низкомолекулярное полисульфатированное производное гиалуроновой кислоты и содержащее его лекарственное средство

Формула изобретения

1. Средство для профилактики и/или лечения аллергического заболевания, выбранного из поллиноза, аллергического ринита, аллергического конъюнктивита, атопического дерматита и астмы, содержащее в качестве активного ингредиента низкомолекулярное полисульфатированное производное гиалуроновой кислоты, соответствующее следующей общей формуле (IA) или (IB), или его фармацевтически приемлемую соль:



где n представляет собой число от 0 до 15; X соответствует следующей формуле (a) или (b):



Y соответствует следующей формуле (c), (d) или (e):



каждый из R независимо представляет собой атом водорода или группу SO₃H, при условии, что группы SO₃H составляют от 80 до 100% от общего числа R; R ¹ представляет собой -OH, -OSO₃H или -NZ ₁Z₂, где каждый из Z₁ и Z₂ независимо представляет собой атом водорода, -SO₃ H, необязательно замещенную фенильную группу, где заместитель выбран из атома галогена, карбоксигруппы, бензильной группы или пиридильной группы, или -NZ₁Z₂ в совокупности представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из фенилаланина, пролина и триптофана, или пептидный остаток, выбранный из глицилфенилаланина, фенилаланилглицина и фенилаланилглицилглицина, где аминокислотный остаток или пептидный остаток могут быть амидированными на их концевой карбоксильной группе; и каждая * представляет собой место присоединения к атому кислорода;

где n представляет собой число от 0 до 15; W соответствует следующей формуле (f) или (g):

каждый R независимо представляет собой атом водорода или группу SO₃H, при условии, что группы SO₃H составляют от 80 до 100% от общего числа R; R ¹ представляет собой -OH, -OSO₃H или -NZ ₁Z₂, где каждый из Z₁ и Z₂ независимо представляет собой атом водорода, -SO₃ H, необязательно замещенную фенильную группу, где заместитель выбран из атома галогена, карбоксигруппы, бензильной группы или пиридильной группы, или -NZ₁Z₂ в совокупности представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из фенилаланина, пролина и триптофана, или пептидный остаток, выбранный из глицилфенилаланина, фенилаланилглицина и фенилаланилглицилглицина, где аминокислотный остаток или пептидный остаток могут быть амидированными на их концевой карбоксильной группе; и каждая * представляет собой место присоединения к атому кислорода.

2. Средство для профилактики и/или лечения по п.1, где Y в общей формуле (IA) соответствует формуле (d) или (е).

3. Средство для профилактики и/или лечения по п.2, где X соответствует формуле (а).

4. Средство для профилактики и/или лечения по п.3, где n равно 3, 4 или 5.

5. Средство для профилактики и/или лечения по п.3, где n равно 4 или 5.

6. Средство для профилактики и/или лечения по п.1, где низкомолекулярное полисульфатированное производное гиалуроновой кислоты соответствует общей формуле (IB) .

7. Средство для профилактики и/или лечения по п.6, где n равно 3, 4 или 5.

8. Средство для профилактики и/или лечения по п.6, где n равно 4 или 5.

9. Применение низкомолекулярного полисульфатированного производного гиалуроновой кислоты или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1-8 для изготовления средства для профилактики и/или лечения аллергического заболевания, выбранного из поллиноза, аллергического ринита, аллергического конъюнктивита, атопического дерматита и астмы.

10. Способ профилактики и/или лечения аллергического заболевания, выбранного из поллиноза, аллергического ринита, аллергического конъюнктивита, атопического дерматита и астмы, включающий введение человеку или животному эффективной дозы низкомолекулярного полисульфатированного производного гиалуроновой кислоты или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из пп.1-8.

11. Низкомолекулярное полисульфатированное производное гиалуроновой кислоты, соответствующее общей формуле (IA') или (IB), или его фармацевтически приемлемая соль:

где n представляет собой число от 0 до 15; X соответствует следующей формуле (a) или (b):



Y' соответствует следующей формуле (d) или (е);

каждый R независимо представляет собой атом водорода или группу SO₃H, при условии, что группы SO₃ H составляют от 80 до 100% от общего числа R; R¹ представляет собой -OH, -OSO₃H или -NZ₁Z₂ , где каждый из Z₁ и Z₂ независимо представляет собой атом водорода, -SO₃H, необязательно замещенную фенильную группу, где заместитель выбран из атома галогена, карбоксигруппы, бензильной группы или пиридильной группы, или -NZ₁ Z₂ в совокупности представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из фенилаланина, пролина и триптофана, или пептидный остаток, выбранный из глицилфенилаланина, фенилаланилглицина и фенилаланилглицилглицина, где аминокислотный остаток или пептидный остаток могут быть амидированными на их концевой карбоксильной группе; и каждая * представляет собой место присоединения к атому кислорода;



где n представляет собой число от 0 до 15; W соответствует следующей формуле (f) или (g):



каждый R независимо представляет собой атом водорода или группу SO₃H, при условии, что группы SO₃H составляют от 80 до 100% от общего числа R; R ¹ представляет собой -OH, -OSO₃H или -NZ ₁Z₂, где каждый из Z₁ и Z₂ независимо представляет собой атом водорода, -SO₃ H, необязательно замещенную фенильную группу, где заместитель выбран из атома галогена, карбоксигруппы, бензильной группы или пиридильной группы, или -NZ₁Z₂ в совокупности представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из фенилаланина, пролина и триптофана, или пептидный остаток, выбранный из глицилфенилаланина, фенилаланилглицина и фенилаланилглицилглицина, где аминокислотный остаток или пептидный остаток могут быть амидированными на их концевой карбоксильной группе; и каждая * представляет собой место присоединения к атому кислорода.

12. Низкомолекулярное полисульфатированное производное гиалуроновой кислоты или его фармацевтически приемлемая соль по п.11, где X в общей формуле (IA^') соответствует формуле (а).

13. Низкомолекулярное полисульфатированное производное гиалуроновой кислоты или его фармацевтически приемлемая соль по п.11, которое соответствует общей формуле (IB).

14. Низкомолекулярное полисульфатированное производное гиалуроновой кислоты или его фармацевтически приемлемая соль по п.12 или 13, где n представляет собой 3, 4 или 5.

15. Фармацевтическая композиция для профилактики и/или лечения аллергического заболевания, такого как поллиноз, аллергический ринит, аллергический конъюнктивит, атопический дерматит и астма, содержащая эффективное количество низкомолекулярного полисульфатированного производного гиалуроновой кислоты или его фармацевтически приемлемой соли по пп.11-14 и фармацевтически приемлемый эксципиент.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Настоящее изобретение относится к низкомолекулярному полисульфатированному производному гиалуроновой кислоты (HAPS), пригодному для профилактики и/или лечения аллергических заболеваний.

Уровень техники

Гиалуроновая кислота представляет собой линейный полимерный полисахарид, в котором поочередно связаны -D-N-ацетилглюкозамин и -D-глюкуроновая кислота, она является относительно легко доступным мукополисахаридом и проявляет определенные физико-химические свойства и физиологические свойства, и таким образом, саму гиалуроновую кислоту и ее различные производные используют в качестве фармацевтических и косметических средств.

Например, известно, что полисульфатированную гиалуроновую кислоту, которая представляет собой производное гиалуроновой кислоты, обладает активностью ингибирования калликреин-кининовой системы (патентный документ 1) и активностью ингибирования фосфолипазы A2 (патентный документ 2), можно применять в качестве лекарственного средства от аллергического заболевания (патентный документ 3), и она проявляет сильное противовоспалительное действие, опосредуемое селектином, который является одной из молекул адгезии (патентный документ 4).

Кроме того, было описано, что полисульфатированные олигогиалуронаты, имеющие низкую молекулярную массу, такую как средневязкостная молекулярная масса 10000 или менее, можно использовать в качестве активного ингредиента для косметических средств, имеющих превосходную способность проникать через кожу (патентный документ 5), и полисульфатированные гиалуронановые олигосахариды в диапазоне от тетрасахарида до эйкозасахарида имеют антикоагулянтную активность и антигиалуронидазную активность, и их можно использовать в качестве противораковых средств (непатентный документ 1).

