способ серологической оценки токсичности анатоксина bordetella pertussis

Формула изобретения

Способ серологической оценки токсичности анатоксина Bordetella pertussis путем внесения в лунки 96-луночных полистироловых планшетов с иммобилизированной гамма-глобулиновой фракцией кроличьих антисывороток к коклюшному токсину исследуемых образцов полуфабриката бесклеточной коклюшной вакцины, прибавления пероксидазного конъюгата гамма-глобулиновой фракции кроличьих сывороток к коклюшному токсину, прибавления субстратной смеси и регистрации оптической плотности смеси, и на основе оптической плотности, выявление титра присоединившегося к иммуносорбенту коклюшного токсина, отличающийся тем, что в качестве субстратной смеси используют тетраметилбензидин с перекисью водорода, а значение оптической плотности выше 0,2 еД в разведении 1:2 и более считают соответствующим токсичным препаратам.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для серологической оценки токсичности анатоксина Bordetella pertussis.

Вакцинация детей против коклюша является основным фактором борьбы с этим заболеванием, особенно опасным для младенцев и детей до 3-летнего возраста. Основными требованиями ко всем вакцинам является выраженная протективная активность и низкие токсические и аллергические свойства. В настоящее время в ряде стран мира разработана бесклеточная коклюшная вакцина, которая обладает сниженными токсическими свойствами. Тем не менее, периодически происходят вспышки заболевания коклюшем, источниками которых являются школьники среднего и старшего возраста, у которых иммунитет к коклюшу резко снижен.

Все это требует дальнейшего совершенствования качества коклюшных вакцин и связанных с этим способов их контроля. Одним из важных качеств вакцин, помимо их эффективности, является их безвредность. Поскольку в составе коклюшных вакцин основным протективным компонентом является коклюшный токсин, то определение содержания его и оценка токсичности является важным фактором.

Известен способ определения содержания коклюшного токсина (КТ) в твердофазном ИФА в 96-луночных полистироловых планшетах, в котором в качестве специфических антител использовали гамма-глобулиновые фракции сывороток кроликов, иммунизированных КТ. В качестве референс-препаратов использовали высокоочищенный препарат КТ, а в качестве субстратной смеси использовали 0,08% раствор 5-аминосалициловой кислоты с 0,05% раствором перекиси водорода. Учет реакции проводили на спектрофотометре вертикального сканирования при длине волны 450 нм (Н.С.Захарова, М.В. Брицина, Н.У. Мерцалова, И.Г. Бажанова, М.Н. Озерецковская, Е.М. Зайцев, А.В. Поддубиков, Б.Ф. Семенов «Отечественная бесклеточная коклюшная вакцина», ЖМЭИ, 2008, № 1, с.35-41). Известный способ основан на взаимодействии специфической иммуноглобулиновой фракции сывороток кроликов к КТ с препаратами, содержащими коклюшный токсин. Однако, после обезвреживания КТ, полученный коклюшный анатоксин не взаимодействует с антисыворотками к КТ, что дает возможность контролировать степень обезвреживания препаратов в процессе получения бесклеточной коклюшной вакцины.

Задачей изобретения является разработка способа серологической оценки токсичности анатоксина Bordetella pertussis.

Технический результат заявляемого способа заключается в повышении специфичности и эффективности оценки токсичности коклюшного токсина, позволяющего в короткие сроки без использования лабораторных животных и с высокой степенью точности определить качество безвредности коклюшного анатоксина, что важно в производстве бесклеточной коклюшной вакцины.

Для достижения указанного технического результата в способе серологической оценки токсичности анатоксина Bordetella pertussis путем внесения в лунки 96-луночных полистироловых планшетов с иммобилизированной гамма-глобулиновой фракцией кроличьих сывороток к коклюшному токсину исследуемых образцов полуфабриката бесклеточной коклюшной вакцины, прибавления пероксидазного конъюгата гамма-глобулиновой фракции кроличьих сывороток к коклюшному токсину, прибавления субстратной смеси и регистрации оптической плотности смеси и на основе оптической плотности выявления титра присоединившегося к иммуносорбенту коклюшного токсина, согласно изобретению, в качестве субстратной смеси используют тетраметилбензидин с перекисью водорода; а значения оптической плотности выше 0,2 еД в разведении 1:2 и более считают соответствующими токсичным препаратам.

Сущность изобретения поясняется на следующем примере.

Пример.

