оптической плотности 0,7 при 530 нм, отбирали 400 мкл суспензии, осаждали клетки центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин. Клетки ресуспендировали в 500 мкл фосфатно-цитратного буфера (ФЦБ, 50 мМ, рН 6.0), разрушали ультразвуком, клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 16000 об/мин в течение 10 мин.
К 100 мкл 50% суспензии желатин-сефарозы добавляли 2 мл буферного раствора, содержащего 30 мМ Трис, pH 8,0, и 0,15 М хлорида натрия, а также лизат клеток в 7 М растворе гуанидинхлорида. Инкубировали при +4°C в течение 2 ч, затем оставляли на 16 ч при той же температуре. Центрифугировали полученную суспензию в течение 5 мин при 5000 об/мин. Осадок сорбента со связавшимся белком трижды отмывали буферным раствором, содержащим 30 мМ Трис, pH 8,0, и 0,15 М хлорида натрия.
Элюцию белка проводили буферным раствором, содержащим 6 М мочевины, 30 мМ Трис, pH 8,0, и 10 мМ ЭДТА. Анализ результатов связывания и элюции рекомбинантного белка Collbd-BMP-2 проводили методом электрофореза по Лэммли в 12% ПААГ в денатурирующих условиях.
По результатам электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН концентрация белка Collbd-BMP-2 составляла 10 мг на 1 мл сорбента.
Таким образом, получают штамм E.coli, обеспечивающий высокий уровень продукции рекомбинантного белка Collbd-BMP-2, и одновременно простую и эффективную схему очистки этого белка с иммобилизацией его на коллагенсодержащем сорбенте, входящем в состав нового поколения изделий и материалов медицинского назначения - имплантатов и покрытий.
Пример 4. Получение композиции на основе белково-минеральных компонентов для заполнения костных дефектов и нанесения на имплантируемые материалы ГАМАЛАНТ-паста-ФОРТЕ (вид исполнения ГАМАЛАНТ-паста-ФОРТЕ-К).
В ламинарном шкафу готовили 2 стерильные полипропиленовые пробирки объемом 50 мл и вносили в них по 9 мл 20%-ной суспензии гидроксиапатита. После этого добавляли по 9 мл 0,5%-ного раствора соединительнотканного коллагена и тщательно перемешивали на встряхивателе до получения однородной суспензии. В полученный композиционный препарат вносили 10% (по массе) желатиновых микросфер, содержащих рекомбинантный фактор роста костной ткани Collbd-BMP-2. Для этого в каждую полипропиленовую пробирку, содержащую композиционный препарат, вносили по 1,8 мг желатиновых микросфер и тщательно перемешивали на встряхивателе.
Композицию в исполнении ГАМАЛАНТ-паста-ФОРТЕ+ готовят аналогичным способом, исключая только то, что вместо раствора соединительнотканного коллагена добавляют ксеногенный костный коллаген в виде крошки.
Класс C12N15/12 гены, кодирующие животные белки