способ определения антител к mycobacterium leprae

Формула изобретения

Способ определения антител к Mycobaterium leprae, состоящий выявлении в сыворотках крови антител к Mycobaterium leprae, отличающийся тем, что для определения специфических антител к Mycobaterium leprae в реакции латекс-агглютинации используют тест-антиген в концентрации 28 мкг/мл для сенсибилизации 1,4% суспензии полистироловых латексных частиц с аминогруппами 2 мг-экв/мл, диаметром 0,62 мкм в течение 8 ч при комнатной температуре и 18 ч при температуре 8°C, полученный ультразвуковой дезинтеграцией при 18 кГц в течение 30 мин из культивируемых в условиях термостата на среде Левенштейна-Йенсена в течение 7 суток при температуре 37°C Mycobaterium lufu, за положительный результат принимают пробы сывороток крови, вызывающих агглютинацию сенсибилизированных частиц латекса.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к лепрологии, и может быть, в частности, использовано для определения антител к Mycobaterium leprae (M.leprae).

Из практики медицины известен способ определения антител к M.leprae с применением твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), где в качестве тест-антигена используются водорастворимые белки микобактерий из лепром человека (Alonso S.M., Mangiaterra M.L., Szarfman A. La reaccion de immunoperoxidasias indirecta aplicata a la lepra humana // Medicina (Argent). - 1978. - Vol.38. - N 63. - P.541-544.)

Способ позволяет обнаруживать антитела к M.leprae и осуществлять контроль динамики гуморального иммунного ответа у больных лепрой.

Недостатком способа является сложность его осуществления, заключающаяся в необходимости использования специальных методов выделения и очистки антигена M.leprae из кожных биоптатов больных лепрой людей с использованием лабораторного оборудования, травматичность метода получения антигенного материала. Кроме этого, необходимо учитывать, что даже при распространенных процессах концентрации M.leprae в кожных лепромах больных лепроматозной лепрой для получения антигенного препарата недостаточно, что не дает возможность получить технический результат - упрощение способа.

Из практики медицины известен также способ определения антител к M.leprae, состоящий в обнаружении антител к M.leprae в сыворотке крови человека экспресс-методом на основе микротитрационного варианта реакции латекс-агглютинации с использованием в качестве антигенного диагно-стикума полиакролеиновых латексных частиц (диаметр 1,4 мкм), модифицированных -(3-aminoprolm 3,6-di-O-methylglucopiranozide) - синтетическим аналогом специфического углеводного эпитопа M.leprae - фенольного глико-липида-1(ФГЛ-1). (Дячина М.Н., Лукин Ю.В., Зубов В.П., Бовин Н.В. Микротитрационный вариант реакции латекс-агглютинации в диагностике лепры // Клин. лабор. диагностика.- М., Медицина, 1995. - № 2. - С.24-26). Использование известного способа позволяет выявлять антитела к M.leprae в сыворотках крови больных лепрой. Уровни антител коррелируют со степенью активности лепрозного процесса.

Недостатком известного способа является сложность его осуществления, заключающаяся в том, что данная тест-система выявляет антитела лишь к ФГЛ-1, а антитела к данному антигену быстро исчезают под влиянием специфического лечения и через 1-1,5 года после начала химиотерапии их определение становится невозможным, в то время как у большинства больных лепрой в эти сроки отмечается присутствие M.leprae в коже и выявляются антитела в сыворотке крови к другим антигенным компонентам M.leprae. К недостаткам способа также относится длительность проведения данного способа (учет результатов через 2 часа) и необходимость использования планшетов для иммунологических реакций. Получение синтетического антигена требует специальных методических приемов и персонала соответствующей квалификации, что не дает возможность получить технический результат - упрощение способа.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения антител к M.leprae методом ИФА, которым в сыворотке крови определяют антитела к M.leprae с помощью Dis-BSA, который является полусинтетическим аналогом специфического углеводного эпитопа M.leprae - фенольного глико-липида-1 (ФГЛ-1) методом твердофазного ИФА (Cho S.N., Fujiwara Т., Hunter S.W., Rea Т.Н., Gelber R.H., Brennan P.J. Use of an artifical antigen containing the 3,6-di-O-methyl- -O-glycopyranosyl epitope for the serodiagnosis of leprosy // J. Infect. Dis, 1984. - Vol.140. - P.311-322). Способ позволяет выявлять в сыворотках крови больных лепрой антитела к видоспецифическому антигену M.leprae - ФГЛ-1. Уровень антител коррелирует с клиническими проявлениями болезни.

