способ ранней диагностики первичной открытоугольной глаукомы и преглаукомы

Формула изобретения

Способ ранней диагностики первичной открытоугольной глаукомы и преглаукомы путем биохимического исследования в слезной жидкости содержания малонового диальдегида, метаболитов оксида азота, отличающийся тем, что дополнительно проводят определение в слезе активности каталазы, вычисляют коэффициент антиоксидантной защиты и при активности каталазы меньше 2,6±0,36 мкат/л, содержании малонового диальдегида больше 10,36±0,65 нмоль/мл, значении коэффициента антиоксидантной защиты менее 0,23-0,27, повышении уровня оксида азота выше 8,9±0,8 мкмоль/л, снижении концентрации нитрита азота ниже 2,83±0,31 мкмоль/л диагностируют начало глаукомного процесса в глазу - преглаукому или первую стадию болезни.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для ранней диагностики первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ) и преглаукомы.

Известны различные способы ранней диагностики первичной открытоугольной глаукомы. Это, в основном, разнообразные инструментальные исследования. Однако биохимические исследования слезной жидкости у больных первичной открытоугольной глаукомой в настоящее время не нашли своего применения для ранней диагностики глаукомы и преглаукомы. Аналогом исследования биохимических показателей в слезной жидкости больных глаукомой является определение содержания стабильных метаболитов оксида азота у лиц разного пола при первичной открытоугольной глаукоме (см. Жабоедов Г.Д., Курилина Е.И., Петренко О.В. Материалы Всерос. науч.-практ.конференции «Глаукома. Проблемы и решения». - М., 2004. - С.53-56). Однако в данном способе исследователи не предусматривали возможности ранней диагностики глаукомы по уровню изучаемых биохимических показателей и не ставили перед собой задачу изучения слезной жидкости при преглаукоме.

Наиболее близким по технической сущности, достигаемому эффекту и выбранным в качестве прототипа является изучение в слезной жидкости больных первичной открытоугольной глаукомой показателей перекисного окисления липидов (ПОЛ) по концентрации ТБК-активных продуктов (малонового диальдегида - МДА) и антиоксидантной активности по содержанию SH-групп (см. Черных В.В. Журнал «Глаукома». -2005. - № 4, с.20-23.). Однако исследователи не ставили перед собой цель изучения состояния перекисного окисления липидов в слезе по стадиям глаукомного процесса, ими не определялась активность антиоксидантного фермента каталазы, также не изучена возможность ранней диагностики глаукомы по состоянию изучаемых биохимических показателей и не обследовались больные с преглаукомой.

Задачей предлагаемого изобретения является обеспечение возможности ранней диагностики первичной открытоугольной глаукомы и преглаукомы.

Техническим результатом является определение в слезе пациентов изменения ряда биохимических показателей, которые обеспечивают возможность ранней диагностики заболевания.

Указанный технический результат реализуется за счет того, что в заявленном способе ранней диагностики первичной открытоугольной глаукомы и преглаукомы путем биохимического исследования в слезной жидкости содержания малонового диальдегида (МДА), метаболитов оксида азота, согласно изобретению дополнительно проводят определение в слезе активности каталазы (К), вычисляют Каоз - коэффициент антиоксидантной защиты (соотношение - каталаза/малоновый диальдегид) и при значении активности каталазы меньше 2,6±0,36 мкат/л, малонового диальдегида больше 10,36±0,65 нмоль/мл, Каоз менее 0,23-0,27, повышение уровня оксида азота более 8,9±0,8 мкмоль/л, снижения содержания нитрита азота (NO₂ ^-) ниже 2,83±0,31 мкмоль/л диагностируют начало глаукомного процесса в глазу - преглаукому или первую стадию болезни.

Проведенные исследования по патентным и научно-техническим источникам информации показали, что предлагаемый способ ранней диагностики первичной открытоугольной глаукомы и преглаукомы не известен, не следует явным образом из изученного уровня техники, т.е. соответствует критериям «новизна» и «изобретательный уровень».

Для предотвращения нарушения зрительных функций и слепоты от глаукомы важна ранняя диагностика глаукомного процесса, когда еще не страдают функции и трудно уловить начинающиеся изменения диска зрительного нерва, особенно при преглаукоме. Биохимические исследования слезной жидкости позволяют выявить при начинающейся открытоугольной глаукоме на молекулярном уровне ранние местные изменения.

Предлагаемый способ ранней диагностики первичной открытоугольной глаукомы осуществляется с помощью известных и доступных для любой лаборатории биохимических методик исследования слезы. Активность каталазы определяли по методу Каролюка М.А. с соавт.(«Лабораторное дело», № 1, 1988, с.16-19) в модификации Коробейниковой Э.Н. (Методические рекомендации.- Челябинск: Изд-во «Челябинская государственная академия», 2002. - 50 с.). Принцип метода определения активности каталазы основан на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс. Для определения каталазы в слезе к 0,02 мл слезы добавляли 1,0 мл перекиси водорода. Для прекращения реакции использовали 0,5 мл 4% раствора молибдата аммония. Активность каталазы рассчитывали по формуле: Е=(А хол.-А оп.)×V×t×К, где Е - активность каталазы, А хол. и А он.- экстинция холостой и опытной проб, V - объем вносимой пробы, t - время инкубации, К - коэффициент миллимолярной экстинции перекиси водорода - 22,2×10 мМ см. Активность каталазы в слезе выражали в мкат/л.

