способ получения клеток для заместительной клеточной терапии патологий печени

Формула изобретения

1. Способ получения клеток для заместительной клеточной терапии патологий печени, включающий выделение из подчелюстной слюнной железы протоковых стволовых клеток и их последующее культивирование в присутствии факторов направленной дифференцировки до получения целевой клеточной культуры, отличающийся тем, что из протоковых стволовых клеток подчелюстной слюнной железы выделяют популяцию стволовых клеток, экспрессирующую маркеры CD49f и EpCAM, выделенные клетки инкубируют в течение 4-6 дней в среде, содержащей вальпроевую кислоту в концентрации 0,1-40 мМ, культивирование в присутствии факторов направленной дифференцировки проводят в гепатоцитарной ростовой среде в три стадии: сначала в присутствии ингибитора -секретазы и витамина D3, затем - в присутствии онкостатина М и дексаметазона, и далее в среду добавляют интерлейкин 6 и стимулятор дифференцировки гормональной природы для завершения дифференцировки, а целевую культуру идентифицируют по экспрессии маркеров 1AAT, PEPCK, G6P, TDO, специфических для печени цитохромов P450, альбумина и по способности синтезировать мочевину.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве гепатоцитарной ростовой среды используют среду, содержащую ростовую среду DMEM/F12, 7-20% фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 1% ИТС (инсулин-трансферрин-селенит), 0,03 мМ никотинамида, 5-60 нг/мл гепатоцитарного ростового фактора (HGF) и 5-80 нг/мл эпидермального ростового фактора (EGF).

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области регенеративной медицины и клеточных технологий, в частности, к получению клеточного материала для заместительной клеточной терапии широкого спектра острых и хронических патологий печени, в том числе для лечения циррозов, острой и хронической печеночной недостаточности, возникающей вследствие вирусных, химических, медикаментозных и иных повреждений печени, а также для восстановления генетических дефектов тканей и органов энтодермального происхождения.

Репарация тканевых дефектов с помощью трансплантации клеток представляет собой комплексный многостадийный процесс восстановления структуры и функции ткани, носящий универсальный характер. Эффективность замещения дефектов тканей, способность стимулировать собственную регенерацию органа, отсутствие опасностей возникновения фиброзов при применении заместительной клеточной терапии главным образом зависят от используемых в терапии клеток.

Известно, что к трансдифференцировке в гепатоцитарном направлении способны в той или иной степени несколько типов клеток, однако, получить полноценно функционально активные клетки, выполняющие функции гепатоцитов, так и не удалось (Sarah Snykers, Tom Henkens, Evelien De Rop, Mathieu Vinken, Joanna Fraczek, Joery De Kock, Evi De Prins, Albert Geerts, Vera Rogiers, Tamara Vanhaecke. Role of epigenetics in liver-specific gene transcription, hepatocyte differentiation and stem cell reprogrammation // Journal of Hepatology, 51 (2009), pp.187-211).

В настоящее время наиболее изученными источниками клеток для заместительной клеточной терапии заболеваний печени являются эмбриональные стволовые клетки (Rambhatia L, Chiu CP, Kundu P, Peng Y, Carpenter MK. Generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells // Cell Transplant., 2003, 12 (1), pp.1-11), мезенхимные клетки костного мозга (Snykers S, Vanhaecke T, De Becker A, Papeleu P, Vinken M, Van Riet I, Rogiers V. Chromatin remodeling agent trichostatin A: a key-factor in the hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells derived of adult bone marrow // BMC Dev Biol,. 2007, Apr 2, pp.7-24), жировой ткани (Seo MJ, Suh SY, Bae YC, Jung JS. Differentiation of human adipose stromal cells into hepatic lineage in vitro and in vivo // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005, 328, pp.25 8-264) и клетки амниотической жидкости (Dawn M. Delo, Paolo De Coppi, Georg Bartsch, JR., Anthony Atala. Amniotic Fluid and Placental Stem Cells // Methods in Enzymology, Vol.419, 2006).