Недостатками способа являются:

- сложность осуществления органического синтеза искусственного антигена Dis-BSA, поскольку требуется специальное оснащение и персонал соответствующей квалификации;

- ограниченные возможности тест-системы, связанные с выявлением антител лишь к ФГЛ-1, а антитела к данному антигену быстро исчезают под влиянием специфического лечения, через 1-1,5 года после начала химиотерапии они не определяются, в то время как у большинства больных лепрой в эти сроки отмечается присутствие M.leprae в коже и выявляются антитела в сыворотке крови к другим антигенным компонентам M.leprae;

- постановка ИФА осуществляется в течение 22-24 часов;

- необходимость наличия сложного специального оборудования;

- невозможность применения в полевых условиях.

Перечисленные недостатки не дают возможность получить конкретный технический результат - упрощение способа.

Известный способ принят авторами в качестве прототипа. Сходство предлагаемого способа с известным заключается в том, что они оба относятся к медицине, а именно к лепрологии, и основаны на выявлении в сыворотках крови антител к M.leprae.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа определения антител к M.leprae, основанного на упрощенном определении специфических антител к M.leprae в сыворотках крови, позволяющего сократить время постановки анализа и проводить исследования в полевых условиях.

Сущность предлагаемого изобретения выражена совокупностью существенных признаков, обеспечивающих достижение положительного результата.

Поставленная задача в изобретении достигается тем, что для определения специфических антител к Mycobaterium leprae в реакции латекс-агглютинации используют тест-антиген в концентрации 28 мкг/мл для сенсибилизации 1,4% суспензии полистироловых латексных частиц с аминогруппами 2 мг-экв/мл, диаметром 0,62 мкм в течение 8 часов при комнатной температуре и 18 часов при температуре 8ºС, полученный ультразвуковой дезинтеграцией при 18 кГц в течение 30 минут из культивируемых в условиях термостата на среде Левенштейна-Йенсена в течение 7 суток при температуре 37ºС Mycobaterium lufu (M.lufu). Штамм M.lufu предоставлен в 1981 году НИИ по изучению лепры проф. J.K.Seydel (ФРГ).

Применение M.lufu в качестве тест-антигена в реакции латекс-агглютинации является существенным отличием в подходе к определению антител к M.leprae и именно это отличие позволило получить положительный технический результат в виде упрощения способа. Кроме того, предлагаемый способ позволяет отказаться от использования сложной аппаратуры и дорогостоящих реактивов, а также привлечения квалифицированного персонала, владеющего методами органического синтеза веществ. Способ легко выполним в полевых условиях, позволяет сократить сроки визуального учета результатов до 20-30 минут.

Одной из основных задач современной лепрологии является разработка тестов, позволяющих диагностировать заболевание на ранней стадии его развития, когда клинические проявления слабо выражены или отсутствуют, осуществлять контроль за качеством проводимой терапии, а также выявлять группы риска заболевания среди лиц, находящихся в тесном семейном контакте с больными лепрой или проживающих в эндемических по лепре районах. Однако до настоящего времени не существует сертифицированных тест-систем, позволяющих осуществлять серологическую диагностику лепры. Диагностика лепры осуществляется комплексно на основании клинических проявлений заболевания и оценки гистологической картины кожных поражений.

