способ дифференциальной диагностики геморрагического и ишемического типов инсультов

Формула изобретения

Способ дифференциальной диагностики геморрагического и ишемического типов инсультов в остром периоде, отличающийся тем, что определяют количество низкомолекулярной фракции ДНК, сравнивая в течение суток электрофореграммы, полученные из плазмы крови больных, со стандартами известной концентрации, и при выявлении количества 80-87 нг/мл низкомолекулярной ДНК через 3 ч после начала острого инсульта диагностируют геморрагический тип инсульта, при обнаружении 80-87 нг/мл низкомолекулярной ДНК через сутки после начала острого инсульта - диагностируют ишемический тип инсульта.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к неврологии и нейрохирургии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики геморрагического и ишемического типов инсультов.

Согласно определению ВОЗ /1973/, мозговой инсульт - быстро возникающие очаговые или общемозговые нарушения функций мозга с продолжительностью симптомов 24 часа и более или приводящие к смерти в отсутствие явных других причин, кроме сосудистых. По характеру поражения выделяют 2 основные типа инсульта: ишемический - инфаркт определенного участка мозга в результате внезапного нарушения его кровоснабжения, и геморрагический - спонтанное /нетравматическое/ кровоизлияние в мозг. Медико-социальная значимость инсультов определяется высоким уровнем смертности заболевших, значительной инвалидизацией и социальной дезадаптацией выживших больных. Исход развившегося инсульта во многом определяется своевременностью и адекватностью лечения, которое включает комплекс неотложных лечебных мероприятий, кардинально различающихся у больных с ишемическим и геморрагическим инсультом. Для проведения адекватной дифференцированной терапии исключительно важна ранняя точная дифференциальная диагностика ишемического и геморрагического инсультов в острейшем периоде - первые часы и 3-5 дней с момента заболевания.

С целью уточнения характера развившегося мозгового инсульта в острейшем периоде заболевания кроме традиционного анализа клинико-анамнестических данных применяются компьютерная томография, а также лабораторные исследования спинномозговой жидкости /ликвора/ и крови больных: спектрофотометрирование ликвора /Скочий П.Г., Андриюк Л.В./. Диагностическое значение спектрофотометрии спинномозговой жидкости больных при острых нарушениях мозгового кровообращения //Журнал неврологии и психиатрии. - 1987, - № 1. - С.39-42/, определение активности некоторых ферментов в эритроцитах крови больных / Бердический М.Я., Сторожук П.Г., Иманаха К.К./. Значение исследований некоторых эритроцитарных ферментов в определении характера инсульта в острейшем периоде // Журнал невропатологии и психиатрии. - 1990, - N 7. - С.29-31/.

Известен способ дифференциальной диагностики ишемического и геморрагического инсульта в острейшем периоде (Патент на изобретение RU № 2175446 МПК G01N 33/52). Способ заключается в том, что проводят инфракрасную спектроскопию крови больных, определяют коэффициенты пропускания и при значениях коэффициентов пропускания в диапазоне длин волн 2120- 1610 см-1 от 0,2 до 0,4% диагностируют ишемический инсульт, а при значениях 44,4-53,1% - геморрагический.

Недостатком известных способов является то, что они представляют собой довольно длительный и дорогостоящий процесс, являющийся самостоятельным стоятельным научным исследованием, не позволяющим оперативно решать актуальный для клинической практики вопрос идентификации характера развившегося мозгового инсульта с целью проведения неотложной дифференцированной терапии.

Цель изобретения ускорить и удешевить процесс диагностики, расширить арсенал средств дифференциальной диагностики,

Цель достигается тем, что определяют количество низкомолекулярной фракции ДНК, сравнивая в течение суток электрофореграммы, полученные из плазмы крови больных, со стандартами известной концентрации, и при выявлении количества 80-87 нг/мл низкомолекулярной ДНК через 3 часа после начала острого инсульта диагностируют геморрагический тип инсульта, при обнаружении 80-87 нг/мл низкомолекулярной ДНК через сутки после начала острого инсульта - диагностируют ишемический тип инсульта.

Способ реализуют следующим образом. Определяют количество низкомолекулярной фракции ДНК, сравнивая в течение суток электрофореграммы, полученные из плазмы крови больных, со стандартами известной концентрации, и при выявлении количества 80-87 нг/мл низкомолекулярной ДНК через 3 часа после начала острого инсульта диагностируют геморрагический тип инсульта, при обнаружении 80-87 нг/мл низкомолекулярной ДНК через сутки после начала острого инсульта - диагностируют ишемический тип инсульта.