Однако во всех исследовательских работах показана лишь частичная трансдифференцировка стволовых клеток и не достигнуто функционально активное состояние гепатоцитов, поэтому разработка надежных методов направленной дифференцировки стволовых клеток в функционально активные гепатоцитоподобные клетки и получение этих клеток в достаточном для трансплантации количестве представляет собой ключевую и первостепенную задачу современной клеточной биологии.

Известен способ получения популяции клеток, обогащенной жизнеспособными клетками печени человека, в том числе печеночными стволовыми клетками/клетками-предшественниками, где указанная популяция клеток содержит функционально активные гепатоциты и билиарные клетки, экспрессирующие цитокератин 19 (СК19) и не экспрессирующие альбумин, а также печеночные стволовые клетки/клетки-предшественники, имеющие диаметр в диапазоне от 9 до 13 мкм и экспрессирующие маркеры ЕР-САМ, CD 133 или оба, предусматривающий расщепление целой печени человека или ее резецированной части препаратом протеолитических ферментов; механическую диссоциацию расщепленной целой печени человека или ее резецированной части для обеспечения клеточной суспензии; суспендирование суспензии клеток в растворе 25% (мас./об.) иодиксанола; градиентное центрифугирование смеси для получения по меньшей мере одной полосы, обогащенной жизнеспособными клетками печени человека; и сбор, по меньшей мере, одной полосы для получения целевой популяции клеток (RU № 2346981, C12N 5/00, опубл. 20.02.2009).

Существенным ограничением данного способа является недостаток донорских органов, короткое время жизни выделенных клеток и плохая выживаемость клеток после криохранения, а также невозможность получения клеток в достаточном для трансплантации количестве, т.к. отсутствует этап культивирования in vitro.

Известен способ получения печеночных стволовых клеток для клеточной терапии и для создания искусственных органов, включающий выделение из ткани печени человека примитивных печеночных стволовых клеток человека, экспрессирующих Ер-САМ, АС133 и альбумин, культивирование данной смеси клеток в условиях, способствующих селекции примитивных печеночных стволовых клеток человека, в том числе в бессывороточной среде, содержащей регулятор углеводного метаболизма, переносчик железа и мембранообразующий фактор, при этом образуются колонии, включающие примитивные печеночные стволовые клетки человека, являющиеся предшественниками проксимальных печеночных стволовых клеток, предшественников гепатоцитов или предшественников желчных протоков (RU № 2327479, A61K 35/407, опубл. 27.06.2008).

Недостаток известного способа заключается в том, что источниками клеток является либо донорская печень, из которой изъятие клеток представляет собой болезненную процедуру для донора, либо ткань печени из трупов новорожденных младенцев или трупов детей, которая малодоступна для широкого применения в клинике, и кроме того, полученный клеточный материал плохо приживается и при трансплантации вызывает ряд серьезных осложнений.

В патенте RU № 2272638 описан способ получения клеток для заместительной клеточной терапии при хроническом гепатите и циррозе печени, включающий выделение мезенхимных стволовых клеток из фетальных (костный мозг, тимус, печень, жировая ткань эмбрионов человека 1-го триместра беременности), донорских (костный мозг, жировая ткань, тимус, печень) или аутологичных (костный мозг и жировая ткань) тканей, при этом ткань ферментативно дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки и 2 мМ глутамина, далее высевают при плотности посева 1-20 млн. мононуклеарных клеток на 1 см2 и инкубируют при 37°C в атмосфере 5% CO2, по достижении культурой 50% конфлуентности клетки трипсинизируют и пересевают с плотностью 10-30 клеток на 1 см2 в ростовой среде, содержащей 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10 нг/мл фактора роста фибробластов - 2 и 8 ЕД/мл гепарина и с увеличением посевной дозы культивирование ведут до накопления в культуре зрелой стромы (RU № 2272638, A61K 35/407, опубл. 27.03.2006).

Недостатком аналога является то, что клетки зрелой стромы не обладают свойством дифференцироваться в гепатоцитоподобные клетки, поэтому практически не удается получить клетки, выполняющие функции гепатоцитов и, таким образом, полученные клетки терапевтически неэффективны. Кроме того, использование фетальных органов связано с этическими проблемами и не является легко доступным источником клеток.