Существующие тест-системы не используются для постановки диагноза лепры, а применяются лишь для оценки эффективности проводимой специфической терапии и доклинического определения возникновения рецидивов заболевания у больных лепрой. Это связано с тем, что не только у больных лепрой, но и у доноров крови определяются антитела к антигенам M.leprae. У доноров крови они определяются как к комплексным антигенам (соникатам M.leprae, M.lufu), так и к специфическим антигенам - фенольному гликолипиду-1 (ФГЛ-1) и его синтетическому аналогу - Dis-BSA. Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Для получения тест-антигена используют штамм M.lufu. Культивирование M.lufu проводят в условиях термостата на среде Левенштейна-Йенсена в течение 7 суток при температуре 37ºC. Бактериальную массу со среды снимают бактериологической петлей и переносят в пробирку с дистиллированной водой, тщательно перемешивают пипетированием для получения гомогенной взвеси. Микобактерии подвергают ультразвуковому разрушению на аппарате MSE-100 (Англия) в течение 30 минут при частоте 18 кГц. Суспензию разрушенных микобактерий центрифугируют при 3000 оборотах в минуту в течение 15 минут. Надосадочную жидкость собирают и используют в качестве сенситина латексных частиц. Концентрация белка по Лоури (Low-ry O.H., Rosebrough N.J., Fair L., Randall R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol.l93, № 1. - Р.265-275) в ультразвуковом дезинтеграте M.lufu - 200 мкг/мл.

Для приготовления латекс-диагностикума используют 10% латекс полистироловый с аминогруппами, концентрация аминогрупп - 2,0 мг-экв/мл, диаметр частиц - 0,62 мкм, (000 «Диафарм», г. Санкт-Петербург).

100 мкл 10% латекса помещают в 1 мл глицинового буфера pН 8,8. Глициновый буфер готовят следующим образом: глицин 2 М 46,7 мл + NaOH 1М 10,0 мл + физиологический раствор (pН 7,0-7,2) 56,7 мл. Отмывку латексных частиц проводят глициновым буфером путем трехкратного центрифугирования при 6000 оборотов в минуту в течение 5 минут. К осадку частиц латекса вносят 200 мкл ультразвукового дезинтеграта M.lufu и 0,5 мл глицинового буфера. Полученную смесь латексных частиц суспендируют с антигеном из M.lufu и инкубируют при комнатной температуре в течение 8 часов, затем при температуре 8°C в течение 18 часов. Объем диагностикума доводят до 6 мл глициновым буфером и используют при постановке реакции латекс-аггютинации на предметных стеклах. Постановку осуществляют следующим образом: на предметное стекло наносят каплю (25-30 мкл) исследуемой сыворотки и каплю буфера в качестве отрицательного контроля. В капли на предметном стекле добавляют по капле латекс-диагностикума. Полученную смесь перемешивают встряхиванием (легкое постукивание о край предметного стекла) в течение 1-2 минут. Учет результатов реакции производят через 20-30 минут. За положительный результат принимают пробы сывороток крови, вызывающих агглютинацию сенсибилизированных частиц латекса. Степень агглютинации оценивают по 4-плюсовой системе.

Для выполнения иммуноферментного анализа используют антиген Dis-BSA. Антиген Dis-BSA получен из банка ВОЗ по программе «IMMLEP» M.LEPRAE BANK. Постановку ИФА осуществляют на полистироловых планшетах для иммуноферментного анализа однократного применения («Медполимер», г. Санкт-Петербург, ТУ 64-2-375-86). Лунки полистиролового планшета сенсибилизируют антигеном Dis-BSA в 0,1 М карбонат-бикарбонатном буфере pН 9,25±0,25 из расчета 10 мкг/мл в объеме 0,1 мл на 1 лунку (18 часов при +4°C). Затем планшет отмывают 3 раза 0,02 М фосфатно-солевом буфере (pН 7,3-7,4) с добавлением 0,05% твина-20 и 3 раза дистиллированной водой с помощью автоматического промывателя планшет (ПП2 428, г.Дубна). После этого в лунки планшета заливают по 0,1 мл 1% раствора бычьего сывороточного альбумина в 0,02 М фосфатно-солевым буфером (pН 7,3-7,4) и выдерживают 1 час при 37°C. Планшет отмывают, как указано выше. В лунки планшета вносят исследуемые сыворотки больных лепрой, туберкулезом и здоровых доноров. Сыворотки разводят 0,02 М фосфатно-солевым буфером (pН - 7,4) с 0,05% твином-20 до 1:400. Каждый образец сыворотки в объеме 0,1 мл вносят в 2 лунки (в дубле). Отрицательным контролем служат 4 лунки с 0,02 М фосфатно-солевым буфером (pН - 7,4) с 0,05% твином-20. Планшет инкубируют при 37°C 1 час, после чего повторяют процесс отмывки 0,02М фосфатно-солевым буфером с 0,05% твином-20. Затем в каждую лунку добавляют по 0,1 мл конъюгата кроличьих антител к IgG человека, меченых пероксидазой хрена («Mere», Германия) в разведении 1:2000 и инкубируют 1 час при 37°C. После пятикратной отмывки 0,02 М фосфатно-солевым буфером (pН - 7,4) с 0,05% твином-20 и дистиллированной водой в лунки вносят раствор субстратной смеси - 4 мг ортофенилендимина (ОАО «Шосткинский завод химических реактивов») и 20 мкл 30% H₂O ₂ в 10 мл цитратно-фосфатного буфера рН 5,0. Планшет выдерживают при комнатной температуре в темноте 20 мин, после чего ферментативную реакцию останавливают внесением 0,05 мл 2М H₂SO ₄.

