способ определения этиологии ангины у детей

Формула изобретения

Способ определения этиологии ангины у детей, включающий забор биоматериала, отличающийся тем, что в период разгара заболевания выполняют забор биоматериала, для чего осуществляют соскоб с поверхности небных миндалин, биоматериал помещают в одноразовую пластиковую пробирку с крышкой на 1,5 мл и добавляют 1,0 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия, затем биоматериал центрифугируют в течение 5 мин при 1500 об/мин, отбирают надосадочную жидкость и ресуспендируют остаток в буфере, охлажденном до +4°С, до конечной концентрации клеток 5×10⁶-10×10⁶ кл/мл, в цитометрическую пробирку на ледяной бане помещают 100 мкл клеточной взвеси, добавляют 10 мкл Аннексина V-FITC и 20 мкл 7AAD, после 15-минутной инкубации добавляют 400 мкл буфера, охлажденного до +4°С, и перемешивают на вортексе, подсчет относительного количества клеток, окрашенных Аннексином V и не окрашенных 7AAD, производят на проточном цитометре, в том случае, если в соскобе с небных миндалин содержание мононуклеаров, вступающих в апоптоз, составляет 16-40%, определяют бактериальный генез ангины, а при 41% и более - определяют вирусное поражение миндалин, обусловленное инфекционным мононуклеозом.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии, оториноларингологии, иммунологии и может быть использовано при проведении дифференциальной диагностики ангин и инфекционного мононуклеоза у детей.

В последние годы в мире и России отмечается увеличение заболеваемости инфекционным мононуклеозом (ИМ). За последнее десятилетие она возросла более чем в четыре раза, в том числе и у детей грудного возраста. В настоящее время различают инфекционный мононуклеоз вызванный вирусом Эпштейн-Барр (ЭБВ), цитомегаловирусом (ЦМВ) и вирусом герпеса человека 6 (ВГЧ-6).

Этиология и патогенез ангины при ИМ представляет большой интерес, так как от этого зависит выбор лечебной тактики.

Трудности установления этиологической роли тех или иных микроорганизмов в возникновении ангины обусловлены тем, что у здоровых людей в ротовой полости и на миндалинах обнаруживается чрезвычайно разнообразная микробная флора. Нередко бывает трудно провести четкую грань между сапрофитами и патогенными микробами. Деление микробов на патогенные, условно патогенные и непатогенные является условным в связи с размытостью критериев для отнесения их к той или иной группе. Неограниченная колонизация любым видом бактерии способна привести к развитию инфекционной патологии. Обитатели других областей при транслокации в непривычные места обитания, также, способны вызывать различные нарушения. Существуют данные о здоровом носительстве патогенных менингококков, пневмококков, стафилококков.

С другой стороны, в миндалинах трудно определить, где кончается норма и начинается патология как в морфологическом, так в функциональном аспекте. Это обусловлено тем, что небные миндалины - это скопление лимфоидной ткани, которая обеспечивает местный иммунитет ротовой полости, верхних дыхательных путей; защищает слизистые от внедрения микробов и других генетически чужеродных агентов, передающихся воздушно-капельным и воздушно-пылевым путем, регулирует локальную нормофлору, принимает участие в воспалении. В связи с чем нередко бывает трудно установить, какие изменения связаны с функциональной деятельностью миндалин как лимфоидного органа, а какие следует отнести к банальному воспалительному процессу [Преображенский Б.С. Ангина.: руководство по микробиологии, клиника и эпидемиология инфекционных болезней. - М., 1964, том VI, c 503-519].

Односторонняя трактовка этиопатогенеза ангины при ИМ, где превалирующая роль принадлежала бактериям приводит к широкому использованию антибиотиков у детей, что, в свою очередь способствует возникновению антибиотико-резистентных штаммов возбудителя, а также появлению токсико-аллергических сыпей. С другой стороны, наличие бактериальной ангины, особенно вызванной гемолитическим стрептококком, требует назначения антибиотиков, в связи с ожидаемыми осложнениями (гнойный лимфаденит, синусит, отит, гломеруронефрит, миокардит и др.).