Известно также использование для лечения хронического гепатита или цирроза печени мононуклеарных клеток пуповинной крови донора, имеющих набор антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-DR, отличный от набора антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-DR реципиента не менее, чем по четырем антигенам (RU № 2295351, A61K 35/14, опубл. 27.03.2007).

Недостатком способа является обязательное HLA-типирование и трудность подбора донора, т.к. для достижения клинического эффекта стволовые клетки пуповинной крови донора должны отличаться от клеток реципиента не менее чем по четырем антигенам из набора антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-DR. Кроме того, эффективность данных клеток не доказана.

Наиболее близким аналогом является способ получения клеток для лечения дисфункций печени, включающий выделение стволовых клеток из слюнной подчелюстной железы человека с помощью ферментативной обработки коллагеназой и гиалуронидазой, а затем - диспазой, с последующей магнитной селекцией по маркеру CD49f и культивирование выделенных клеток in vitro в течение 2-3 недель в присутствии ростовых факторов: эпидермального фактора роста (EGF) и основного фактора роста фибробластов (bFGF). После этого в течение недели проводится сфероидное культивирование клеток на 96 луночной плате с неадгезивной поверхностью в присутствии факторов направленной дифференцировки:

В-27, N-2, фактора роста фибробластов 4 (FGF4) и фактора ингибирования лейкемии (LIF) с последующим выделением клеток, инициированных к дифференциации в гепатоцитарном направлении, которые характеризуются наличием маркеров HNF-3 , альфа-фетопротеина и альбумина (US № 7659121, C12N 5/00, опубл. 09.02.2010).

В ближайшем аналоге в качестве исходного источника клеток при получении клеток для заместительной клеточной терапии дисфункций печени используют протоковые клетки подчелюстной слюнной железы человека, которые представляют собой эпителиальные клетки энтодермального происхождения и являются родственными по своему типу и филогенетическому происхождению с функционально активными клетками печени и экзокринными клетками поджелудочной железы. В отличие от эмбриональных стволовых клеток эти клетки не обладают туморогенной и тератогенной активностью и не вызывают риск онкотрансформации. Протоковые клетки подчелюстной слюнной железы обладают бипотентным потенциалом дифференцировки и могут быть дифференцированы как в гепатоцитоподобные клетки, так и в клетки желчных протоков. Кроме того, эти клетки активно синтезируют инсулин и могут быть направлены в бета - клетки поджелудочной железы. Биопсия протоковых клеток подчелюстной слюнной железы не связана со сложной полостной операцией и с травматизацией донора, поэтому может быть проведена легко и без последствий для донора, и, кроме того, взятие такого клеточного материала снимает этические ограничения, которые возникают при использовании эмбриональных клеток и фетальных тканей.

Однако ближайшему аналогу присущи и серьезные недостатки: известная технология получения клеток является длительной, многостадийной, трудоемкой и технически неосуществимой в промышленном масштабе. Кроме того, известный способ не дает стабильно воспроизводимого результата дифференцировки клеток до функционально активных гепатоцитоподобных клеток из-за неустойчивой индукции дифференцировки исходной популяции стволовых клеток в гепатоцитарном направлении, а также не обеспечивает возможности получения целевых клеток в количестве, достаточном для проведения их эффективной трансплантации в терапевтических целях.

Задачей изобретения является разработка способа получения клеток для заместительной клеточной терапии патологий печени с использованием легкодоступного источника исходных клеток - энтодермальных стволовых клеток подчелюстной слюнной железы, и обеспечивающего их устойчивую индукцию дифференцировки в заданном гепатоцитарном направлении, а также позволяющего получать целевой клеточный материал с высокой биологической активностью и в количестве, достаточном для проведения эффективной трансплантации в терапевтических целях.

Технический результат изобретения заключается в упрощении технологии получения целевых клеток, увеличении гарантированно высокого процента (до 90%) функционально активных гепатоцитоподобных клеток из исходных стволовых клеток за счет повышения стабильности и воспроизводимости процесса дифференциации, а также повышение выхода целевых клеток.