Патентные документы

[Патентный документ 1] JP-A-1999-147901

[Патентный документ 2] JP-A-1999-269077

[Патентный документ 3] JP-A-1999-335288

[Патентный документ 4] JP-A-1996-277224

[Патентный документ 5] JP-A-1998-195107

Непатентные документы

[Непатентный документ 1] Glycobiology, vol.11, No.1, pp. 57-64

Сущность изобретения

Однако указанные выше полисульфатированная гиалуроновая кислота и полисульфатированный олигомер гиалуронана сами по себе обладают стимулирующим действием, таким как повышение проницаемости сосудов, и, таким образом, некоторые из них не пригодны для клинических применений. Дело в том, что только небольшое число этих соединений удовлетворяет всем требованиям, таким как фармакологическая активность и безопасность.

Настоящее изобретение относится к предоставлению низкомолекулярного производного гиалуроновой кислоты, не вызывающего таких проблем и пригодного для профилактики и/или лечения аллергического заболевания.

Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования для разработки соединения, пригодного для профилактики и/или лечения аллергического заболевания, и в результате авторы изобретения открыли, что низкомолекулярные полисульфатированные производные гиалуроновой кислоты, соответствующие общим формулам (IA) и (IB), обладают противоаллергическим и противовоспалительным действием и не обладают активностью в отношении повышения проницаемости сосудов, и, таким образом, пригодны в качестве фармацевтических средств.

Таким образом, настоящее изобретение относится к следующим средствам с (1) по (15):

(1) средство для профилактики и/или лечения аллергического заболевания, выбранного из поллиноза, аллергического ринита, аллергического конъюнктивита, атопического дерматита и астмы, содержащее в качестве активного ингредиента низкомолекулярное полисульфатированное производное гиалуроновой кислоты, соответствующее следующей общей формуле (IA) или (IB), или его фармацевтически приемлемую соль:

где n представляет собой число от 0 до 15; X соответствует следующей формуле (a) или (b):

Y соответствует следующей формуле (c), (d) или (e):

каждый из R независимо представляет собой атом водорода или группу SO₃H (при условии, что группы SO₃H составляют от 80 до 100% от общего числа R); R¹ представляет собой -OH, -OSO₃ H или -NZ₁Z₂ (где каждый из Z₁ и Z₂ независимо представляет собой атом водорода, -SO₃H, необязательно замещенную низшую алкильную группу, необязательно замещенную арильную группу, необязательно замещенную аралкильную группу, или необязательно замещенную гетероарильную группу, или -NZ₁Z₂ в совокупности представляет собой аминокислотный остаток или пептидный остаток); и каждая * представляет собой место присоединения к атому кислорода);

где n представляет собой число от 0 до 15; W соответствует следующей формуле (f) или (g):

каждый R независимо представляет собой атом водорода или группу SO₃H (при условии, что группы SO₃H составляют от 80 до 100% от общего числа R); R¹ представляет собой -OH, -OSO₃H или -NZ ₁Z₂ (где каждый из Z₁ и Z₂ независимо представляет собой атом водорода, -SO₃ H, необязательно замещенную низшую алкильную группу, необязательно замещенную арильную группу, необязательно замещенную аралкильную группу или необязательно замещенную гетероарильную группу, или -NZ₁Z₂ в совокупности представляет собой аминокислотный остаток или пептидный остаток); и каждая * представляет собой место присоединения к атому кислорода).

(2) средство для профилактики и/или лечения согласно (1) выше, где Y в общей формуле (IA) соответствует формуле (d) или (e);

(3) средство для профилактики и/или лечения согласно (2) выше, где X соответствует формуле (a);

(4) средство для профилактики и/или лечения согласно (3) выше, где n равно 3, 4 или 5;

(5) средство для профилактики и/или лечения согласно (3) выше, где n равно 4 или 5;

(6) средство для профилактики и/или лечения согласно (1) выше, где низкомолекулярное полисульфатированное производное гиалуроновой кислоты соответствует общей формуле (IB);

(7) средство для профилактики и/или лечения согласно (6) выше, где n равно 3, 4 или 5;

(8) средство для профилактики и/или лечения согласно (6) выше, где n равно 4 или 5;

(9) применение низкомолекулярного полисульфатированного производного гиалуроновой кислоты или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из (1)-(8) выше, для изготовления средства для профилактики и/или лечения аллергического заболевания, выбранного из поллиноза, аллергического ринита, аллергического конъюнктивита, атопического дерматита и астмы;

(10) способ профилактики и/или лечения аллергического заболевания, выбранного из поллиноза, аллергического ринита, аллергического конъюнктивита, атопического дерматита и астмы, включающий введение человеку или животному эффективной дозы низкомолекулярного полисульфатированного производного гиалуроновой кислоты или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из (1)-(8) выше;

(11) низкомолекулярное полисульфатированное производное гиалуроновой кислоты, соответствующее общей формуле (IA') или (IB), или его фармацевтически приемлемая соль:

где n представляет собой число от 0 до 15; X соответствует следующей формуле (a) или (b):

Y' соответствует следующей формуле (d) или (e);

каждый R независимо представляет собой атом водорода или группу SO₃H (при условии, что группы SO₃H составляют от 80 до 100% от общего числа R); R¹ представляет собой -OH, -OSO₃H или - _{1 2} (где каждый из Z₁ и Z₂ независимо представляет собой атом водорода, -SO₃ H, необязательно замещенную низшую алкильную группу, необязательно замещенную арильную группу, необязательно замещенную аралкильную группу или необязательно замещенную гетероарильную группу, или - _{1 2} в совокупности представляет собой аминокислотный остаток или пептидный остаток); и каждая * представляет собой место присоединения к атому кислорода;

где n представляет собой число от 0 до 15; W соответствует следующей формуле (f) или (g):

каждый R независимо представляет собой атом водорода или группу SO₃H (при условии, что группы SO₃H составляют от 80 до 100% от общего числа R); R¹ представляет собой -OH, -OSO₃H или -NZ ₁Z₂ (где каждый из Z₁ и Z₂ независимо представляет собой атом водорода, -SO₃ H, необязательно замещенную низшую алкильную группу, необязательно замещенную арильную группу, необязательно замещенную аралкильную группу или необязательно замещенную гетероарильную группу, или -NZ₁Z₂ в совокупности представляет собой аминокислотный остаток или пептидный остаток); и каждая * представляет собой место присоединения к атому кислорода);

(12) низкомолекулярное полисульфатированное производное гиалуроновой кислоты или его фармацевтически приемлемая соль согласно (11) выше, где X в общей формуле (IA') соответствует формуле (a);

(13) низкомолекулярное полисульфатированное производное гиалуроновой кислоты или его фармацевтически приемлемая соль согласно (11) выше, которые соответствуют общей формуле (IB);

(14) низкомолекулярное полисульфатированное производное гиалуроновой кислоты или его фармацевтически приемлемая соль согласно (12) или (13) выше, где n представляет собой 3, 4 или 5; и

(15) фармацевтическая композиция, содержащая низкомолекулярное полисульфатированное производное гиалуроновой кислоты или его фармацевтически приемлемую соль согласно (11), (12), (13) или (14) выше и фармацевтически приемлемый эксципиент.