Учет результатов осуществляется с помощью фотометра иммуноферментного планшетного (ЭФОС 9305 ОАО « МЗ «Сапфир») при длине волны 492 нм.

За положительный результат считают образцы сывороток крови, показатель оптической плотности (ОП₄₉₂) которых превышал в 2,1 раза величину оптической плотности отрицательного контроля (0,02 М фосфатно-солевой буфер pН - 7,4 с 0,05% твином-20), и составляет более 0,15.

Изложенная сущность изобретения поясняется таблицами, где представлены результаты реакции латекс-агглютинации и твердофазного ИФА сывороток крови больных лепрой, больных туберкулезом и доноров крови.

Таблица 1
Результаты реакции латекс-агглютинации и твердофазного ИФА сывороток крови больных лепрой
п/п	№ истории болезни	Диагноз	Латекс-агглютинация (АГ-УЗД M.lufu)	ИФА (АГ-Dis-BSA) ОП492
1	2	3	4	5
1	3845	LLs	+	0,80
2	3854	LLs	+	0,34
3	3853	LLs	+	0,26
4	3489	LLs	-	0,58
5	2983	LLs	+	0,31
6	2662	LLs	+	0,35
7	2985	LLs	+	0,64
8	3090	LLp	-	0,44
9	2294	BB	-	0,54
10	3873	LLs	-	0,27
11	3886	LLs	-	0,66
12	1776	LLs	-	0,49
13	3206	LLs	-	0,54
14	3288	LLp	-	0,84
15	2498	I	+	0,26
16	3849	BL	-	0,41
17	3897	BL	+++	1,10
18	3273	LLs	+	1,10
19	1068	LLs	+	0,23
20	3273	LLs	-	0,01
21	2628	LLs	++	0,24
22	2905	BL	-	0,60
23	1664	BL	-	0,20
24	1668	LLs	+	0,29
25	2498	I	+	0,01
26	2978	LL	-	0,18
27	2844	LLs	+	0,18
28	2690	LLp	+	0,40
29	3788	TT	-	0,34

1	2	3	4	5
30	3781	LLs	-	1,10
31	1991	LLs	-	0,56
32	3290	LLs	-	0,88
33	3118	I	-	0,05
34	3876	LLs	++	0,63
35	3213	LLs	-	0,50
36	2556	LLs	-	0,62
37	3828	LLs	-	0,79
38	3645	LL	+	0,43
39	1813	LLs	+	0,12
40	3897	BL	++++	2,18
41	3376	LL	+	0,50
42	1668	LLs	+	0,20
43	3290	LLs	++	0,97
44	3828	LLs	++	0,41
45	1963	BL	++	0,29
46	2905	BL	+	0,34

Примечание: LL - лепроматозный тип лепры; LLp - полярный лепроматозный тип лепры; LLs - субполярная лепроматозная форма лепры; BL - погранично-лепроматозная форма лепры; ВВ - пограничная форма лепры; ТТ- туберкулоидный тип лепры; I - недифференцированная форма лепры.

Из таблицы 1 видно, что у больных лепрой в реакции латекс-агглютинации обнаружены специфические антитела к M.leprae в 25 образцах сывороток крови, что составляет 54,3%. В ИФА специфические антитела к M.leprae выявлены в 42 образцах сывороток крови, что составляет 91,3%.