Технический результат достигается за счет использования в качестве исходного источника клеток выделенной из подчелюстной слюнной железы популяции энтодермальных протоковых стволовых клеток, экспрессирующей маркеры CD49f и ЕрСАМ, и разработанного оптимального способа культивирования данной популяции клеток для индукции гепатоцитарной дифференциации, позволяющего создать и поддерживать стандартные условия для дифференцировки полученной популяции стволовых клеток, необходимые для осуществления терминальных стадий гепатоцитарной дифференцировки, и обеспечивающие получение целевых клеток - гепатоцитоподобных функционально активных клеток в количестве, достаточном для проведения эффективной трансплантации в терапевтических целях.

Все указанное позволит повысить качество лечения дефектов печени различной этиологии, сократить сроки лечения и риски возникновения осложнений за счет устранения фиброзных реакций организма и восполнения недостатка функционирующих клеток печени. Сущность изобретения заключается в следующем: в способе получения клеток для заместительной клеточной терапии патологий печени, включающем выделение протоковых стволовых клеток из подчелюстной слюнной железы и их последующее культивирование в присутствии факторов направленной дифференцировки до получения целевой клеточной культуры, отличающемся тем, что из протоковых стволовых клеток подчелюстной слюнной железы выделяют популяцию стволовых клеток, экспрессирующую маркеры CD49f и ЕрСАМ, выделенные клетки инкубируют в течение 4-6 дней в среде, содержащей вальпроевую кислоту в концентрации 0,1-40 мМ, культивирование в присутствии факторов направленной дифференцировки проводят в гепатоцитарной ростовой среде в три стадии: сначала в присутствии ингибитора -секретазы и витамина D3, затем - в присутствии онкостатина М и дексаметазона, и далее в среду добавляют интерлейкин 6 (I1-6) и стимулятор дифференцировки гормональной природы для завершения дифференцировки, а целевую культуру идентифицируют по экспрессии маркеров 1ААТ, РЕРСК, G6P, TDO, специфических для печени цитохромов Р450, альбумина и по способности синтезировать мочевину. В качестве гепатоцитарной ростовой среды используют среду, содержащую ростовую среду DMEM/F12, 7-20% фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 1% ИТС (инсулин-трансферрин-селенит), 0,03 мМ никотинамида, 5-60 нг/мл гепатоцитарного ростового фактора (HGF) и 5-80 нг/мл эпидермального ростового фактора (EGF).

Источником исходных стволовых клеток служит подчелюстная слюнная железа взрослого донора, в том числе для аутологичной или аллогенной трансплантации. Взятие клеточного материала может быть проведено легко, без последствий для донора и не связано с этическими проблемами, которые возникают при использовании эмбриональных клеток и различных фетальных тканей.

Выделенные по изобретению стволовые клетки слюнной железы, экспрессирующие маркеры CD49f (маркер протоковых клеток) и ЕрСАМ (маркер адгезии эпителиальных клеток) представляют собой уникальную клеточную популяцию стволовых клеток энтодермального происхождения, отличающую ее от клеток, используемых в ближайшем аналоге. Уникальность выделенной популяции клеток по настоящему изобретению заключается в том, что в условиях культивирования согласно изобретения только клетки указанного фенотипа (CD49f+/EpCAM+) достоверно способны к дифференцировке в гепатоцитоподобные клетки с высокой биологической активностью.

Выделенную популяцию клеток инкубируют в течение 4-6 дней в ростовой среде, содержащей вальпроевую кислоту в концентрации 0,1-40 мМ. Добавление вальпроевой кислоты приводит к трансформации клеток в менее дифференцированное состояние и позволяет приблизить их к общему с гепатоцитами клеточному предшественнику. При этом, как было впервые установлено заявителем на моделях in vitro, повышается уровень экспрессии гена Tb×3, необходимого для гепатоцитарной дифференцировки, что обеспечивает упрощение и ускорение процессов последующей трансдифференцировки в гепатоцитарном направлении. Уже на 5-й день инкубации в клетках значительно возрастает синтез альфафетопротеина - вещества, которое синтезируется в гепатобластах. Полученные изменения в экспрессии генов, происходящие от применения вальпроевой кислоты, уникальны и характерны для выделенной популяции энтодермальных клеток, и не характерны для клеток иного происхождения. Этот результат является неочевидным для специалистов в данной области.

