способ лечения ларвального эхинококкоза лабораторных животных

Формула изобретения

Способ лечения ларвального эхинококкоза лабораторных животных нокодазолом, отличающийся тем, что препарат вводят подкожно в количестве, не вызывающем образования соединительнотканной капсулы вокруг препарата, по 10 инъекций в сутки в суточной дозе 11-200 мг/кг, с интервалом в 3-4 дня, в точки, расположенные на дорзальной и вентральной поверхностях тела животного.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может найти применение для лечения ларвальных цистного и альвеолярного эхинококкозов человека и животных.

Цистный и альвеолярный эхинококкозы - хронически протекающие гельминтозы вызываемые ларвальной стадией цестод Echinococcus granulosus и E.multilocularis, относятся к наиболее тяжелым и опасным паразитарным заболеваниям. Альвеолярный эхинококкоз (альвеококкоз) является заболеванием человека, а цистным эхинококкозом болеют человек и сельскохозяйственные животные. Ввиду широкого распространения и огромного экономического ущерба здравоохранению и животноводству, исчисляемого сотнями миллионов долларов в год, эти заболевания представляют серьезную социальную и экономическую проблему для многих стран мира, в том числе и России [8].

Единственным радикальным методом лечения эхинококкозов является хирургический, малоэффективный в запущенных случаях заболевания и при множественной инвазии.

Применяемые для химиотерапии эхинококкозов препараты группы карбаматбензимидазолов (мебендазол и альбендазол) не обеспечивают радикальный терапевтический эффект и не гарантируют излечение больного на протяжении всей его жизни, ввиду того что они обладают слабым паразитоцидным действием и вызывают преимущественно паразитостатический эффект [5, 7, 9].

Нокодазол - серосодержащее гетероциклическое органическое соединение, относящееся к группе карбаматбензимидазолов, вызывает деполимеризацию микротрубочек и применяется при экспериментальной химиотерапии злокачественных новообразований [4, 6, 10, 11]. Однако при парентеральном введении нокодазол, как и другие препараты группы карбаматбензимидазолов, не проявил способности подвергаться резорбции из места инъекции. В местах инъекции нокодазола вокруг введенного препарата в результате клеточной реакции организма формируется постепенно утолщающаяся соединительнотканная капсула. В брюшной полости формирование такой капсулы вокруг конгломератов препарата сопровождается выраженным спаечным процессом и петрификацией.

Паразитоцидное действие на ларвальный альвеококк обнаружено у нокодазола лишь при парентеральном применении [1].

При внутримышечном введении вокруг введенного препарата образуется зона некроза распространяющаяся на мышечную ткань, сосуды и нервные волокна, что исключает возможность парентерального применения нокодазола в клинических условиях для химиотерапии ларвальных эхинококкозов.

В качестве прототипа избрана работа [1], в которой приведены результаты испытания внутрибрюшных инъекций нокодазола при лечении экспериментального альвеококкоза хлопковых крыс.

Недостатками прототипа являются:

1. низкая эффективность препарата (отсутствие губительного действия на большинство ларвоцист альвеококка у животного);

2. применение высоких доз препарата сопряжено с высокой его токсичностью и последующими осложнениями вплоть до гибели животного;

3. высокая стоимость препарата, связанная с нерациональным использованием большей части дорогостоящего препарата (50 мг препарата стоят 68,2 $), которая исключается из лечебного процесса из-за формирования соединительнотканной капсулы, препятствующей резорбции нокодазола.

Ввиду этих недостатков исключается возможность применения способа прототипа в медицине и ветеринарии в качестве противоэхинококкового средства системного действия.

Задачей изобретения является создание способа лечения ларвального эхинококкоза на основе нокодазола, обеспечивающего повышение эффективности терапии при низкой лечебной дозе препарата, отсутствие токсичности, а также снижение риска осложнений.

Поставленная задача решается способом лечения ларвального эхинококкоза лабораторных животных нокодазолом, отличающимся тем, что препарат вводят подкожно в количестве, не вызывающем образования соединительнотканной капсулы вокруг препарата, по 10 инъекций в сутки в суточной дозе 11-200 мг/кг, с интервалом в 3-4 дня, в точки, расположенные на дорзальной и вентральной поверхностях тела животного.

Изобретение основано на использовании впервые выявленного феномена полной резорбции из места инъекции введенной подкожно субстанции нокодазола в количестве, не вызывающем образования соединительнотканной капсулы вокруг препарата.

Практически способ осуществляется следующим образом. Экспериментально зараженному животному вводят подкожно водную суспензию нокодазола путем множественных точечных инъекций в точки, расположенные на дорзальной и вентральной поверхностях тела животного. Выполняют 10 инъекций в сутки два раза в неделю с интервалом в 3-4 дня, при суточной дозе, равной 11-200 мг/кг, которая наряду с продолжительностью лечения зависит от видов животных и возбудителей инвазии (у мышей, зараженных Е. granulosus - от 11 мг/кг, у хлопковых крыс, зараженных Е. multilocularis - 200 мг/кг).