Таблица 2
Результаты реакции латекс-агглютинации и твердофазного ИФА сывороток крови больных туберкулезом
п/п	№ истории болезни	Диагноз	Латекс-агглютинация (АГ-УЗД M.lufu)	ИФА (АГ-Dis-BSA) ОП492
1	2	3	4	5
1	168	инфильтративный туберкулез	+	1,2
2	188	инфильтративный туберкулез	+	0,46

1	2	3	4	5
3	183	инфильтративный туберкулез	-	0,44
4	139	инфильтративный туберкулез	-	0,43
5	97	инфильтративный туберкулез	-	0,95
6	210	инфильтративный туберкулез	-	0,13
7	172	инфильтративный туберкулез	-	0,35
8	135	диссеминированный туберкулез	+	1,16
9	237	диссеминированный туберкулез	-	0,7
10	309	инфильтративный туберкулез	-	0,12
11	913	инфильтративный туберкулез	-	1,15
12	926	цирротический туберкулез	-	0,33
13	941	инфильтративный туберкулез	-	0,2
14	3579	диссеминированный туберкулез	+	0,21
15	341	инфильтративный туберкулез	-	0,6
16	1038	диссеминированный туберкулез	-	0,71
17	798	фиброзно-кавернозный туберкулез	-	0,19
18	503	фиброзно-кавернозный туберкулез	-	0,2
19	712	фиброзно-кавернозный туберкулез	+	0,72
20	1033	хронический сальпингооофорит	-	1,04
21	962	туберкулома	-	0,07
22	5409	инфильтративный туберкулез	-	0,48
23	5463	инфильтративный туберкулез	-	1,0

1	2	3	4	5
24	9455	инфильтративный туберкулез	-	1,99
25	1222	инфильтративный туберкулез	-	0,06
26	4056	диссеминированный туберкулез	-	0,71
27	147	кавернозный туберкулез	-	0,83
28	6463	инфильтративный туберкулез	-	0,4
29	848	инфильтративный туберкулез	-	0,9
30	9445	состояние после резекции по поводу туберкуломы легкого	-	0,07
31	5449	клиническое излечение после перенесенного туберкулеза легких	-	1,05
32	4302	инфильтративный туберкулез	-	0,48

Из таблицы 2 видно, что у больных туберкулезом в реакции латекс-агглютинации обнаружены специфические антитела к M.leprae в 5 образцах сывороток крови, что составляет 15,6%. В ИФА специфические антитела к M.leprae выявлены в образцах сывороток крови от 27 больных туберкулезом, что составляет 84,4%.

Таблица 3
Результаты реакции латекс-агглютинации и твердофазного ИФА сывороток крови доноров
п/п	№ сыворотки	Латекс-агглютинация (АГ-УЗД М.lufu)	ИФА (АГ-Dis-BSA) ОП492
1	2	3	4
1	100926	-	0,15
2	200672	-	0,01
3	300520	-	0,67
4	100616	-	1,30
5	400541	-	0,64

1	2	3	4
6	300529	-	0,79
7	203990	-	0,90
8	103819	-	0,80
9	100617	-	0,01
10	400538	-	0,90
11	204002	-	0,48
12	302842	-	0,70
13	370885	-	0,52
14	436166	-	0,13
15	193578	-	0,8
16	290504	-	0,11
17	370878	-	0,45
18	290508	-	0,3
19	125008	-	0,12
20	193551	-	0,63
21	125009	-	0,44
22	290496	-	0,24
23	193564	-	0,14
24	290383	-	0,81
25	193417	-	0,83
26	193412	-	0,38
27	193408	-	0,13
28	290361	-	0,25
29	290372	-	1,09
30	290381	-	0,36

Из таблицы 3 видно, что у доноров крови в реакции латекс-агглютинации специфические антитела к M.leprae не обнаружены. В ИФА специфические антитела к M.leprae выявлены в образцах сывороток крови от 22 доноров крови, что составляет 73,3%.

Приведенные данные показывают, что использование реакции латекс-агглютинации с антигеном из M.lufu дает возможность определять специфические антитела к M.leprae при исследовании сывороток крови больных лепрой, в то время как в сыворотках крови доноров антитела к M.leprae предлагаемым способом не обнаруживаются, в отличие от ИФА, где в качестве сенситина применяется Dis-BSA.

Определение специфических антител к M.leprae у больных туберкулезом с помощью реакции латекс-агглютинации не является свидетельством заболевания лепрой и может быть исключено другими клинико-лабораторными методами обследования.