Эффекты изобретения

Низкомолекулярное полисульфатированное производное гиалуроновой кислоты или его фармацевтически приемлемая соль по настоящему изобретению обладают превосходным противоаллергическим действием и превосходным противовоспалительным действием и не обладают активностью в отношении повышения проницаемости сосудов, и, таким образом, их можно использовать в качестве средства для профилактики и/или лечения аллергических заболеваний, таких как поллиноз, аллергический ринит, аллергический конъюнктивит, атопический дерматит и астма, средства, оказывающего небольшие побочные эффекты и являющегося превосходным с точки зрения безопасности. Кроме того, среди низкомолекулярных полисульфатированных производных гиалуроновой кислоты или их фармацевтически приемлемых солей по настоящему изобретению, в частности, группы соединений, соответствующих общей формуле (IA), где Y соответствует формуле (d) или (e), и группы соединений, соответствующих общей формуле (IB), имеют преимущества в том, что соединения этих групп являются высокостабильными в водных растворах и, таким образом, им легко придать форму препаратов.

Краткое описание рисунков

На ФИГ.1 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 1.

На ФИГ.2 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 2.

На ФИГ.3 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 3.

На ФИГ.4 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 4.

На ФИГ.5 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 5.

На ФИГ.6 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 6.

На ФИГ.7 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 7.

На ФИГ.8 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 8.

На ФИГ.9 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 9.

На ФИГ.10 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 10.

На ФИГ.11 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 11.

На ФИГ.12 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 14.

На ФИГ.13 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 15.

На ФИГ.14 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 16.

На ФИГ.15 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 17.

На ФИГ.16 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 18.

На ФИГ.17 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 19.

На ФИГ.18 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 20.

На ФИГ.19 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 21.

На ФИГ.20 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 22.

На ФИГ.21 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 23.

На ФИГ.22 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 24.

На ФИГ.23 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 25.

На ФИГ.24 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 26.

На ФИГ.25 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 27.

На ФИГ.26 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 28.

На ФИГ.27 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 29.

На ФИГ.28 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 30.

На ФИГ.29 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 31.

На ФИГ.30 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 32.

На ФИГ.31 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 33.

На ФИГ.32 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 34.

На ФИГ.33 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 35.

На ФИГ.34 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 36.

На ФИГ.35 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 37.

На ФИГ.36 представлена диаграмма 1H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 38.

На ФИГ.37 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 39.

На ФИГ.38 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 40.

На ФИГ.39 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 41.

На ФИГ.40 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 42.

На ФИГ.41 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 43.

На ФИГ.42 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 44.

На ФИГ.43 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 45.

На ФИГ.44 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 46.

На ФИГ.45 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 47.

На ФИГ.46 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 48.

На ФИГ.47 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 49.

На ФИГ.48 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 50.

На ФИГ.49 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 51.

На ФИГ.50 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 52.

На ФИГ.51 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 53.

На ФИГ.52 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения, полученного согласно примеру получения 54.

На ФИГ.53 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 1.

На ФИГ.54 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения 2.

На ФИГ.55 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 3.

На ФИГ.56 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 4.

На ФИГ.57 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения 5.

На ФИГ.58 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 6.

На ФИГ.59 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 7.

На ФИГ.60 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения 8.

На ФИГ.61 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 9.

На ФИГ.62 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 10.

На ФИГ.63 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения 11.

На ФИГ.64 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 14.

На ФИГ.65 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 15.

На ФИГ.66 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения 16.

На ФИГ.67 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 17.

На ФИГ.68 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 18.

На ФИГ.69 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения 19.

На ФИГ.70 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 20.

На ФИГ.71 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 21.

На ФИГ.72 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения 22.

На ФИГ.73 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 23.

На ФИГ.74 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 24.

На ФИГ.75 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения 25.

На ФИГ.76 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 26.

На ФИГ.77 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 27.

На ФИГ.78 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения 28.

На ФИГ.79 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 29.

На ФИГ.80 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 30.

На ФИГ.81 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения 31.

На ФИГ.82 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 32.

На ФИГ.83 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 33.

На ФИГ.84 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения 34.

На ФИГ.85 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 35.

На ФИГ.86 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 36.

На ФИГ.87 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения 37.

На ФИГ.88 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 38.

На ФИГ.89 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 39.

На ФИГ.90 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения 40.

На ФИГ.91 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 41.

На ФИГ.92 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 42.

На ФИГ.93 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения 43.

На ФИГ.94 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 44.

На ФИГ.95 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 45.

На ФИГ.96 представлена диаграмма ¹ H-ЯМР для соединения 46.

На ФИГ.97 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 47.

На ФИГ.98 представлена диаграмма ¹H-ЯМР для соединения 48.

На ФИГ.99 представлен график, на котором показан ингибирующий эффект на аллергический ответ немедленного типа. ###: p<0,01, ##: p<0,01, : p<0,05, *: p<0,05, **: P<0,01, N=8, среднее значение +/- SE.

На ФИГ.100 представлен график, иллюстрирующий ингибирующий эффект на замедленный аллергический ответ. ###: p<0,01, ##: p<0,01, : p<0,05, *: p<0,05, **: P<0,01, N=8, среднее значение +/- SE.

На ФИГ.101 представлен график, иллюстрирующий активность в отношении повышения проницаемости сосудов. dex: точка введения декстрана. Контроль: точка введения сульфатированной гиалуроновой кислоты.

На ФИГ.102 представлен график, иллюстрирующий активность в отношении повышения проницаемости сосудов. dex: точка введения декстрана. Контроль: точка введения сульфатированной гиалуроновой кислоты.

На ФИГ.103 представлен график, иллюстрирующий активность в отношении повышения проницаемости сосудов. dex: точка введения декстрана. Контроль: точка введения сульфатированной гиалуроновой кислоты.

Подробное описание изобретения

Низкомолекулярное полисульфатированное производное гиалуроновой кислоты по настоящему изобретению представляет собой производное, в котором все гидроксильные группы в олигомере гиалуронана являются избыточно сульфатированными и степень его сульфатации (или степень замещения) является такой, что, например, группы SO₃H составляют от 80 до 100% от общего числа (во всем олигомере) R в общей формуле (IA) и (IB) и группы SO₃H предпочтительно составляют от 90 до 100%. Группы SO₃H в олигомере могут быть неравномерно распределены, однако, как правило, олигомер, в котором группы SO₃H распределены равномерно по всей его молекуле, является предпочтительным с точки зрения его получения и применения.

Соединение, соответствующее общей формуле (IA), где Y соответствует формуле (d) или (e) (т.е. соединение, соответствующее общей формуле (IA')), и соединение, соответствующее общей формуле (IB), являются новыми соединениями, которые не описаны в каком-либо документе.

Примеры "низшего алкила" в необязательно замещенной низшей алкильной группе, необязательно замещенной арильной группе, необязательно замещенной аралкильной группе и необязательно замещенной гетероарильной группе, представленных как Z₁ и Z₂ в указанных выше общих формулах (IA) и (IB), включают линейные или разветвленные алкильные группы, имеющие от 1 до 6 атомов углерода (в дальнейшем в настоящем документе сокращенно обозначаемые как "C _1-6"), такие как метильная, этильная, н-пропильная, изопропильная, н-бутильная, изобутильная, втор-бутильная, трет-бутильная, н-пентильная и н-гексильная группы. Среди них предпочтительной является группа C_1-4алкила, более предпочтительными являются метильная, этильная, н-пропильная, изопропильная, н-бутильная, изобутильная, втор-бутильная и трет-бутильная группы и еще более предпочтительными являются метильная и этильная группа.

Примеры "арильной группы" включают C_6-14 , от моноциклических до трициклических, ароматические углеводородные кольцевые группы, такие как фенильная, нафтильная и антраценильная группы. Среди них предпочтительной является фенильная группа.

Примеры "гетероарильной группы" включают насыщенные или ненасыщенные, моноциклические или полициклические гетероциклические группы, имеющие по меньшей мере один гетероатом, выбранный из атома азота, атома серы и атома кислорода.