ТБК - активные продукты (МДА) определяли по методике Стальной И.Д., Гарашвили Т.Г., 1977 г., и Гаврилова В.Б. с соавт., 1987 г., в модификации Коробейниковой Э.Н. (Методические рекомендации.- Челябинск: Изд-во «Челябинская государственная академия», 2002. - 50 с.). Принцип метода: при нагревании в кислой среде часть продуктов ПОЛ, относящихся к классу эндоперекисей, разлагается с образованием МДА, взаимодействие молекулы которого с двумя молекулами тиобарбитуровой кислоты (ТБК) приводит к формированию окрашенного комплекса. К 0,05 мл слезы добавляли 0,1 мл 10% раствора три-хлоруксусной кислоты и 0,1 мл дистиллированной воды, через 10 минут центрифугировали в течение 15 минут при 2500 об/мин. К надосадочной жидкости добавляли 0,5 мл 0,8% раствора ТБК. Затем пробирки плотно закрывали пробкой, помещали в водяную баню при температуре 100°С на 1 час. Интенсивность окрашивания раствора замеряли на спектрофотометре СФ-46 в микрокювете при длине волны 535 и 580 нм против контрольной пробы. Концентрацию МДА рассчитывали по формуле: А=(Е×Vсм.×20×10): (К×Vсл.), где А - концентрация МДА в нмоль/мл, Е=Е535-Е580, V см. - объем смеси, К - молярный коэффициент (1,56×10-5 моль), V cл. - объем слезы.

Уровень стабильных метаболитов оксида азота в слезе определяли по методу Емченко Н.Л. с соавт. (Емченко Н. Л., Цыганенко О. И., Ковалевская Т.В. // Клиническая лабораторная диагностика. - 1994.- № 6. - С.19-20) в модификации Коробейниковой Э.Н. (Методические рекомендации.- Челябинск: Изд-во «Челябинская государственная академия», 2002. - 50 с.). Принцип метода: нитраты определяют в виде нитритов по реакции Грисса после восстановления их губчатым кадмием. Схема определения:

Реактивы	Опытная проба	Холостая проба
0,5% ZnSO4	2,5 мл	2,5 мл
0,1 н. раствор NaOH	0,5 мл	0,5 мл
сыворотка	0,25 мл
Перемешать, поставить в кипящую баню на 5 минут, охладить
Буферный реактив	1,0 мл	1,0 мл
Дистиллированная вода	0,5 мл	1,0 мл

Перемешать, центрифугировать 20 минут при 2500 об/мин, 5,0 мл центрифугата холостой пробы +2,5 мл буфера +2,5 мл дистиллированной воды пропускают через кадмиевую колонку (холостая проба), затем 5,0 мл опытной пробы (центрифугат) +2,5 мл буфера +2,5 мл дистиллированной воды также пропускают через колонку со скоростью 5 мл в минуту. Элюируют холостую и опытную пробы дистиллированной водой. Элюат собирают в мерную колбу на 25 мл, так, чтобы в колбе было примерно 15 мл элюата. С холостой и опытной пробой проводят цветную реакцию Грисса.

реактивы	Опытная проба	Холостая проба
0,25% раствор стрептоцида	5,0 мл	5,0 мл
НСl 1:2	1,0 мл	1,0 мл
Перемешать, поставить в темноту на 5 минут
1% НЭД	1,0 мл	1,0 мл

Довести объем в колбе до 25 мл дистиллированной водой, перемешать и оставить на 10 минут в темноте. Затем фотометрировать при длине волны 540 нм в кюветах с длиной оптического пути 5 см против холостой пробы.

Перед каждой пробой колонку промывают последовательно 5,0 мл 1 н. раствора НС1, 50,0 мл дистиллированной воды и 25,0 мл буфера, разбавленного водой в соотношении 1:9. Чистоту колонки проверяют по холостой пробе, которая не должна иметь оптическую плотность выше 0,1.

Расчет проводят по калибровочному графику, построенному по стандартным растворам NaNO₂, обработанным как проба. Находят содержание нитратов в мкмоль/мл по формуле

С=(А×У1×5): (У3×У4)×48,83 мкмоль/мл,

где А - показания калибровочного графика в мкг/мл;

У1 - общий объем безбелкового экстракта в мл;

5 - разведение экстракта после колонки;

У3 - объем образца, взятый для анализа в мл (0,5);

У4 - объем безбелкового экстракта, взятый для анализа (5 мл);

48,83 - коэффициент пересчета мкг/мл в мкмоль/мл с учетом нитратного коэффициента (1,465).

Обследовано 94 пациента с ПОУГ и преглаукомой (188 глаз). Во всех стадиях заболевания в слезе пациентов повышалось содержание МДА, снижались активность каталазы и коэффициент антиоксидантной защиты, повышался суммарный уровень оксида азота и снижалась концентрация нитритов. Контрольную группу составили 24 здоровых человека (48 глаз).