Все инъекции проводят на расстоянии друг от друга, предотвращающем увеличение концентрации ДВ в месте инъекций и слияние соседних подкожных диффузий, способствующих формированию соединительнотканной капсулы вокруг препарата, которая препятствует постоянному и непрерывному поступлению ДВ в кровь животного.

Ввиду существенных отличительных признаков, приведенных в таблице 1, заявляемый способ имеет следующие преимущества перед способом прототипа:

- радикальный терапевтический эффект - паразитоцидное действие (деструкция герминативного слоя и зародышевых элементов паразита выявлена у 100% леченых животных) достигается при низких лечебных дозах препарата;

- не происходит накопление препарата в местах инъекций, в результате чего соединительнотканная капсула не образуется, создаются условия для полной резорбции нокодазола из множественных микродепо, что обеспечивает постоянное, непрерывное и продолжительное поступление препарата в кровь животного и весь введенный препарат участвует в лечебном процессе;

- применение низких лечебных доз нокодазола исключает токсическое действие препарата;

- отсутствует побочное действие препарата (спаечный процесс и петрификация);

- возможное применение препарата в клинических условиях благодаря высокой эффективности ДВ (оказывающего паразитоцидное действие на герминативные клетки паразита) и отсутствию побочного и токсического действий препарата в лечебных суточных дозах.

Эффективность предлагаемого способа иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1. Терапевтическую активность нокодазола (Aldrich Chemical Company, Inc., США), испытанного в виде суспензии в физиологическом растворе, оценивали при экспериментальном цистном эхинококкозе белых мышей на поздней стадии инвазии. 7 аутбредных мышей в возрасте 1 мес (самки) заражали внутрибрюшинно протосколексами Е. granulosus, выделенными из эхинококковых пузырей от убойной спонтанно инвазированной овцы по ранее описанному методу [2]. Каждое животное получило по 1000 зрелых протосколесов. Через 7,5 мес после заражения мыши были разделены на 2 группы: экспериментальную и контрольную. 4 мышей экспериментальной группы начинали лечить подкожными инъекциями водной суспензии нокодазола (ВСН) через 11,5 мес после заражения; остальные 3 мыши служили контролем. Препарат вводили 2 раза в неделю с интервалами в 3-4 дня. Продолжительность курса лечения составила 32 дня; всего за курс лечения животные получили 80 инъекций (по 10 инъекций в сутки) в точки, расположенные на дорзальной и вентральной поверхностях тела животного, в суммарной курсовой дозе 87-126 мг/кг (при минимальной суточной дозе - 11 мг/кг; средняя суточная доза составила - 13,2 мг/кг; количество ДВ на одну инъекцию в среднем - 1,3 мг). Взвешивание каждого леченого и контрольного животного начинали через 11,5 мес после заражения и проводили ежедневно в течение всего опыта. Исходную массу ларвоцист эхинококка (ИМЛ) у каждой леченой мыши определяли по формуле:

ИМЛ=МТи-МТпл+МЛпл,

где МТи, МТпл и МЛпл - масса тела животного исходная (в начале лечения), после лечения и масса ларвоцист после лечения соответственно. Всех мышей сравниваемых групп вскрывали через 12-14 мес после заражения, у каждой леченой мыши определяли показатель коллапса ларвоцист (ПКЛ), количество и жизнеспособность ларвоцист. ПКЛ вычисляли в процентах по формуле:

ПКЛ=МЛпл·100/МТи-МТпл,

где МТи и МТпл - массы тела животного исходная и после лечения соответственно.

У каждой леченой мыши отмечали наличие субстанции нокодазола в подкожной клетчатке после сепарирования участков кожи в местах инъекций ВСН на дорзальной и вентральной поверхностях тела животного.

Результаты вскрытия животных показали, что ВСН проявила высокую терапевтическую активность в сравнительно низких дозах ДВ на поздних стадиях инвазии (табл.2). У всех леченых мышей, вскрытых через 33-81 день после начала лечения установлена гибель всех выявленных в брюшной полости ларвоцист эхинококка.

Число погибших ларвоцист на 1 животное составляло 27-214 экземпляров, а их масса колебалась в пределах 8,1-10,4 г (22,7-31,0% от массы тела хозяина). Все выявленные ларвоцисты были спавшимися и содержали разрушенную герминативную оболочку. Губительное действие нокодазола сопровождалось высоким значением ПКЛ (57,5-75,9%) у всех излеченных животных. При исследовании подкожной клетчатки следов введенного нокодазола не обнаружено, что свидетельствовало о полной резорбции препарата из депо.