Конкретные примеры группы включают:

3-6-членные ненасыщенные моноциклические гетероциклические группы, имеющие от 1 до 4 атомов азота, такие как пирролильная, пирроринильная, имидазолильная, пиразолильная, пиридильная, пиримидинильная, пиразинильная, пиридазинильная, триазолильная, тетразолильная и тетрагидропиридильная группы;

3-7-членные насыщенные моноциклические гетероциклические группы, имеющие от 1 до 4 атомов азота, такие как пирролидинильная, имидазолизинильная, пиперидильная, пиперадинильная и гомопиперидильная группы;

ненасыщенные конденсированные гетероциклические группы, имеющие от 1 до 5 атомов азота, такие как индолильная, изоиндолильная, изоиндолинильная, бензимидазолильная, хинолильная, изохинолильная, имидазопиридильная, индазолильная, бензотриазолильная, тетразолопиризинильная, хиноксалинильная, пиридиновая, тетрагидропиридильная, тетрагидроизохинолильная, индолинильная и дигидропиролопиридильная группы;

насыщенные конденсированные гетероциклические группы, имеющие от 1 до 5 атомов азота, такие как пирролидинопиперазинильная, хинуклидинильная и пирролидинопиперидильная группы;

3-6-членные ненасыщенные моноциклические гетероциклические группы, имеющие атом кислорода, такие как пиранильная и фурильная группы;

3-6-членные насыщенные моноциклические гетероциклические группы, имеющие атом кислорода, такие как 1H-тетрагидропиранильная и тетрагидрофуранильная группы;

3-6-членные ненасыщенные моноциклические гетероциклические группы, имеющие один или два атома серы, такие как тиенильная группа;

3-6-членные ненасыщенные моноциклические гетероциклические группы, имеющие один или два атома кислорода и от одного до трех атомов азота, такие как оксазолильная, изооксазолильная, оксадиазолильная и оксадилинильная группы;

3-6-членные насыщенные моноциклические гетероциклические группы, имеющие один или два атома кислорода и от одного до трех атомов азота, такие как морфолинильная группа;

насыщенные конденсированные гетероциклические группы, имеющие один или два атома кислорода и от одного до трех атомов азота, такие как бензофуразанильная, бензоксазолильная и бензоксадиазолильная группы;

3-6-членные ненасыщенные моноциклические гетероциклические группы, имеющие один или два атома серы и от одного до трех атомов азота, такие как тиазолильная и тиадиазолильная группы;

3-6-членные насыщенные моноциклические гетероциклические группы, имеющие один или два атома серы и от одного до трех атомов азота, такие как тиазолизинильная группа;

ненасыщенные конденсированные гетероциклические группы, имеющие один или два атома серы и от одного до трех атомов азота, такие как бензотиазолильная, бензотиазолильная и тиазолотетрагидропиридильная группы; и

ненасыщенные конденсированные гетероциклические группы, имеющие один или два атома кислорода, такие как бензофуранильная, бензодиоксолильная и хроманильная группы.

Упомянутая выше "низшая алкильная группа" может быть замещена, например, атомом галогена, карбоксигруппой, арильной группой, низшей алкоксильной группой или ацильной группой, и каждая из упомянутых выше "арильной группы" и "гетероарильной группы" может быть замещена, например, атомом галогена, карбоксигруппой, низшей алкильной группой, низшей алкоксильной группой или ацильной группой.

В этом случае, примеры арильной группы включают фенильную и нафтильную группы, и примеры низшей алкильной группы включают упомянутые выше C _1-6алкильные группы.

Кроме того, примеры атома галогена включают фтор, хлор, бром и йод.

Кроме того, примеры низшей алкоксильной группы включают линейные или разветвленные C_1-6алкоксильные группы, такие как метокси, этокси, н-пропокси, изопропокси, н-бутокси, изобутокси, втор-бутокси, трет-бутокси, н-пентокси и н-гексокси. Среди них предпочтительной является C_1-4алкоксильная группа, более предпочтительными являются метокси-, этокси-, н-пропокси-, изопропокси-, н-бутокси-, изобутокси-, втор-бутокси- и трет-бутоксигруппа и еще более предпочтительными являются метокси- и этоксигруппа.

Примеры ацильной группы включают CHO, C_1-6 алкилкарбонильную, C_1-6алкоксикарбонильную, арилкарбонильную, арил-C_1-6алкиленкарбонильную, гетероарилкарбонильную и гетероарил-C_1-6алкиленкарбонильную группы.

В этом случае примеры C_1-6алкильной, C_1-6 алкокси-, арильной и гетероарильной групп являются такими же, как описано выше. Кроме того, примеры C_1-6алкиленовых групп включают линейные или разветвленные C_1-6алкиленовые группы, такие как метиленовая, этиленовая, триметиленовая, тетраметиленовая, пентаметиленовая, гексаметиленовая, пропиленовая, метилметиленовая, этилэтиленовая, 1,2-диметилэтиленовая и 1,1,2,2-тетраметилэтиленовая группы. Среди них предпочтительными являются метиленовая, этиленовая и триметиленовая группы.

Кроме того, примеры "аралкильной группы" включают арил-C_1-6алкильные группы. В этом случае, примеры арильных и C_1-6алкильных групп являются такими же, как описано выше. Однако пригодные аралкильные группы представляют собой, например, бензильную и фенэтильную группы.

Аралкильная группа может быть замещена, например, любой из иллюстративных групп, которыми может быть замещена указанная выше арильная группа или низшая алкильная группа.

"Необязательно замещенная низшая алкильная группа", которая представлена каждым из Z₁ и Z₂, предпочтительно представляет собой, например, трифторметильную, бензильную, 2-, 3- или 4-метилбензильную, 2-, 3- или 4-метоксибензильную, метоксиметильную или метоксикарбонилметильную группу,

"необязательно замещенная арильная группа", которая представлена каждым из Z₁ и Z₂, предпочтительно представляет собой, например, 2-, 3- или 4-метилфенильную, 2-, 3- или 4-метоксифенильную, 2-, 3- или 4-фторфенильную, 2-, 3- или 4-трифторметильную или 2-, 3- или 4-карбоксифенильную группу,

"необязательно замещенная аралкильная группа", которая представлена каждым из Z₁ и Z₂, предпочтительно представляет собой, например, бензильную, 3- или 4-метилбензильную или 2-, 3- или 4-метоксибензильную группу, и

"необязательно замещенная гетероарильная группа", которая представлена каждым из Z₁ и Z₂, предпочтительно представляет собой, например, 2-, 3- или 4-метилпиридильную, 2-, 3- или 4-метоксипиридильную, 2-, 3- или 4-фторпиридильную, 1, 2-, 3- или 4-трифторпиридильную или 2-, 3- или 4-карбоксипиридильную группу.

Примеры аминокислотного остатка или пептидного остатка, когда - _{1 2} в совокупности представляет собой аминокислотный остаток или пептидный остаток, включают: аминокислотные остатки, такие как аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, глутамин, глутаминовая кислота, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин, валин, -аланин, саркозин, фенилглицин, N-этилглицин, N-н-пропилглицин, N-изопропилглицин, N-н-бутилглицин, N-третбутилглицин, N-н-пентилглицин и N-н-гексилглицин; и пептидные остатки, такие как саркозилглицин, глицилглицин, глицилсаркозин, саркозилсаркозин, аланилглицин, -аланилфенилаланин, глицилфенилаланин, фенилаланилглицин, фенилаланилфенилаланин, глицилглицилглицин, N-этилглицилглицин, N-н-пропилглицилглицин, саркозилглицилглицин, N-этилглицилглицилглицин и фенилаланилглицилглицин. Аминокислотный остаток или пептидный остаток могут быть амидированными на их концевой карбоксильной группе.

В соединениях, соответствующих общим формулам (IA) или (IB), n представляет собой число от 0 до 15, предпочтительно от 3 до 9, более предпочтительно 3, 4 или 5 или еще более предпочтительно 4 или 5.

Соединения, соответствующие представленным выше общим формулам (IA) или (IB), включают различные стереоизомеры, оптические изомеры и сольваты, такие как гидрат.