После инкубирования с вальпроевой кислотой полученные клетки подвергают трандифференцировке в гепатоцитарном направлении. Для этого клетки культивируют в три стадии в гепатоцитарной ростовой среде, содержащей факторы дифференциации: сначала в течение 5-6 дней в среде в присутствии ингибитора -секретазы и витамина D3, затем - в течение 5-6 дней в присутствии онкостатина М и дексаметазона, и далее в среду добавляют для завершения дифференцировки интерлейкин 6 (I1-6) и стимулятор дифференцировки гормональной природы, например, экстракты тимуса, которые содержатся, например, в коммерческих добавках N2 и В27 (Invitrogen).

Через 20 дней культивирования в полученной клеточной культуре содержится не менее 90% дифференцированных клеток, экспрессирующих характерные для гепатоцитов маркеры 1ААТ, РЕРСК, G6P, TDO, специфические для печени цитохромы Р450, альбумин, а также синтезирующих мочевину, при этом экспрессия альбумина возрастает более чем в 17 раз по сравнению с исходной культурой, не подвергавшейся дифференцировке.

Изобретение позволяет за короткий период времени (за 14-30 дней) вырастить значительное количество целевых клеток (10⁸-10 ⁹), которые могут быть использованы в терапевтических целях. Высокое содержание терминально дифференцированных в гепатоцитарном направлении клеток позволяет эффективно использовать их при трансплантации в качестве альтернативы трансплантации донорской печени для восполнения недостаточности функций гепатоцитов пациента.

Разработанная технология, включающая получение энтодермальных стволовых клеток из тканей слюнной железы и их трансдифференцировку в процессе культивирования в присутствии факторов дифференцировки, является стабильно воспроизводимой и высокоэффективной, позволяющей обеспечить получение целевых клеток - функционально активных гепатоцитоподобных клеток в количестве, достаточном для проведения эффективной трансплантации в терапевтических целях и восполнения недостаточности функций гепатоцитов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение клеток для заместительной клеточной терапии патологий печени.

Согласно изобретения технология получения клеток включает два этапа.

Этап 1. Получение популяции энтодермальных стволовых клеток из подчелюстной слюнной железы.

Донорскую ткань (часть подчелюстной слюнной железы размером 0,5-2 см³) переносят в стерильную пробирку со средой DMEM/F12 и гентамицином (40 мкг/мл). Начиная с этого момента работают в стерильных условиях, отвечающих требованиям GMP (Good Manufacturing Practice). После удаления фиброзной капсулы и кровеносных сосудов, ткань измельчают, дважды промывают фосфатно-солевым буфером (DPBS), осаждают центрифугированием в течение 5 минут при 0,8 тыс. об/мин, инкубируют ткань с 4 мг/мл коллагеназы IV типа (всего - 1 мл на 0,5 см³ ткани) в среде DMEM/F12 60 минут при 37С.

Затем к клеткам добавляют 10 мл полной ростовой среды, содержащей DMEM/F12 1:1, эмбриональную телячью сыворотку (7-20%, оптимально 10%); + глутамин (2 мМ); + 1% инсулин-трансферрин-селенит (ИТС) и эпидермальный фактор роста (EGF) (5-80 нг/мл, оптимально 10-20 нг/мл). Взвесь клеток активно пипетируют в течение 5 минут, затем пропускают через нейлоновый фильтр с диаметром пор 40-100 мкм и осаждают клетки центрифугированием в течение 2 мин. при 0,8 тыс. об/мин.