Одним из простых объяснений появления внеклеточных нуклеиновых кислот в крови могут быть постоянно идущие в организме процессы отмирания клеток и деградации их хроматина. Таким образом, в первую очередь источником внеклеточной ДНК крови может быть некроз [Rainer Т.Н., Lo Y.M., Chan L.Y... et al. Derivation of a prediction rule for posttraumatic organ failure using plasma DNA and other variables. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2001; 945: 211-220] или апоптоз ядросодержащих клеточных элементов крови или эндотелиальных клеток [Jahr S., Hentze Н., Englisch S., et al. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells. Cancel Res. 2001; 61: 1659-1665]. Апоптоз - наиболее широко представленная форма программируемой клеточной смерти, которая приводит к ежедневной гибели части клеток. Примерный подсчет показывает, что в организме человека в результате апоптоза деградирует 1-10 г ДНК в сутки. Апоптотические клетки и апоптотические тельца поглощаются и перевариваются макрофагами, дендритными или эндотели-альными клетками [Nagata S. Apoptotic DNA fragmentation. Exp. Cell. Res. 2000; 256: 12-28]. Возможно, часть апоптотических телец избегает этой участи и попадает в кровь.

Известен способ исследования внеклеточной ДНК нуклеосом в сыворотке крови [Holdenrieder S., Stieber P., Bodenmuller H., Fertig G., Furst H., Schmeller N., Untch M, Seidel D. Nucleosomes in serum as a marker for cell death. Clin. Chem. Lab. Med. 2001. V.39. N.7. C.596-605], который предполагает использование набора для определения Cell Death Detection-ELISAplus фирмы Roche Diagnostics (Манхейм, Германия) ( № 1774425) и включает инкубацию образцов сыворотки с иммунореагентами в панелях, покрытых стрептовидином. В течение инкубации антитела, выработанные на гистоны, реагируют с гистоновым компонентом нуклеосом. Комплекс связывается с биотиновым компонентом панели. Кроме того, антитела к ДНК, меченные пероксидазой, связывают ДНК нуклеосом. Несвязавшиеся за время инкубации компоненты отмываются, количество нуклеосом учитывается по восстановлению перок-сидазы в иммунокомплексе. Добавляется субстрат, реагирующий с пероксидазой, в результате развивается окраска, количество которой оценивается фотометрически при длине волны 405 нм.

Метод широко применяется в клинике [Holdenrieder S., Stieber P. Clinical use of circulating nucleosomes. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 2009. V.46. P.10-24] при различных заболеваниях, в механизм патогенеза которых вовлечен процесс апоптоза: позволяет исключить получение ложноположительных результатов и, в значительной мере, ложноотрицательных результатов. Метод применяется для определения повышения концентрации циркулирующих нуклеосом при различных видах рака, при острых состояниях, таких как инсульт, травма, сепсис, при иммунных заболеваниях, при цитотоксической терапии рака, особенно для оценки эффективности терапии.

Недостатком способа является необходимость приобретать дорогостоящие наборы для определения Cell Death Detection-ELISA^plus фирмы Roche Diagnostics (Манхейм, Германия) ( № 1774 425). Кроме того, способ не позволяет объективно визуализировать результаты исследования, тем самым допуская ошибки персонала, проводящего исследование. Следует отметить, что способ требует построения калибровочной кривой, позволяя фиксировать результаты только заданного диапазона различий, и не дает возможности фиксировать результаты, отличающиеся от ожидаемых, что также может привести к ошибкам. Перечисленные недостатки снижают диагностическую ценность метода.

Приводим пример конкретной реализации способа.

В таблице представлена динамика содержания фракции низкомолекулярной ДНК плазмы крови больных в остром периоде инсульта (нг/мл) у больных с геморрагическим и ишемическим типами инсульта.

На рис.1 представлена электрофореграмма препаратов ДНК плазмы крови больных с инсультами.

Пример:

Методом венепункции в пробирки, содержащие в качестве детергента 0,5 М ЭДТА (pH 7,3) взяли по 3 мл крови у 2 человек:

1 - больная Ш., 77 лет, 3 ч после начала острого инсульта;