Постановку ИФА осуществляют в 96-луночных полистироловых планшетах с плоским дном. В лунки планшетов вносят по 0.1 мл раствора гамма-глобулиновых фракций кроличьих антисывороток к КТ в 0,05 М карбонат-бикарбонатом буферном растворе с рН 9.6 и выдерживают планшеты в течение 2 ч при температуре 37°С, а затем в течение 16-18 ч при температуре 4-6°С. После этого лунки планшетов трижды промывают 0,3 мл 0.1 М фосфатного буферного раствора рН 7.4 с 0.005% твина-20. Далее в лунки планшетов вносят серийные разведения образцов БКВ 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024, 1:2048, 1:4096, а также серийные разведения КТ в концентрации от 25 мкг/мл до 5 нг/мл в 0,1 М фосфатном буферном растворе рН 7,4 с 0,005% твина-20 и 1% бычьего сывороточного альбумина. Планшеты выдерживают 1 ч при 37°С и трижды промывают лунки 0,3 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора рН 7,4 с 0,005% твина-20. После этого в лунки планшетов вносят по 0,1 мл рабочего разведения пероксидазного конъюгата гамма-глобулиновых фракций кроличьей антисыворотки к КТ в 0,1 М фосфатном буферном растворе рН 7,4 с 0,005% твина-20 и 1% бычьего сывороточного альбумина. Планшет выдерживают в течение 15 мин при комнатной температуре в недоступном для света месте, затем прибавляют субстратную смесь - тетраметилбензидин с перекисью водорода, добавляют в лунки по 0,1 мл 2М серной кислоты и регистрируют значения оптической плотности субстратной смеси на фотометре вертикального сканирования при длине волны 450 нм.

Вакцину считают токсичной при значениях оптической плотности выше 0,2 еД в разведении 1:2 и более.

Поскольку одной из специфических характеристик действия коклюшного токсина является стимулирование выброса лимфоцитов в кровеносное русло и тем вызывающее увеличение их количества в крови мышей при введении им КТ, в практике вакцинного дела используют оценку активности коклюшного токсина и оценку его токсичности по этому признаку на мышах. Однако этот метод трудоемок и дорог, а также более продолжителен по времени.

Использование заявляемого метода является экономичным, быстрым и специфичным.

Специфичность заявляемого метода показана в сравнении с методом оценки лимфоцитозстимулирующей активности БКВ на мышах. Результаты представлены в таблице.

Сравнительное изучение чувствительности заявляемого и используемого в практике методов оценки токсичности КТ представлено в таблице.

Таким образом, заявляемый метод дает возможность получать более быструю и достоверную оценку токсичности бесклеточной коклюшной вакцины при меньших материальных затратах и в более короткие сроки.

Изучение специфичности заявляемого метода в сравнении с методом оценки лимфоцитозстимулирующей активности полуфабриката коклюшной вакцины и готовой вакцины на мышах.

№ № Серии	Препарат	Метод исследования
		Заявляемый		Изучение лимфоцитозстимулирующей активности
		Количество КТ, мкг/мл	Степень токсичности	Количество ЛС** - единиц в мл	Степень токсичности
№ 1	1. Необезвреженный препарат	80	Токсичный	8,15	Токсичный
	2. Обезвреженный препарат	0	Нетоксичный	0	Нетоксичный
№ 2	1. Необезвреженный препарат	160	Токсичный	4,25	Токсичный
	2.Обезвреженный препарат	0	Нетоксичный	0	Нетоксичный
№ 3	1. Необезвреженный препарат	64	Токсичный	4,3	Токсичный
	2. обезвреженный препарат	0	Нетоксичный	0	Нетоксичный
№ 4	1. необезвреженный препарат	200	Токсичный	4,55	Токсичный
	2. обезвреженный препарат	0	Нетоксичный	0,24*	Нетоксичный
№ 5	1. необезвреженный препарат	300	Токсичный	7,7	Токсичный
	2. Обезвреженный препарат	40	Токсичный	7,35	Токсичный
	3. Дополнительно обезвреженный препарат	0	Нетоксичный	0,27	Нетоксичный

* - препараты с количеством ЛС-единиц менее 1,0 считаются нетоксичными.

** - ЛСА выражали в единицах, рассчитанных по формуле:

Количество лейкоцитов опытной гр. - кол-во лейкоцитов контр гр.

10000 лейкоцитов (10000 лимфоцитов условно принято за 1 единицу ЛСА)