Таким образом, предлагаемый способ упрощает определение антител к M.leprae по сравнению с прототипом и может быть использован как в стационарных лабораториях, так и в полевых условиях.

Предлагаемый способ прошел успешную апробацию в ФГБУ «НИИЛ» Минздравсоцразвития России в 2010-2011 годах. Исследованы 46 образцов сывороток крови от 41 больного лепрой, 32 больных туберкулезом (группа сравнения) и 30 доноров крови (контрольная группа).

Ниже приводятся результаты апробации способа.

Пример 1.

Больной М.В.М. (и/б № 3897) впервые поступил в ФГБУ «НИИЛ» Минздравсоцразвития России 02.03.2009 года. Диагноз: погранично-лепроматозная форма лепры (BL).

В день обследования 12.09.2011 г. лепрозный процесс на кожном покрове носит активный характер, медленно регрессирует. Инфильтрация на коже груди и живота носит поверхностный характер. На спине и поясничной области инфильтрация кожи более выражена.

Гистологическое исследование кожи: атрофия эпидермиса. В дерме вокруг сосудов и придатков кожи определяются инфильтраты, состоящие в основном из крупновакуолизированных макрофагов и лимфоцитов. Встречаются тучные клетки и полинуклеарные лейкоциты. В цитоплазме отдельных макрофагов обнаружены единичные зернистые M.leprae и кислотоустойчивые зерна. Заключение: регрессирующие инфильтраты погранично-лепроматозной структуры, содержащие единичные M.leprae.

Серологическое обследование от 12.09.2011 г. № 8492 выявило в ИФА наличие антител к специфическому антигену M.leprae - Dis-BSA. Показатели ОП₄₉₂-1,1 (норма ОП ₄₉₂ до 0,15).

Постановку латекс-агглютинации осуществляют следующим образом:

на предметное стекло наносят каплю (25-30 мкл) исследуемой сыворотки и каплю буфера в качестве отрицательного контроля. В капли на предметном стекле добавляют по капле латекс-диагностикума. Полученную смесь перемешивают встряхиванием (легкое постукивание о край предметного стекла) в течение 1-2 минут. Учет результатов реакции производят через 20-30 минут.

Реакция латекс-агглютинации с тест-антигеном из разрушенных ультразвуком M.lufu положительная (+++).

Таким образом, у 6-го М.В.М. на момент обследования положительные результаты ИФА и латекс-агглютинации на наличие в сыворотке крови антител к M.leprae совпадают.

Пример 2.

Больной М.Б.Н. (и/б № 3118) впервые поступил в ФГБУ «НИИЛ» Минздравсоцразвития России 10.06.63 года. Диагноз: недифференцированная форма лепры (I).

В день обследования 22.08.2011 г. Лепрозный процесс в стадии регресса. Кожный покров чист, свободен от активных проявлений лепры. Бактериоскопические исследования с 1964 года отрицательные.

Серологическое обследование от 22.08.2011 г. № 8469 не выявило в ИФА наличие антител к специфическому антигену M.leprae - Dis-BSA. Показатели ОП₄₉₂-0,05 (норма ОП₄₉₂ до 0,15).

Постановку латекс-агглютинации осуществляют аналогично примеру № 1. Реакция латекс-агглютинации с тест-антигеном из разрушенных ультразвуком M.lufu отрицательная (-).

Таким образом, у 6-го М.Б.Н. на момент обследования отрицательные результаты ИФА и латекс-агглютинации совпадают и свидетельствуют об отсутствии в сыворотке крови антител к M.leprae.

Предлагаемым способом достигается упрощение определения антител к M.leprae, заключающееся в том, что нет необходимости синтеза искусственного антигена, поскольку используют культивируемые M.lufu для получения тест-антигена; сокращаются сроки с 22-24 часов до 20-30 минут по сравнению с прототипом; устраняется многоэтапность и трудоемкость проведения анализа; для постановки анализа не используется сложное, дорогостоящее оборудование.

Предлагаемый способ может быть рекомендован в качестве дополнительного теста при диагностике лепры для использования в научных и клинических лабораториях противолепрозных учреждений системы здравоохранения, а также при проведении массовых обследований в полевых условиях.