Далее проводят магнитную сепарацию по маркерам CD49f и ЕрСАМ, для чего полученную суспензию клеток ресуспендируют в 0,5 мл фосфатно-солевого буфера, инкубируют с первыми антителами (anti-human CD49f и anti-human ЕрСАМ) в течение 30 минут при 4С, концентрация антител - 1 мкг/10⁶ клеток. Промывают 5 мл фосфатно-солевого буфера и инкубируют с вторыми антителами, (коньюгированными с магнитными частицами) в течение 20 минут, далее проводит магнитную сепарацию на колонках по инструкциям производителя. Отсортированные клетки осаждают центрифугированием (5 минут при 300 g), ресуспендируют в полной ростовой среде, подсчитывают. Рассаживают на покрытые коллагеном I типа культуральные чашки из расчета 5×10 ³ клеток на см². Клетки культивируют при температуре 37°С в атмосфере 5% CO2.

При достижении нужного количества клеток (5×10⁷-10⁸) их переводят на гепатоцитарную ростовую среду DMEM/F12 1:1, содержащую фетальную телячью сыворотку (7-20%, оптимально 10%); глутамин (2 мМ); 1% инсулин-трансферрин-селенит (ИТС); 0,03 мМ никотинамид; гепатоцитарный ростовой фактор (HGF) (5-60 нг/мл, оптимально 15-20 нг/мл); эпидермальный ростовой фактор (EGF) (5-80 нг/мл, оптимально 10-20 нг/мл).

В гепатоцитарную ростовую среду добавляют вальпроевую кислоту в концентрации 0,1-40 мМ, (оптимально 1 мМ) и культивируют в течение 4-6 дней (оптимально 5 дней). Влияние вальпроевой кислоты на дифференцировку стволовых клеток в гепатоцитарном направлении оценивают с использованием методов иммуноцитохимии и количественной ПЦР. Обработка вальпроевой кислотой приводила к пятикратному увеличению экспрессии гена Tb×3, необходимого для гепатоцитарной дифференцировки.

В результате получают популяцию клеток, характеризующуюся повышенной экспрессией маркера Tb×3, которую подвергают трансдифференцировке в гепатоцитарном направлении.

Этап 2. Индукция дифференцировки энтодермальных стволовых клеток слюнной железы в гепатоцитарном направлении.

Для индукции гепатоцитарной дифференцировки к культуре клеток, после обработки вальпроевой кислотой, добавляют ингибитор -секретазы и витамин D3 (1-30 нг/мл, оптимально 20 нг/мл) инкубируют клетки 4-7 дней, предпочтительно в течение 5 дней. После этого реагенты удаляют, добавляют онкостатин М и дексаметазон в количествах 1-40 нг/мл онкостатина М (оптимально 10 нг/мл) и 0,05-0,3 мкМ дексаметазона (оптимально 0,1 мкМ), инкубируют 4-7 дней (оптимально 5 дней). Удаляют онкостатин М, добавляют интерлейкин 6 (I1-6) и стимулятор дифференцировки гормональной природы, например, экстракты тимуса, которые содержатся, например, в коммерческих добавках N2 и В27 (Invitrogen) (до 1%) и инкубируют еще 3-10 дней (оптимально 5 дней).

Дифференцированные клетки идентифицируют по морфологическим характеристикам и наличию экспрессии маркеров 1ААТ, PEPCK, G6P, TDO, специфических для печени цитохромов Р450 и альбумина. Помимо этого функциональную активность полученных клеток оценивают по способности синтезировать мочевину.

Таким образом, в течение 2-3 недель получают дифференцированные в гепатоцитарном направлении клетки.

Полученные культуры дифференцированных в гепатоцитарном направлении клеток используют в качестве клеточного компонента в тканевых эквивалентах (биоискусственной) печени или в качестве самостоятельного клеточного препарата для лечения дисфункций печени.

Пример 2. Приготовление клеточного препарата для лечения дисфункций печени.