У контрольных мышей, павших от интенсивного эхинококкоза через 11,5-12 мес после заражения, масса паразитов на 1 животное составляла 34,0-54,0 г (76,7-186,6% от массы тела хозяина), а количество ларвоцист колебалось от 18 до 71 экземпляра.

Пример 2. Эффективность подкожных инъекций ВСН определяли при экспериментальном ларвальном альвеококкозе хлопковых крыс (Sigmodon hispidus). 11 хлопковых крыс обоего пола в возрасте 1-1,5 мес заражали внутрибрюшинно микроскопическими ацефалоцистами диаметром 100-300 мкм, выделенными из ларвоцист E.multilocularis от экспериментально зараженной хлопковой крысы - донора. Каждому животному вводили внутрибрюшинно по 200 ацефалоцист альвеококка, выделенных по ранее описанному методу [3]. Животных разделили на 2 группы. 3 хлопковые крысы экспериментальной группы получали ВСН подкожно в точки, расположенные на дорзальной и вентральной поверхностях тела животного, в суточной дозе 200 мг/кг. Вторая группа (8 животных) была контрольной. Лечение 3 животных экспериментальной группы начинали на 38 день после заражения при средней исходной массе ларвоцист альвеококка (СИМЛ), равной 3,25 г и составлявшей 2,2% от средней массы тела хозяина (СМТХ). ВСН вводили подкожно всего 8 дней (2 раза в неделю с интервалом 3-4 дня, в течение 4-х недель) по 10 инъекций в день в суточной дозе ДВ 200 мг/кг (количество ДВ на одну инъекцию - 2,4 мг) в точки, расположенные на дорзальной и вентральной поверхностях тела животного. Всего за весь курс животные получили 80 инъекций. Леченых и контрольных хлопковых крыс вскрывали на 82 день после заражения. При вскрытии определяли жизнеспособность, степень зрелости и массу всех выявленных ларвоцист альвеококка у каждого животного. Показателем зрелости ларвоцист служило наличие зрелых протосколексов. В экспериментальных и контрольных группах определяли среднюю массу ларвоцист на 1 животное (СМЛ) в граммах, ее отношение к СМТХ в процентах и индекс торможения роста паразитарных ларвоцист (ИТРПЛ) в процентах у леченых животных по сравнению с контрольными по формуле:

ИТПРЛ=(Мк-Мл)/(Мк-Ми)·100,

где Ми, Мк и Мл - средние значения массы ларвоцист эхинококка на 1 животное: исходной, у контрольных и леченых животных соответственно (3).

При вскрытии леченых и контрольных хлопковых крыс установлена гибель всех ларвоцист альвеококка у всех леченых животных. СМЛ у животных экспериментальной группы не превышала СИМЛ и составляла 2,84 г (2,1% от СМТХ). ИТПРЛ составлял 100% (табл.3). К этому сроку у контрольных животных все ларвоцисты были живыми, зрелыми; СМЛ была равна 87,84 г и составляла 77,2% от СМТХ. У всех леченых животных в подкожной клетчатке следов введенного нокодазола не обнаружено, что свидетельствовало о полной резорбции введенного препарата из депо в подкожной клетчатке.

Таким образом, заявляемый способ обеспечивает повышение эффективности нокодазола при низкой лечебной дозе препарата, а также профилактику осложнений.

При низком содержании в месте инъекции под кожей субстанция нокодазола обладает способностью подвергаться полной резорбции благодаря предотвращению тканевой реакции организма на препарат, проявляющейся в образовании соединительнотканной капсулы вокруг препарата.

Избежание попадания препарата в одну и ту же точку предотвращает увеличение концентрации ДВ в месте инъекции и обеспечивает рациональное использование препарата, профилактику формирования соединительной капсулы вокруг препарата в месте инъекции и связанных с этим осложнений.

Множественность инъекций препарата в день обеспечивает создание серии подкожных микродепо, что создает условия для постоянного, непрерывного и продолжительного поступления нокодазола в кровь животного и обеспечивает повышение эффективности лечения.