Кроме того, пригодная соль низкомолекулярного полисульфатированного производного гиалуроновой кислоты по настоящему изобретению представляет собой фармацевтически приемлемую соль. Примеры соли включают: соли металлов, включающие соли щелочных металлов (такие как соль натрия и соль калия) и соли щелочноземельных металлов (такие как соль магния и соль кальция); соли с неорганическими основаниями, такие как соль аммония, и гидроксиды, карбонаты или гидрокарбонаты щелочных металлов (таких как натрий и калий) и щелочноземельных металлов (таких как магний и кальций); и соли с органическими основаниями, такими как органические амины (такие как триметиламин и триэтиламин), пиридин, хинолин, пиперидин, имидазол, пиколин, диметиламинопиридин, диметиланилин и N-метилморфолин.

Низкомолекулярное полисульфатированное производное гиалуроновой кислоты или его фармацевтически приемлемая соль по настоящему изобретению предпочтительно имеет среднюю молекулярную массу от 1500 до 13500, хотя средняя молекулярная масса варьирует в зависимости от типа солей.

Соединение, соответствующее общей формуле (IA) или (IB) по настоящему изобретению, можно получать, например, путем сульфатации низкомолекулярного производного гиалуроновой кислоты, соответствующего общей формуле (IIA) или (IIB), как показано в реакции 1 ниже. Упомянутые выше пригодные соли можно использовать в качестве исходных соединений или в качестве конечных соединений.

Кроме того, в следующих формулах заместители, представленные Z₃ и Z₄, соответствуют Z₁ и Z₂ соответственно, и значения соответствующих заместителей являются такими, как описано выше.

[Реакция-1]

[В формулах, X¹ соответствует следующему (a¹) или (b¹);

Y¹ соответствует следующему (c¹), (d¹) или (e¹);

W¹ соответствует следующему (f¹) или (g¹);

R^1' представляет собой -OH или -NZ₃Z₄ (где каждый из Z₃ и Z₄ независимо представляет собой атом водорода, необязательно замещенную низшую алкильную группу, необязательно замещенную арильную группу, необязательно замещенную аралкильную группу или необязательно замещенную гетероарильную группу, или -NZ₃Z₄ в совокупности представляет собой аминокислотный остаток или пептидный остаток); и каждый из n, X, Y, W, R и * является таким, как описано выше.]

Реакцию можно проводить с помощью известной реакции сульфатации, растворяя соединение (IIA) или (IIB) и сульфатирующий агент в подходящем растворителе и позволяя им реагировать при нагревании.

Примеры растворителя, используемого в настоящем изобретении, включают: N,N-диметилформамид, диметилсульфоксид, N-метилпирролидон, N,N-диметилацетамид, 1,1,3,3-тетраметилмочевину, пиридин и N,N-диметилакриламид; ионные жидкости, такие как гексафторфосфат 1-этил-3-метилимидазолия, тетрафторборат 1-бутил-1-метилпирролидиния и хлорид 1-бутилпиридиния, и растворители, представляющие собой их смесь.

Сульфатирующий агент, конкретно не ограничен, и предпочтительно используют комплексы ангидрида серной кислоты с пиридином, пиколином, 2,6-лутидином, триметиламином, триэтиламином, , -диметилформамидом, диоксаном и т.п., или серная кислота-дициклогексилкарбодиимид, хлорсульфон и т.п. Как правило, сульфатирующий агент предпочтительно используют в количестве от 1 до 100 эквивалентов относительно количества соединений формулы (IIA) или (IIB). Кроме того, в реакционную систему можно добавлять кислотный катализатор, такой как трифторуксусная кислота, трифторметансульфоновая кислота или сходные с ними.

Температура реакции и время реакции конкретно не ограничены, и например, они находятся в диапазоне от 0 до 120°C и от 30 минут до 20 суток соответственно.

Соединение, соответствующее общей формуле (IIA), где Y¹ соответствует формуле (d¹) или (e ¹), и R^1' представляет собой -OH, или соединение, соответствующее общей формуле (IIB), где R^1' представляет собой -OH, можно получать путем восстановления, показанного в представленной ниже реакции-2. Исходные соединения и конечные соединения могут представлять собой упомянутые выше пригодные соли.

[Реакция-2]

[В формуле, A¹ представляет собой следующий (h) или (i):

A² представляет собой следующие (j) или (k):

и n, ¹, и * являются такими, как описано выше.]

Таким образом, соединение (II-1) или (II-2) можно получать, подвергая соединение (III-1) или (III-2), например, восстановлению в подходящем растворителе в присутствии восстановителя.

Примеры растворителя для применения в реакции включают: воду; низшие спирты, такие как метанол, этанол, изопропанол, бутанол, трет-бутанол и этиленгликоль; ацетонитрил; жирные кислоты, такие как муравьиная кислота и уксусная кислота; простые эфиры, такие как диэтиловый эфир, тетрагидрофуран, диоксан, моноглим и диглим; ароматические углеводороды, такие как бензол, толуол и ксилол; галогенированные углеводороды, такие как дихлорметан, дихлорэтан, хлороформ и тетрахлорметан; N,N-диметилформамид; и их смешанные растворители.

Примеры восстановителя включают борогидрид натрия, боргидрид лития, боргидрид калия, борогидрид тетрабутиламмония, борогидрид цинка, три(втор-бутил)боргидрид лития, аналоги борана, диизобутилалюмогидрид и алюмогидрид лития.

Восстановитель, как правило, используют в количестве, приблизительно равном количеству моль соединения (III-1) или (III-2), умноженному на от 0,1 до 60.

В реакционную систему можно добавлять хлорид цинка, хлорид кобальта(II), хлорид самария(III), хлорид церия(III), хлорид титана(III), хлорид железа(II), хлорид железа(III), хлорид никеля(II) или сходные с ними в присутствии амина, такого как пиридин, триметиламин, триэтиламин или N-этилдиизопропиламин, неорганического основания, такого как гидроксид натрия, и/или лиганда, такого как диметилглиоксим, 2,2'-бипиридил или 1,10-фенантролин.

Восстановление также можно проводить каталитической гидрогенизацией в присутствии катализатора на основе переходного металла, такого как палладий или платина.

Реакцию можно проводить обычно при от -80 до 100°C, предпочтительно при приблизительно от -80 до 70°C, и, как правило, реакция завершается в течение приблизительно от 30 минут до 60 часов.

Соединение, соответствующее общей формуле (IIA), где Y¹ соответствует формуле (d¹) или (e ¹), и R^1' представляет собой -NZ₃ Z₄, или соединение, соответствующее общей формуле (IIB), где R^1' представляет собой -NZ₃ Z₄, можно получать реакцией восстановительного аминирования, представленной в реакции-3 ниже. Исходные соединения и конечные соединения могут представляет собой упомянутые выше пригодные соли.

[Реакция-3]

[В формуле каждый из A¹ , A², Z₃ и Z₄ является таким, как описано выше.]

Реакция представляет собой, например, реакцию, называемую реакцией восстановительного аминирования, в которой соединению (III-1) или (III-2) позволяют реагировать с амином (IV) в подходящем растворителе в присутствии восстановителя с образованием шифова основания с последующим восстановлением.

Амин (IV) обычно используют в количестве, приблизительно равном количеству моль соединения (III-1) или (III-2), умноженному на от 1 до 5.

Примеры растворителя для применения в реакции включают: воду; низшие спирты, такие как метанол, этанол, изопропанол, бутанол, трет-бутанол и этиленгликоль; ацетонитрил; жирные кислоты, такие как муравьиная кислота и уксусная кислота; простые эфиры, такие как диэтиловый эфир, тетрагидрофуран, диоксан, моноглим и диглим; ароматические углеводороды, такие как бензол, толуол и ксилол; галогенированные углеводороды, такие как дихлорметан, дихлорэтан, хлороформ и тетрахлорметан; ,N-диметилформамид; и их смешанные растворители.

Примеры восстановителя для применения в реакции включают борогидрид натрия, боргидрид лития, боргидрид калия, боргидрид тетрабутиламмония, цианотригидридоборат натрия и триацетоксигидроборат натрия. Восстановитель обычно используют в количестве, приблизительно равном количеству моль соединения (III), умноженному на от 0,1 до 60.