По характеру наложений на небных миндалинах, не представляется возможным - отличить ангины разной этиологии (вирусной и бактериальной) друг от друга. В клиническом анализе крови при ИМ отмечается лейкоцитоз до 10-20·10⁹/л с лимфомоноцитозом (до 90-95%) и наличием широкоплазменных и базофильных лимфоцитов. Большое значение для диагностики ИМ по-прежнему имеет наличие в крови гетерофильных антител, которые обнаруживаются в максимальном количестве в течение первых 2 нед заболевания и полностью исчезают в течение 3-6 мес. Для этого используют реакции гетерогемагглютинации: Гоффа-Бауэра (с эритроцитами лошади), Пауля-Буннелля (с эритроцитами барана). Основные недостатки этих методов заключаются в их трудоемкости, невозможности дифференцировать острую инфекцию от перенесенной ранее, недостаточной специфичности (положительная реакция возможна при цитомегаловирусной инфекции, ОРВИ, вирусных гепатитах, псевдотуберкулезе, токсоплазмозе и др.) и чувствительности (в 25% случаев могут быть получены ложноотрицательные результаты) [Родионова О.В., Аксенов О.А., Букина А.А. Инфекционный мононуклеоз: клиника, новые подходы к диагностике и терапии у детей: Пособие для врачей. СПб, 2000].

В настоящее время наиболее значимым для диагностики ИМ является определение в крови больных вируспецифических антител с использованием иммуноферментного анализа (ИФА). Титры IgM и IgG к капсидному антигену (VCA) появляются в крови больных в первые недели заболевания и достигают пика на 3-4-й неделе. IgM циркулируют в течение 1-3 мес и далее не определяются. Их присутствие выявляется у 87-100% больных и является маркером острой инфекции. IgM и IgG к ранним антигенам (EA) выявляются в остром периоде ИМ у 70-90% больных и циркулируют обычно в течение 2-3 мес. Иногда антитела к ЕА обнаруживаются у вирусоносителей при первичном инфицировании, и увеличение титров IgM и IgG к VCA и EA будет являться индикатором реактивации ВЭБ. Антитела класса G (IgG) к нуклеарному антигену (NA-1) определяются в крови только через 1-3 мес от начала ИМ.

В качестве дополнительной диагностики ИМ может служить выявление ДНК вируса Эпштейн-Барра в крови и/или слюне больного в полимеразно-цепной реакции (ПЦР). Высокая чувствительность метода позволяет обнаружить минимальные следовые количества ДНК вируса, и в ряде случаев сложно отличить вирусоносительство от инфекционного процесса с активным размножением вируса. Так как ДНК доступна только в момент репликации вируса, то существенным недостатком метода является большой процент ложноотрицательных результатов (27%).

Прототип. Наиболее близким решением, принятым за прототип, является клинический анализ крови, который используют для определения этиологической причины ангины, а именно - вирусной (при ИМ) или бактериальной. Как известно, при бактериальных ангинах в крови обнаруживается лейкоцитоз нейтрофильного характера со сдвигом влево, когда при ИМ независимо от этиологии - лейкоцитоз лимфомоноцитарного характера и наличие атипичных мононуклеаров. Для выполнения анализа иглой Франка прокалывают палец. Первую каплю осторожно снимают ватой, следующую переносят на предварительно обезжиренное предметное стекло, прикасаясь им к пальцу. Не давая засохнуть капле, делают мазок предметным стеклом со шлифованными краями. После подсушивания мазок фиксируют метиловым спиртом или смесью спирта с эфиром и окрашивают по Романовскому. Рассматривают препарат с иммерсионной системой. Характерным для ИМ является лимфомоноцитоз (до 90-95%) с наличием атипичных мононуклеаров. Эти различного внешнего вида клетки имеют характерную структуру, в частности широкую базофильную цитоплазму. Диагностически значимым является увеличение количества атипичных мононуклеаров до 10-12%. Эти клетки появляются в крови на 1-й неделе заболевания и обнаруживаются в течение 2-3 недель от начала болезни, но иногда сохраняются до 1 месяца и более.