2 - больной Г., 68 лет, 3 ч после начала острого инсульта. Плазму крови получают центрифугированием 900 g в течение 10 мин. при комнатной температуре. Для полного удаления форменных элементов кровь центрифугируют дважды при 2200 g. Нуклеиновые кислоты выделяют методом фенольной депротеинизации [Маниатис Т., 1982]. Для этого к отмеренному объему плазмы крови приливают 10 мл свежеперегнанного водонасыщенного фенола. Затем пробирку помещают в ротационную качалку и в течение 10 мин. покачивают в мягком режиме, после чего добавляют 1 мл хлороформа и процедуру покачивания повторяют. Экстракты нуклеиновых кислот отбирают пипеткой и центрифугируют 15 мин. при 12000 g и 4°C. Верхнюю (водную) фазу отделяют и к ней добавляют смесь 80% раствор фенола (из расчета 0,5 объема фенола на 1 мл плазмы). Смесь покачивают 10 мин. при комнатной температуре, а затем центрифугируют в течение 10 мин. при 12000 g и 4°C. Процедуру депротеинизации проделывают дважды. Нуклеиновые кислоты осаждаются двойным объемом охлажденного (до - 20°C), перегнанного и подкисленного 95% этанола (0,4 мл ледяной уксусной кислоты на 1 л этанола) в течение ночи при - 20°C. Осадок уплотняют центрифугированием в течение 15 мин. при 12000g и 4°C. Над осадочную жидкость (этанол) аккуратно сливают, удаляя хроматографической бумагой остатки спирта с верхней части пробирок. Осадки подсушивают в течение 5 мин., нуклеиновые кислоты растворяют в деионизированной воде, из расчета 2 мкл на 1 мл плазмы крови. Перед проведением электрофореза в каждую исследуемую пробу вносят 1 мкл раствора панкреатической РНКазы для удаления РНК и инкубируют в течение 15 мин. при 37°С. Раствор панкреатической РНКазы для инактивации возможных примесей ДНКазы предварительно прогревают в течение 15 мин. при 100°C, а затем медленно охлаждают до комнатной температуры. Электрофорез проводят в пластинах градиентного 2/16% полиакриламидного геля размером 80×80×3 мм³. Перед нанесением проб пластины с гелем подвергают предварительному электрофорезу при комнатной температуре в течение 2 ч, силе тока 20 мА на пластину и напряжении не более 100 В. В каждую лунку наносят по 15 мкл исследуемого материала. В качестве стандартов для проведения электрофореза используют рестрикты PBR322/BSPR1 и лямбда/Alul, наносимые в количестве 1 мкг/мл, они служат стандартами не только для определения величины молекул, но и для определения концентрации исследуемой фракции ДНК. После завершения электрофореза гели окрашивают бромидом этидия. Гели фотографируют в проходящем УФ на пленку микрат 300 при диафрагме 4, выдержке 10-30 с и красном светофильтре. Слайды сканируют, содержание ДНК определяют путем сравнения со стандартами.

У больной Ш. было выявлена следующая динамика количества низкомолекулярной ДНК в сыворотке крови (нг/мл): через 3 часа - 46, через 6 часов 36; через 12 часов - 40; через 24 часа 80, 3; через 48-58, через 72-22.

Пик количества низкомолекулярной ДНК - через 24 часа. Диагноз -ишемический тип инсульта.

У больного Г. была выявлена следующая динамика количества низкомолекулярной ДНК в сыворотке крови (нг/мл): через 3 часа - 87, через 6 часов 56; через 12 часов - 34; через 24 часа 28; через 48 часов - 28, через 72 часа - 5.

Пик количества низкомолекулярной ДНК - через 3 часа. Диагноз - геморрагический тип инсульта.

На рис.1 представлен пример электрофореграммы. В таблице представлена динамика количества низкомолекулярной фракции ДНК в плазме крови у больных ишемического и гемморагического типа инсультов.

На электрофореграммах представлены:

Дорожка 1 - стандарт /Hind III;

Дорожка 2 - через 3 часа после начала заболевания больной Г., 68 лет.

Дорожка 3 - через 3 часа после начала заболевания больная Ш., 77 лет.

Дорожка 4 - через 3 часа после начала заболевания больная В., 53 года.

Дорожка 5 - через 6 часов после начала заболевания больной Б., 73 года.

6 - проба плазмы здорового человека.

в пробах 2, 3, 4, 5 видна низкомолекулярноая фракция ДНК. В контроле - пробе 6 у здорового, эта фракция не видна. Стандартом является дорожка 1 - /Hind III в количестве 1 мкг/мл. Содержание низкомолекулярной ДНК на дорожке 2 составляет 42 нг/мл, 3 - 34 нг/мл, 4 - 37 нг/мл, 5 - 83 нг/мл, 6 - 0 нг/мл. 7 - 574 пн; 8 - 125 пн; 9 - низкомолекулярная фракция ДНК.

Данные таблицы свидетельствуют о высокой диагностической ценности предложенного показателя и необходимости использования их как объективный критерий, позволяющий различать типы инсульта.

Преимуществом предложенного способа количественного определения содержания внеклеточной низкомолекулярной ДНК представляется существенное снижение затрат по сравнению с прототипом. В комплект оборудования для предлагаемого метода входят реактивы и приборы (камера для вертикального электрофореза, низкоскоростная и высокоскоростная центрифуги), присутствующие в обычной клинической лаборатории. Предложен прямой метод определения внеклеточной ДНК, организованной в виде нуклеосом, позволяющий видеть результаты исследования на электрофореграмме, тем самым избегая ошибок персонала и неточностей при определении. Предложенный метод позволяет расширить возможность определения предложенного показателя для случаев не только увеличения, но и снижения содержания низкомолекулярной ДНК до уровня ниже фонового. В отличие от прототипа способ применим не только для клинических целей, но и для научно-исследовательских.

Таблица
Время от начала заболевания (часы)	3	6	12	24	48	72	Тип инсульта
М±m	43,3±6,59	32,0±9,9	38,0±5, 8	77,8±9,9*	52,0±11,2	24,7±9,2	ишемия
М±m	81,5±21,7**	53,0±13,6	27,0±7,5	28,0±9,34**	7,1±2,9	0,0	геморрагия
* - различие в строке достоверно (Р<0,05)
** - различие в столбце достоверно (Р<0,05)