Реакцию можно проводить обычно при от -80 до 100°C, предпочтительно при приблизительно от -80 до 70°C, и, как правило, реакция завершается в течение приблизительно от 30 минут до 60 часов.

Реакцию можно проводить в присутствии органических кислот и их солей в количестве, равном количеству моль, умноженному на от 1 до 50, в соответствии с необходимостью. Примеры органических кислот или их солей включают уксусную кислоту, трифторуксусную кислоту и соли щелочных металлов этих кислот (такие как ацетат натрия).

В реакционную систему можно добавлять хлорид цинка, хлорид кобальта(II), хлорид самария(III), хлорид церия(III), хлорид титана(III), хлорид железа(II), хлорид железа(III), хлорид никеля(II) или сходные с ними в присутствии амина, такого как пиридин, триметиламин, триэтиламин или N-этилдиизопропиламин, неорганического основания, такого как гидроксид натрия, и/или лиганда, такого как диметилглиоксим, 2,2'-бипиридил или 1,10-фенантролин.

Кроме того, в реакционную систему можно добавлять подходящее количество борной кислоты.

Превращение между соединениями, имеющими четное количество сахаров, и соединениями, имеющими нечетное количество сахаров, можно проводить с помощью реакции-4 или реакции-5 с получением соединения, в котором один из структурных сахаров удален из исходного соединения.

[Реакция-4]

[В формулах A² является таким, как описано выше.]

Реакция представляет собой реакцию элиминирования N-ацетилглюкозамина с обработкой слабой щелочью при нагревании.

Соединение (VI) можно получать перемешиванием соединения (V) при нагревании в боратном буфере, имеющем pH 9,18, а затем способом Reissig et al. (Reissig. J. L., et al., J. Biol. Chem., 217, 959 (1955)).

Реакцию можно проводить, как правило, при приблизительно от 50 до 120°C, предпочтительно при приблизительно от 70 до 90°C, и, как правило, реакция завершается в течение приблизительно от 30 минут до 60 часов.

[Реакция-5]

[В формулах D¹ соответствует следующим (r) или (s), и

каждый из n и * является таким, как описано выше.]

Эта реакция представляет собой реакцию элиминирования глюкуроновой кислоты с использованием -глюкуронидазы.

Соединение (VIII) можно получить перемешиванием соединения (VII) в присутствии -глюкуронидазы в подходящем буфере.

Реакцию обычно можно проводить при температуре от комнатной температуры до 60°C, предпочтительно при приблизительно от 30 до 40°C, и, как правило, реакция завершается в течение приблизительно от 30 минут до 60 часов.

Каждое из конечных соединений, полученных в указанной выше схеме реакции, можно очищать способами очистки, обычно используемыми для различных модифицированных сахаридов. Конкретные способы очистки включают обессоливание с использованием гель-фильтрации, нейтрализации и диализа, сбор с использованием осаждения путем добавления органического растворителя и сбор путем сублимационной сушки.

Соединение по настоящему изобретению, как показано в примерах, описанных ниже, демонстрирует противоаллергическое действие и противовоспалительное действие и не демонстрирует какой-либо активности в отношении повышения проницаемости сосудов, и, таким образом, оно пригодно в фармацевтических средствах для профилактики и/или лечения аллергических заболеваний, таких как поллиноз, аллергический ринит, аллергический конъюнктивит, атопический дерматит и астма.

Эти фармацевтические средства получают в качестве общей формы медицинского состава с использованием соединения по настоящему изобретению и изготавливают с использованием разбавителя, такого как наполнитель, расширитель, связующее вещество, увлажнитель, дезинтегрирующее вещество, поверхностно-активное вещество, или смазывающее вещество, или эксципиент.

Эти фармацевтические средства можно выбирать из различных форм, в зависимости от терапевтических целей, и типичные примеры фармацевтических средств включают таблетку, пилюлю, порошок, жидкость, суспензию, эмульсию, гранулы, капсулу, суппозиторий, инъекционную форму (жидкость, суспензия и т.п.), глазные капли, мазь и ингалируемую форму.

При изготовлении таблетки можно использовать любой известный носитель. Их примеры включают: эксципиенты, такие как лактоза, сахароза, хлорид натрия, глюкоза, мочевина, крахмал, карбонат кальция, каолин и кристаллическая целлюлоза; связующие вещества, такие как вода, этанол, пропанол, простой сироп, жидкая глюкоза, жидкий крахмал, раствор желатина, карбоксиметилцеллюлоза, шеллак, метилцеллюлоза, фосфат калия и поливинилпирролидон; дезинтегрирующие вещества, такие как сухой крахмал, сложный эфир жирной кислоты и полиоксиэтилена сорбитана, лаурилсульфат натрия, моноглицерид стеариновой кислоты, крахмал и лактоза; ингибиторы дезинтеграции, такие как сахароза, стеарин, масло какао и гидрогенизированное масло; усиливающие всасывание средства, такие как четвертичное аммониевое основание и лаурилсульфат натрия; увлажнители, такие как глицерин и крахмал; адсорбенты, такие как крахмал, лактоза, каолин, бентонит и коллоидная кремниевая кислота; и смазывающие вещества, такие как очищенный тальк, стеарат, порошковая борная кислота и полиэтиленгликоль.

Кроме того, таблетку можно получать, при необходимости, в качестве покрытой таблетки. Их примеры включают покрытые сахаром средства, инкапсулированные в желатин таблетки, покрытые желудочно-резистентной оболочкой таблетки и покрытые пленкой таблетки или двухслойные таблетки и многослойные таблетки.

При изготовлении пилюли можно использовать любой известный носитель. Их примеры включают: эксципиенты, такие как глюкоза, лактоза, крахмал, масло какао, гидрогенизированное растительное масло, каолин и тальк; связующие вещества, такие как порошковый гуммиарабик, порошковый трагакант, желатин и этанол; и дезинтегрирующие вещества, такие как ламинаран и агар.

При изготовлении суппозитория можно использовать любой известный носитель. Их примеры включают полиэтиленгликоль, масло какао, высшие спирты, сложные эфиры высших спиртов, желатин и полусинтетический глицерид.

Когда фармацевтическое средство получают в качестве инъецируемого средства, предпочтительно, чтобы жидкость, эмульсия и суспензия были стерилизованными и изотоничными крови. Для получения жидкости, эмульсии и суспензии можно применять широко используемый и известный разбавитель. Примеры разбавителей включают воду, этанол, пропиленгликоль, этоксилированный изостеариловый спирт, полиоксилированный изостеариловый спирт и сложный эфир жирной кислоты и полиоксиэтилена сорбитана. В этом случае, медицинский состав может содержать хлорид натрия, глюкозу или глицерин в количестве, достаточном для доведения жидкости до изотонического состояния, и альтернативно медицинский состав может содержать, например, общепринятое солюбилизирующее вещество, буфер или смягчающее вещество, и он может содержать краситель, консервант, вкусовую добавку, придающую запах добавку, подсластитель или другое фармацевтическое вещество, в зависимости от необходимости.

Количество соединения по настоящему изобретению, содержащегося в фармацевтическом средстве, конкретно не ограничено, и его можно надлежащим образом выбирать из широкого диапазона. Как правило, предпочтительно, чтобы соединение по настоящему изобретению содержалось в количестве от 1 до 70 масс.% от массы фармацевтического средства.

Способ введения фармацевтического средства в соответствии с настоящим изобретением конкретно не ограничен, и фармацевтическое средство вводят любым способом, в зависимости от формы различных препаратов, возраста, пола и состояния заболевания пациента и других условий. Например, таблетку, пилюлю, жидкость, суспензию, эмульсию, гранулу и капсулу вводят перорально. Альтернативно инъекцию можно проводить отдельно или в комбинации с общепринятым восстановителем жидкости, таким как жидкость с глюкозой или жидкость с аминокислотами внутривенно, и более того, ее можно проводить отдельно внутримышечно, внутрикожно, подкожно или внутрибрюшинно, в зависимости от необходимости. Суппозиторий вводят ректально.