Самым существенным недостатком метода является то, что не всегда начальные проявления инфекционного мононуклеоза сопровождаются повышенным содержанием в крови атипичных мононуклеаров, часто даже при ярко выраженных симптомах заболевания они появятся в периферической крови лишь через 2-3 недели. Кроме того, при исследовании обычных мазков крови атипичные мононуклеары выявляются в 86% случаев, и только проведение лейкоконцентрации позволяет обнаружить их у больных. Также, в небольшом количестве атипичные мононуклеары могут наблюдаться при различных других инфекциях (цитомегаловирусной, герпетической VI типа, острых респираторных вирусных инфекциях, ветряной оспе, кори, инфекционных гепатитах, токсоплазмозе и др.). Кроме того, проведение клинического анализа крови является инвазивным, болезненным методом.

Таким образом, актуальной является разработка нового неинвазивного способа определения причины ангин. Обоснованным является исследование апоптоза лимфоцитов небных миндалин, так как известно, что в патогенезе вирусного поражения лежит повышенным апоптоз иммунокомпетентных клеток [Поляков В.Е. Инфекционный мононуклеоз (болезнь Филатова) у детей и подростков. // В.Е. Поляков, В.Н. Лялина, М.Л. Воробьева // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 1998, - с.50-54. Самохин П.А. Цитомегаловирусная инфекция у детей // М., «Медицина» 1987, с.7].

Достигаемым техническим результатом является определение этиологии ангин - бактериального генеза и при ИМ, что основано на определении относительного содержания мононуклеаров вступающих в апоптоз в соскобе с миндалин у детей.

1. Соскоб с поверхности небных миндалин производят с помощью одноразового стерильного зонда типа А. Полученный биоматериал помещают в одноразовую пластиковую коническую микроцентрифужную пробирку с крышкой на 1,5 мл типа «Эппендорф» и добавляют 1,0 мл изотонического 0,9% раствора хлорида натрия. Биоматериал в кротчайшие сроки доставляют в лабораторию при температуре 18-25°C. Время от забора материала до постановки реакции не должно превышать 6 часов.

2. Подсчет клеток, вступающих в апоптоз. Относительное количество мононуклеаров, вступивших в апоптоз, определяют с помощью Annexin V-FITC/7AAD Kit (фирма Beckman Coulter). На ранней стадии апоптоза целостность клеточной мембраны сохраняется, однако происходит перестройка ее фосфолипидных компонентов и на поверхности клетки появляется фосфатидилсерин. Аннексии V способен связываться фосфотидилсерином в присутствии кальция. Одновременное окрашивание клеток витальным ДНК-специфичным красителем 7 амино-актиномицина D (7AAD) позволяет дифференцировать клетки на ранних стадиях апоптоза (Annexin V+/7AAD-, ранний апоптоз) от клеток, уже погибших в результате апоптоза (Annexin V+/7AAD+, поздний апоптоз). Полученный биоматериал центрифугируют в течение 5 минут при 1500 об/мин. Отбирают надосадочную жидкость и ресуспендируют остаток в буфере, охлажденном до +4°C до конечной концентрации клеток 5×10⁶-10×10⁶ кл/мл. Пробирку помещают в ледяную баню. К 100 мкл клеточной взвеси добавляют 10 мкл Аннексина V-FITC и 20 мкл 7AAD. Полученную смесь инкубируют 15 минут при температуре таящего льда в темноте. Добавляют 400 мкл буфера, охлажденного до +4°C, и перемешивают на вортексе. Далее на проточном цитометре в течение 30 минут производят учет результатов исследования. Определяют относительное количество клеток окрашенных Аннексином V и не окрашенных 7AAD (ранний апоптоз).