За 24 часа до инъекции полученные по примеру 1 клетки переводят на бессывороточную среду: DMEM/F12 + 2 мМ глутамин; + 1% инсулин-трансферрин-селенит (ИТС); + 10 нг/мл эпидермальный фактор роста (EGF). Клетки снимают с пластика трипсином, переносят в центрифужные пробирки и осаждают 5 минут при 300 g. Супернатант удаляют, к клеткам добавляют эквивалентный объем стерильного физраствора, пипетируют и осаждают 5 минут при 300. Процедуру повторяют еще два раза. Затем клетки ресуспендируют в физиологическом растворе в нужной для конкретного случая концентрации (около 5×10⁵ клеток на 100 мкл физраствора). Приготовленную клеточную суспензию держат при температуре 20-25C, используют для трансплантации в течение 4 часов.

Инъекции производят по 100 мкл в паренхиму органа, из расчета 10⁶-10⁹ клеток на пациента в зависимости от характера дефекта; либо вводят в воротную вену с помощью венозного катетера или пункционно в вены портальной системы, с помощью артериального катетера в селезеночную артерию, интраперитонеально, пункционно в большой сальник.

В случае если клетки не планируется вводить сразу - их подвергают криозаморозке и криохранению. Для этого клетки разводят в криоконсервирующей среде в концентрации 10⁶-10⁹ на мл (оптимально 5×10⁵) и охлаждают в программном замораживателе со скоростью 1C в минуту. Затем помещают в жидкой азот, хранят до возникновения потребности в трансплантации.

Пример 3. Оценка эффективности полученных клеток при репарации дефектов печени.

Способность полученных по примеру 1 клеток к репарации дефектов печени оценивалась на лабораторной модели: на мышах линии С57 Black, у которых с помощью внутрибрюшинных инъекций четыреххлористого углерода экспериментально была вызвана печеночная недостаточность.

Формируют две группы животных: одну экспериментальную и одну контрольную - в качестве положительного эталона сравнения в которой используют универсальный индикатор гепатоцитарной дифференцировки - прогениторные клетки печени.

Мышам экспериментальной группы трансплантируют клетки, полученные по примеру 1, которые несут метку зеленого флуоресцентного белка (GFP) в количестве 5×10⁶ трансплантируемых клеток на мышь. Трансплантируемые в данном случае клетки несли ген GFP и могли быть детектированы с помощью флуоресцентной микроскопии. Трансплантацию клеток осуществляют путем инъекции в паренхиму печени.

Контрольной группе животных в качестве положительного контроля подсаживают прогениторные клетки печени мыши, несущие метку GFP, в количестве 5×10⁶ клеток на мышь.

Оценку эффективности трансплантированных клеток проводят по способности введенных клеток встраиваться в строму печени реципиента и производить альбумин.

Уже через 5 дней в печени мышей были задетектированы положительные по GFP клетки, которые встроились в структуру печени, были способны к синтезу альбумина и цитохромов P450. Причем, значительных различий между опытной и контрольной группами не наблюдалось. Это означает, что дифференцированные указанным способом в гепатоцитарном направлении клетки подчелюстной слюнной железы способны встраиваться в печень и выполнять гепатоцитарные функции на уровне сопоставимом со стволовыми клетками печени.

Представленные результаты свидетельствуют, что полученные по изобретению клетки при трансплантации могут замещать дефекты тканей и восполнять недостаточность функций гепатоцитов. Клетки также активно синтезируют широкий спектр биологически активных веществ, в том числе фактор роста нервов, эпидермальный фактор роста, фактор роста эндотелия и др., что может оказывать стимулирующее действие на собственные клетки реципиента. Важно, что в данном случае используются именно клетки того же зародышевого листка - энтодермального, так как другие источники клеток (по литературным данным) не могут дифференцироваться в гепатоцитарном направлении с достаточной эффективностью.

Таким образом, полученные по изобретению клетки могут быть эффективно использованы для лечения хронических гепатитов и циррозов печени, развившихся вследствие гепатотропных вирусов (вирусы гепатита В, С, D, G, F, TTV, CMV, EBV), токсического фактора (алкоголь, лекарства, промышленные вещества и др.), метаболических нарушений (гемохроматоз, болезнь Вильсона-Коновалова, недостаточность 1-антитрипсина, гликогеноз IV типа, галактоземия, наследственный тирозиноз, наследственные гипербилирубинемии), аутоиммунных заболеваний (первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит) и многих других факторов.