Дозировку указанного выше фармацевтического препарата можно надлежащим образом выбирать в зависимости от применения, возраста, пола и стадии заболевания у пациента и других условий, и фармацевтический препарат вводят в суточной дозировке от 0,001 до 100 мг, предпочтительно от 0,001 до 50 мг, на кг массы тела за один раз или несколькими порциями за сутки. Указанная выше дозировка варьирует, в зависимости от различных условий, в некоторых случаях достаточна меньшая дозировка, чем указанные выше диапазоны, а в других случаях необходима дозировка, превышающая указанные выше диапазоны.

ПРИМЕРЫ

Ниже настоящее изобретение объяснено более подробно с помощью иллюстрирующих примеров.

Определение ¹H-ЯМР проводили с использованием дейтерированной воды (D₂O) в качестве растворителя с помощью AVANCE III 400 (изготовленного Burker) или AVANCE 500 (изготовленного Burker).

Примеры получения с 1 по 54: Получение исходного соединения

Способы примеров получения 1-54, представленных ниже, использовали для получения исходных соединений, представленных в таблицах 1-7.

Масс-спектрометрию проводили с использованием Voyager DE-PRO (Applied Biosystems Japan Ltd.).

Пример получения 1

Гиалуронат натрия (BIO Sodium Hyaluronate HA9, изготовленный Shiseido Co., Ltd.) подвергали расщеплению полученной из семенников быка гиалуронидазой (Hyaluronidase Bovine 100KU, изготовлена Calbiochem Behring Corporation), способом, описанным в Glycobiology, vol. 12, No. 7, pp. 421 - 426, 2002, с получением 4-мерного олигосахарида гиалуронана. 4-мерный олигосахарид гиалуронана (20 мг) растворяли в метаноле (1 мл) и воде (0,5 мл) и к смеси добавляли боргидрид натрия (10 мг) при охлаждении льдом с последующим перемешиванием. Температуру полученного продукта повышали до комнатной температуры и смесь перемешивали в течение ночи. Завершение реакции подтверждали масс-спектрометрией.

К продукту добавляли 10% раствор уксусной кислоты в метаноле (0,5 мл) и воде (1 мл) при охлаждении льдом, а затем смесь концентрировали при пониженном давлении. Добавляли дополнительный 10% раствор уксусной кислоты в метаноле (0,5 мл) и продукт подвергали азеотропной перегонке. После этого добавляли метанол (2 мл) и продукт два раза подвергали азеотропной перегонке.

Осадок растворяли в воде (2 мл) и продукт фильтровали через дисковый фильтр (изготовленный Nihon Pall Ltd., 0,45 мкм). Фильтрат пропускали через короткую колонку (Dowex (зарегистрированный торговый знак) 50 Wx8, водородная форма, изготовлена Sigma-Aldrich Corporation) с получением протонированного соединения, а затем концентрировали при пониженном давлении. Для нанесения концентрата для гель-фильтрационной хроматографии (G-10, 16 мм × 600 мм, вода) для обессоливания использовали систему AKTA (изготовленную GE Healthcare Bioscience Bioprocess Corp.), а затем конечные фракции подвергали сублимационной сушке с получением конечного продукта (12 мг, белый порошок).

MS [M+Na]⁺: 846,21

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.1.

Пример получения 2

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 1, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 6-мерный олигосахарид гиалуронана (60 мг) с получением конечного продукта (50 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 1157,81

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.2.

Пример получения 3

8-мерный олигосахарид гиалуронана (60 мг) подвергали реакции с помощью того же процесса, что и в примере получения 1, с получением конечного продукта (51 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 1535,57

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.3.

Пример получения 4

10-мерный олигосахарид гиалуронана (60 мг) подвергали реакции с помощью того же процесса, что и в примере получения 1, с получением конечного продукта (48 мг, белый порошок).

MS [M-H] ^-: 1915,72

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.4.

Пример получения 5

12-мерный олигосахарид гиалуронана (60 мг) подвергали реакции с помощью того же процесса, что и в примере получения 1, с получением конечного продукта (60 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 2294,98

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.5.

Пример получения 6

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 1, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 14-мерный олигосахарид гиалуронана (20 мг), с получением конечного продукта (20 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.6.

Пример получения 7

16-мерный олигосахарид гиалуронана (10 мг) растворяли в метаноле (0,6 мл) и воде (0,3 мл) и к смеси добавляли боргидрид натрия (5 мг) при охлаждении льдом, а затем перемешивали. Температуру полученного продукта повышали до комнатной температуры и смесь перемешивали в течение ночи. Завершение реакции подтверждали масс-спектрометрией.

К продукту добавляли 10% раствор уксусной кислоты в метаноле (0,1 мл) и воде (0,2 мл) при охлаждении льдом, а затем смесь концентрировали при пониженном давлении.

Осадок растворяли в воде (1 мл) и продукт фильтровали через дисковый фильтр (изготовленный Nihon Pall Ltd., 0,45 мкм). Для нанесения концентрата для гель-фильтрационной хроматографии (G-10, 16 мм × 600 мм, вода) для обессоливания использовали систему AKTA (изготовленную GE Healthcare Bioscience Bioprocess Corp.), а затем конечные фракции подвергали сублимационной сушке с получением конечного продукта (10 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.7.

Пример получения 8

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 1, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 18-мерный олигосахарид гиалуронана (20 мг), с получением конечного продукта (20 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.8.

Пример получения 9

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 1, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 20-мерный олигосахарид гиалуронана (42 мг), с получением конечного продукта (40 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.9.

Пример получения 10

10-мерный олигосахарид гиалуронана (20 мг) растворяли в воде (0,8 мл), а затем охлаждали льдом. Антраниловую кислоту (30 мг), бороновую кислоту (40 мг), ацетат натрия (80 мг) и цианотригидридоборат натрия (5 мг) растворяли в метаноле (1 мл) и воде (0,2 мл). Полученный раствор добавляли к раствору 10-мерного олигосахарида гиалуронана, а затем перемешивали при 80°C в течение 5 часов. Завершение реакции подтверждали масс-спектрометрией.

Полученный продукт концентрировали при пониженном давлении и осадок растворяли в метаноле (1 мл) и воде (1 мл). Затем смесь фильтровали через дисковый фильтр (изготовленный Nihon Pall Ltd., 0,45 мкм). Фильтрат подвергали гель-фильтрационной хроматографии (LH-20, 18 мм × 500 мм, вода:метанол = 1:1) для очистки, а затем конечные фракции подвергали сублимационной сушке с получением конечного продукта (24 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.10.

Пример получения 11

10-мерный олигосахарид гиалуронана (20 мг) растворяли в воде (0,8 мл), а затем охлаждали льдом. Анилин (30 мг), бороновую кислоту (40 мг), ацетат натрия (80 мг) и цианотригидридоборат натрия (5 мг) растворяли в метаноле (1 мл) и воде (0,2 мл). Полученный раствор добавляли к раствору 10-мерного олигосахарида гиалуронана, а затем перемешивали при 80°C в течение 5 часов. Завершение реакции подтверждали масс-спектрометрией.

Полученный продукт концентрировали при пониженном давлении и осадок растворяли в метаноле (1 мл) и воде (1 мл). Затем смесь фильтровали через дисковый фильтр (изготовленный Nihon Pall Ltd., 0,45 мкм). Фильтрат подвергали гель-фильтрационной хроматографии (LH-20, 18 мм × 500 мм, вода:метанол = 1:1) для очистки, а затем конечные фракции подвергали сублимационной сушке с получением конечного продукта (17 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.11.

Пример получения 12

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 1, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 24-32-мерный олигосахарид гиалуронана (10 мг), с получением конечного продукта (10 мг, белый порошок).

Пример получения 13

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 1, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 34-46-мерный олигосахарид гиалуронана (10 мг), с получением конечного продукта (10 мг, белый порошок).