3. Оценка результатов исследования. В соскобе с небных миндалин в норме у детей определяется до 15% мононуклеаров на ранних этапах апоптоза. При ангинах бактериального происхождения на первой неделе заболевания, в период разгара, содержание апоптотических мононуклеаров повышается и варьирует от 16 до 40%. При ИМ на первой неделе заболевания в период разгара относительное количество мононоклеаров, вступающих в апоптоз регистрируется в среднем в пределах от 57,5 до 63,2% (в целом 41% и более), в период стихания воспалительных явлений на второй-третьей неделе заболевания от 30,9 до 38,5%.

В соскобе с небных миндалин нами исследован клеточный состав и определено содержание мононуклеаров на ранних стадиях апоптоза у 40 детей от 3-х до 14 лет, в т.ч. у 30 детей с поражением и у 10 человек без поражения ротоглотки.

У всех детей с ИМ были типичные клинические проявления болезни, атипичные мононуклеары в крови и положительный Лаим-тест. Этиологическая расшифровка ИМ проводилась методами ИФА (IgM, IgG), ПЦР в крови, слюне, моче. Из 10 детей с диагнозом лакунарной ангины. В группу сравнения вошли 10 детей без клинических признаков ОРЗ, без гиперемии слизистых ротоглотки и миндалин.

Гиперемия слизистых ротоглотки (миндалин, дужек, мягкого неба, задней стенки глотки) в сочетании с гипертрофией миндалин II-III степени, а также наложения на миндалинах при ИМ встречались в 100% случаев. В общем анализе крови у всех детей отмечались лейкоцитоз (10,7±3,5 тыс), лимфо-моноцитоз (68±14,5%), в том числе атипичные мононуклеары 24±18,9%. У всех детей с диагнозом лакунарной ангины гипертрофия миндалин была II степени. В общем анализе крови у всех детей с лакунарной ангиной отмечался лейкоцитоз (13,6±4,9 тыс.) нейтрофильного характера (78±6,7%) со сдвигом влево.

При цитологическом исследовании соскоба с миндалин у всех детей, без поражения ротоглотки обнаружен полиморфный эпителий в больших количествах, а также единичные клетки (лимфоциты и нейтрофилы) в 2-4 полях зрения. При ИМ - полиморфный эпителий в большом количестве, а также большое количество лимфоидных элементов, среди которых встречались крупные, неправильной формы моноцитарные клетки с широкой базофильной протоплазмой и полиморфным ядром. При лакунарной ангине - полиморфный эпителий в больших количествах, значительное количество сегментоядерных нейтрофилов, остальные клетки были лимфоциты и моноциты.

Таблица 1
Содержание лимфоцитов и моноцитов, вступающих в апоптоз в соскобе с небных миндалин у детей (n=40)
Диагноз	Количество апоптотических клеток, %
Инфекционный мононуклеоз (n=20): период разгара	60,95±2,2
Инфекционный мононуклеоз (n=20): период реконвалесценции	33,5±3,3
Лакунарная ангина (n=10)	36,3±12,5
Группа сравнения (n=10)	8,6±2,6

Показатели апоптоза у детей с ангинами и без ангины представлены в таблице 1.

Таким образом, содержание в соскобе с небных миндалин мононуклеаров, вступающих в апоптоз менее 15% является низким, 16-40%, средним, 41% и более - высоким. При этом, низкий показатель определяется при физиологической норме, средний уровень клеток в раннем апоптозе характерен для периода разгара ангин бактериального генеза, при высоком показателе - 41% и более диагностируют период разгара при инфекционном мононуклеозе, т.е. при вирусном поражении миндалин.

Пример № 1

Олег Д., 5 лет поступил в клинику 14/X-2010 года с диагнозом: «Инфекционный мононуклеоз». Ребенок от I нормальной беременности, развивался нормально. Перенес коклюш, краснуху, ветряную оспу. ОРВИ болеет 6-7 раз в год. Болен с 12/X (первый день болезни), - поднялась температура до 38,5°C, сохранялась в последующие дни, появилась слабость, затруднение носового дыхания. На 3 день болезни направлен на госпитализацию.