С преглаукомой обследовано 25 человек, с первой стадией глаукомы - 29 больных. В начальных стадиях болезни признаки ПОЛ были выражены более существенно, чем в более поздние сроки. При преглаукоме содержание МДА колебалось в пределах 30,12-31,08 нмоль/мл (норма - 10,36±0,65 нмоль/мл), при 1 стадии глаукомы колебания этого фактора составляло 29,78-31,82 нмоль/мл. Активность К при преглаукоме составила 1,88-2,24 мкат/л (норма - 2,6±0,36 мкат/л), при 1 стадии болезни - 1,68-2,28 мкат/л. Каоз при преглаукоме колебался в пределах 0,062-0,072 (норма - 0,23-0,27), при 1 стадии ПОУГ колебания данного коэффициента составили 0,054- 0,07. В самых ранних стадиях заболевания глаукомой отмечено явное изменение содержания оксида азота в слезной жидкости: при преглаукоме уровень NO составил 10,04-10,17 мкмоль/л (норма - 8,9±0,8 мкмоль/л), нитрита (NO₂ ^-) - 2,04-2,64 мкмоль/л (норма - 2,83 0,34 мкмоль/л); при 1 стадии глаукомы уровень NO составил 9,22-9,82 мкмоль/л, NO₂ ^-- 1,79-2,8 мкмоль/л. Это позволило авторам предложить уровень активности каталазы в слезе ниже 2,6±0,36 мкат/л, МДА выше 10,36±0,65 нмоль/мл, Каоз ниже 0,23-0,27, NO - выше 8,9±0,8 мкмоль/л, NO₂ ^-- ниже 2,83±0,31 мкмоль/л как критерий ранней диагностики ПОУГ.

Известна антиоксидантная способность фермента каталазы, которая несет основную нагрузку по нейтрализации пероксида водорода. Низкая активность К может свидетельствовать о дисбалансе в работе клеточных ферментов антиоксидантной защиты и об увеличении продукции пероксида водорода - аллостерического ингибитора СОД (супероксид- дисмутазы). МДА - один из основных показателей перекисного окисления липидов, конечный его продукт. Оксид азота и его метаболиты - радикалы, образующиеся в сосудистом эндотелии. Накопление оксида азота оказывает прямое токсическое действие на системном и клеточном уровнях. В условиях активации ПОЛ происходит избыточное потребление оксида азота, что усугубляет эндотелиальную дисфункцию.

Клинические примеры.

1. Больной Н., 57 лет. Обследован на глаукому в связи с умеренным повышением внутриглазного давления (ВГД) правого глаза, выявленным на профосмотре. Изменения зрительных функций обоих глаз с помощью инструментальных исследований не обнаружено. При исследовании слезной жидкости правого глаза обнаружено: содержание МДА - 22,3 нмоль/мл (норма - 10,36±0,65 нмоль/мл), активность К - 2,04 мкат/л (норма - 2,6±0,36 мкат/л), коэффициент Каоз равен 0,09 (норма 0,23-0,27), содержание оксида азота - 9,52 мкмоль/л (норма - 8,9±0,8 мкмоль/л), NO₂ ^- - 2,03 мкмоль/л (норма - 2,83,0,31 мкмоль/л). На левом глазу все показатели - в пределах нормы: МДА - 11,24 нмоль/мл, активность К - 2,7 мкат/л, Каоз - 0,24, уровень оксида азота 8.8 мкмоль/л, NO₂ ^- - 3,04 мкмоль/л. С учетом изменения состояния биохимических показателей в слезе поставлен диагноз - преглаукома правого глаза, установлено диспансерное наблюдение. Через 1 год на правом глазу появились клинические признаки глаукомы.

2. Больной С., 62 года. Направлен терапевтом к окулисту, который обнаружил повышение ВГД на обоих глазах. При обследовании на правом глазу изменения зрительных функций и диска зрительного нерва не обнаружено, на левом глазу отмечено сужение нейроретинального ободка диска зрительного нерва в одном квадранте при нормальных функциях. Биохимические исследования слезы показали следующее: на правом глазу - содержание МДА - 19,06 нмоль/мл (норма - 10,36±0,65 нмоль/мл), активность К - 2,01 мкат/л (норма - 2,6±0,36 мкат/л), Каоз - 0,1 (норма 0,23-0,27), содержание оксида азота - 10.5 мкмоль/л (норма - 8,9±0,8 мкмоль/л), NO₂ ^- - 2,34 мкмоль/л (норма - 2,83±0,31 мкмоль/л); на левом глазу: содержание МДА - 29,3 нмоль/мл, активность К - 1,98 мкат/л, Каоз - 0,067, уровень оксида азота - 9,52 мкмоль/, NO₂ ^- - 2,04 мкмоль/л. Диагноз - преглаукома правого глаза, первичная открытоугольная глаукома 1 стадии левого глаза.

Таким образом, предложенный способ позволяет решить поставленную задачу - обеспечение возможности ранней диагностики первичной открытоугольной глаукомы и преглаукомы.