Таблица 1
Сравнение отличительных признаков способов лечения ларвальных эхинококкозов лабораторных животных заявляемого и прототипа
Отличительный признак	Способы
	прототипа	заявляемый
Способ парентерального введения препарата	внутрибрюшинный	подкожный
Повторность введения препарата	однократное	многократное
Общее число инъекций на весь курс лечения	1	80
Масса действующего вещества на одну инъекцию, мг	60	1,1-2,4
Минимальные лечебные суточные дозы, мг/кг	500	11-200
Эффективность способа при экспериментальном альвеококкозе хлопковых крыс	неэффективен (ввиду паразитостатического действия на герминативные клетки паразита)	эффективен (ввиду паразитоцидного действия на герминативные клетки паразита)
Деструкция герминативного слоя и зародышевых элементов паразита	отсутствует	выявлена у 100% леченых животных
Значение индекса торможения роста паразитарных ларвоцист (ИТРПЛ)	ИТРПЛ=91,0%	ИТРПЛ=100%
Степень резорбции препарата из места инъекции	частичная (из-за использования большой массы ДВ на одну инъекцию, вследствие чего формируется соединительнотканная капсула вокруг конгломератов препарата, большая часть которого исключается из лечебного процесса)	полная (благодаря применению малого количества ДВ на одну инъекцию формирование соединительнотканной капсулы не происходит, и весь введенный препарат участвует в лечебном процессе)
Условия для эффективной химиотерапии	отсутствуют (ограниченное и прекращающееся со временем поступление ДВ в кровь животного из крупных конгломератов внутрибрюшинного депо)	создаются (постоянное, непрерывное и продолжительное поступление ДВ в кровь животного из множественных подкожных микродепо)
Побочное действие	присутствует (в результате использования высоких доз ДВ и внутрибрюшинного способа введения происходит формирование соединительнотканной капсулы вокруг препарата, сопровождающееся выраженным спаечным процессом и петрификацией)	отсутствует (ввиду применения низких суточных доз ДВ)
Токсическое действие	выраженное острое (применение нокодазола в дозе 250 мг/кг проявляется картиной острого отравления и гибелью животных на 2-4 сутки)	исключено (ввиду использования низких разовых доз ДВ)
Возможность применения в клинических условиях	исключена (ввиду низкой эффективности препарата и применения высоких токсических доз ДВ, вызывающих осложнения)	имеется (благодаря высокой эффективности ДВ, оказывающего паразитоцидное действие на герминативные клетки паразита и отсутствие побочного и токсического действий препарата в лечебных суточных дозах)

Источники информации

1. Джабарова В.И., Кротов А.И., Колосова М.О. и другие. Экспериментальная химиотерапия альвеококкоза. Сообщение VIII. Сравнительная эффективность и токсичность нокодазола и мебендазола. Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 1983, № 5, 96, 65-68.

2. Коваленко Ф.П., Кротов А.И., Буданова И.С., Разаков Ш.А. Экспериментальная терапия эхинококкоза. Сообщение I. Лабораторная модель эхинококкоза и влияние на развитие ларвоцист Echinococcus granulosus сарколизинакридина, левамизола и мебендазола. Медицинская паразитология и паразитарные болезни 1976, № 5, 546-551.

3. Коваленко Ф.П. Экспериментальные модели эхинококкоза: оптимизация и применения в разработке новых методов диагностики профилактики и лечения эхинококкозов человека и животных. Дисс. д.м.н., 1998, 59 с.

4. Hong F.D., Chen J., Donovan S. et al. Taxol, vincristine or nocodazole induces lethality in Gj-checkpoint- defective human astrocytoma U373MG cells by triggering hyperploid progression. Carcinogenesis 1999, vol.20, nol.7, pp.1161-1168.

5. Horton R.J. Albendazole in treatment of human cystic echinococcosis: 12 years of experience. Acta Trop., 1997, 64:79-93.

6. Hye Joung Choi, Masayuki Fukui, Bao Ting Zhu. Role of Cyclin B1/Cdc2 Up-Regulation in the Development of Mitotic Prometaphase Arrest in Human Breast Cancer Cells Treated with Nocodazole. PloS ONE 2011, 6 (8): e24312. doi:10.1371/jornal.pone.0024312.

7. Morris D.L., Dykes P.W., Dickson B., Marriner S.E., Bogan J.A., Burrows F.G. Albendazole in hydatid disease. Br Med J (Clin Res Ed) 1983, 286:103-104.

8. Torgerson P.R, Keller K., Magnotta M., Ragland N. The global burden of alveolar echinococcosis. PLoS Negl Dis 2010, 4(6): e722. doi: 10.1371/jourenal.pntd.0000722.

9. Stojkovic M., Zwahlen M., Teggi A. et al. Treatment Response of Cystic Echinococcosis to Benzimidazoles: A Systematic Review. PLoS Negl Trop Dis(2009, Sep 29;3(9):e524.

10.Yuan-Soon Ho, Jiing-Shium, Jiiang-Huei et al. Griseofulvin potentiates anti-tumorigenesis effects of nocodazole through induction of apoptosis and G2/M cell cycle arrest in human colorectal cancer cells. J Cancer - 2001, 91, 393-401.

11. Wang Y.J., Jeng J.H., Chen R.J., et al. Ketoconazole potentiates the antitumor effects of nocodazole: In vivo therapy for human tumor xenografts in nude mice. // Molecular Carcinogenesis 2002, 34(4): 199-210.