При осмотре состояние среднетяжелое, лихорадит до 38,5°C, аппетит снижен. Ребенок вялый. Кожа бледная, чистая. Пальпируются увеличенные до 5,0 см шейные и тонзилярные лимфоузлы, подвижные, безболезненные. Носовое дыхание затруднено, в носовых ходах - слизь. В легких жесткое дыхание, хрипов нет. Тоны сердца звучные, ритмичные. Зев ярко гиперемирован, отечный, миндалины увеличены до II-III степени, в лакунах белые наложения, покрывающие всю миндалину. Живот мягкий, безболезненный при пальпации по ходу кишечника, печень выступает из-под края реберной дуги на 2 см, селезенка не пальпируется. Стул и диурез в норме. Лихорадка сохранялась до 4 дня болезни (до 15/X). 16/X (5 день болезни), ребенок был выписан домой под расписку. При осмотре оставались увеличенными шейные и тонзилярные лимфоузлы до 2 см, печень пальпировалась на 1 см ниже реберного края.

Анализ крови от 14/X (3 день болезни): НВ - 127 г/л, эр - 4,6·10¹² /л, л - 13,6·10⁹/л, п - 1%, с - 15%, л - 23%, м - 5%, тр - 230-10⁹/л, СОЭ - 20 мм/ч. Серологическое исследование сыворотки крови в динамике на грипп, парагрипп, адено-, PC-вирусы - отрицательно. Биохимический анализ крови 14/X: белок - 71 г/л; АлАТ - 256 ед/л, АсАТ - 86 ед/л. Общий анализ мочи от 14/X (3 день болезни) без патологических изменений. Посев из зева, носа на дифтерию от 14/X - отрицателен.

Посев с небных миндалин для исследования раннего апоптоза лимфоцитов (16/-XI) - 63,2%, что позволяет сделать вывод о наличии инфекционного мононуклеоза.

На основании клинико-лабораторных данных был поставлен диагноз: Инфекционный мононуклеоз.

Пример № 2

Анастасия Б, 13 лет поступила в клинику 6/Х-2010 года с диагнозом: «инфекционный мононуклеоз?». Ребенок от I нормальной беременности, протекавшей с угрозой прерывания. Роды срочные, физиологические. Вес при рождении 3550 г, длина - 54 см. На грудном вскармливании до 1 года, развивалась нормально, профилактические прививки получала по календарю. Перенесла ОРВИ, ветряную оспу; ангина. Больна с 5/X (первый день болезни), когда поднялась температура до 38,5°C, слабость, жаловалась на боль в горле. С 6/X (2 день болезни) - госпитализирована.

При осмотре состояние среднетяжелое, ребенок вялый, фебрильно лихорадит до 38,5°C, аппетит снижен. Кожа бледная, чистая от сыпи. Носовое дыхание затруднено. Пальпируются единичные шейные и тонзилярные лимфоузлы, подвижные, безболезненные. Редкое покашливание. В легких жесткое дыхание, хрипов нет. Тоны сердца звучные, ритмичные. Зев гиперемирован, отечный, миндалины увеличены до II степени, в лакунах белые наложения. Живот умерено болезненный при пальпации, печень и селезенка не пальпируется. Боль при мочеиспускании. Стул в норме. На фоне антибактериальной терапии (цефазолин 500 тыс. X 2р/д в/м, № 5) на 6 день болезни ребенок был выписан домой в удовлетворительном состоянии на амбулаторное долечивание.

Анализ крови 6/X (2 день болезни): НВ - 130 г/л, эр - 4,2·10 ¹²/л, л - 11,5·10⁹/л, п - 4, с - 74, л - 13, м - 9, тр - 265·10⁹/л, СОЭ - 25 мм/ч. Посев из зева, носа на дифтерию от 6/X - отрицателен. Посев с небных миндалин для исследования раннего апоптоза лимфоцитов от 6/X - 19%, что позволяет сделать вывод о наличии ангины бактериального происхождения.

На основании клинико-лабораторных данных был поставлен диагноз: лакунарная ангина.