Структуры конечных продуктов примеров получения с 1 по 13 представлены в таблице 1 ниже

Пример получения 14

Гиалуронат натрия (BIO Sodium Hyaluronate HA9, изготовленный Shiseido Co., Ltd.) подвергали расщеплению полученной из семенников быка гиалуронидазой (Hyaluronidase Bovine 100KU, изготовлена Calbiochem Behring Corporation), способом, описанным в Glycobiology, vol. 12, No. 7, pp. 421 to 426, 2002, с получением 4-мерного олигосахарида гиалуронана. Полученный таким образом 4-мерный олигосахарид гиалуронана (40 мг) растворяли в боратном буфере (pH 9,18) (3 мл) и смесь перемешивали при 80°C в течение 1 часа. Температуру полученного продукта повышали до комнатной температуры и к смеси добавляли метанол (3 мл), а затем ее концентрировали при пониженном давлении. Осадок растворяли в воде (2 мл) и продукт фильтровали через дисковый фильтр (изготовленный Nihon Pall Ltd., 0,45 мкм). После этого для нанесения концентрата для гель-фильтрационной хроматографии (G-10, 16 мм × 600 мм, вода) для обессоливания использовали систему AKTA (изготовленную GE Healthcare Bioscience Bioprocess Corp.), а затем конечные фракции концентрировали с получением белого порошка.

После этого полученные порошки (25 мг) растворяли в метаноле (1 мл) и воде (0,5 мл) и к смеси добавляли боргидрид натрия (10 мг) при охлаждении льдом. Температуру полученного продукта повышали до комнатной температуры и смесь перемешивали в течение ночи. Завершение реакции подтверждали масс-спектрометрией. К продукту добавляли 10% раствор уксусной кислоты в метаноле (0,2 мл) при охлаждении льдом, а затем смесь концентрировали при пониженном давлении. Осадок растворяли в воде (2 мл) и продукт фильтровали через дисковый фильтр (изготовленный Nihon Pall Ltd., 0,45 мкм). После этого для нанесения концентрата для гель-фильтрационной хроматографии (G-10, 16 мм × 600 мм, вода) для обессоливания использовали систему AKTA (изготовленную GE Healthcare Bioscience Bioprocess Corp.), а затем конечные фракции подвергали сублимационной сушке с получением конечного продукта (18 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 573,45

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.12.

Пример получения 15

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 6-мерный олигосахарид гиалуронана (60 мг), с получением конечного продукта (34 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 953,02

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.13.

Пример получения 16

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 8-мерный олигосахарид гиалуронана (10 мг), с получением конечного продукта (8 мг, белый порошок).

MS [M-H] ^-: 1331,54

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.14.

Пример получения 17

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 10-мерный олигосахарид гиалуронана (10 мг), с получением конечного продукта (8 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 1710,28

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.15.

Пример получения 18

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 12-мерный олигосахарид гиалуронана (20 мг), с получением конечного продукта (16 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 2090,01

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.16.

Пример получения 19

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 14-мерный олигосахарид гиалуронана (18 мг), с получением конечного продукта (11 мг, белый порошок).

MS [M-H] ^-: 2469,52

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.17.

Пример получения 20

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 16-мерный олигосахарид гиалуронана (7 мг), с получением конечного продукта (5 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 2848,59

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.18.

Пример получения 21

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 18-мерный олигосахарид гиалуронана (10 мг), с получением конечного продукта (9 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 3225,70

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.19.

Пример получения 22

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 20-мерный олигосахарид гиалуронана (15 мг), с получением конечного продукта (13 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 3604,16

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.20.

Структуры конечных продуктов примеров получения с 14 по 22 представлены в таблице 2 ниже.

Пример получения 23

Соединение, полученное согласно примеру получения 1 (17 мг), растворяли в буфере (полученном смешением водного раствора хлорида натрия (300 мМ, 1 мл) и водного раствора ацетата натрия (200 мМ, 1 мл) и доведением pH до 5,2 ледяной уксусной кислотой) (2 мл) и к полученному продукту добавляли -глюкуронидазу типа B-1 бычьей печени (изготовленную Sigma-Aldrich Corporation) (8 мг), а затем инкубировали при 37°C в течение 8 часов. Реакционный раствор подвергали ультрафильтрации (Amicon Ultra 4 ml 10K Nominal Molecular Weight Limit, изготовлен Millipore Corporation) для очистки. После этого для нанесения концентрата для гель-фильтрационной хроматографии (G-10, 16 мм × 600 мм, вода) для обессоливания использовали систему AKTA (изготовленную GE Healthcare Bioscience Bioprocess Corp.), а затем конечные фракции подвергали сублимационной сушке с получением конечного продукта (8 мг, белый порошок).

MS [M-H] ^-: 601,18

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.21.

Пример получения 24

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 23, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 2 (11 мг), с получением конечного продукта (4 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 980,29

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.22.

Пример получения 25

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 23, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 3 (10 мг), с получением конечного продукта (8 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 1359,37

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.23.

Пример получения 26

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 23, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 4 (30 мг), с получением конечного продукта (15 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 1738,15

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.24.

Пример получения 27

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 23, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 5 (14 мг), с получением конечного продукта (7 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 2117,50

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.25.

Пример получения 28

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 23, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 9 (10 мг), с получением конечного продукта (5 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 3633,84

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.26.

Структуры конечных продуктов примеров получения с 23 по 28 представлены в таблице 3 ниже.

Пример получения 29

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 23, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 15 (15 мг), с получением конечного продукта (9 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 777,28

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.27.

Пример получения 30

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 23, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 16 (11 мг), с получением конечного продукта (7 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 1156,41

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.28.

Пример получения 31

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 23, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 17 (23 мг), с получением конечного продукта (15 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 1535,07

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.29.

Пример получения 32

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 23, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 18 (14 мг), с получением конечного продукта (8 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 1914,60

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.30.

Пример получения 33

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 23, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 22 (8 мг), с получением конечного продукта (5 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 3430,67

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.31.

Структуры конечных продуктов примеров получения с 29 по 33 представлены в таблице 4 ниже.

Пример получения 34

Гиалуронат натрия (Hyaluronic Acid FCH-SU, изготовленный FOOD CHEMIFA CO., LTD.) подвергали расщеплению гиалуронидазой, полученной из Streptomyces hyalurolyticus (Hyaluronidase "Amano" 1, изготовленная AmanoEnzyme Inc.) способом, описанным в Glycobiology, vol. 11, No. 1, pp. 47 to 64, 2001, с получением 4-мерного ненасыщенного олигосахарида гиалуронана. 4-мерный ненасыщенный олигосахарид гиалуронана (8 мг) растворяли в метаноле (2 мл) и воде (1 мл) и к смеси добавляли боргидрат натрия (4 мг) при охлаждении льдом, а затем перемешивали. Температуру полученного продукта повышали до комнатной температуры и смесь перемешивали в течение ночи. Завершение реакции подтверждали масс-спектрометрией. К продукту добавляли 10% раствор уксусной кислоты в метаноле (0,2 мл) при охлаждении льдом, а затем смесь концентрировали при пониженном давлении. После этого для нанесения концентрата для гель-фильтрационной хроматографии (G-10, 16 мм × 600 мм, вода) для обессоливания использовали систему AKTA (изготовленную GE Healthcare Bioscience Bioprocess Corp.), а затем конечные фракции подвергали сублимационной сушке с получением конечного продукта (3 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 759,61

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.32.

Пример получения 35

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 34, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 6-мерный ненасыщенный олигосахарид гиалуронана (10 мг), с получением конечного продукта (9 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 1139,15

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.33.

Пример получения 36

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 34, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 8-мерный ненасыщенный олигосахарид гиалуронана (10 мг), с получением конечного продукта (10 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 1518,49

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.34.

Пример получения 37

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 34, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 10-мерный ненасыщенный олигосахарид гиалуронана (10 мг), с получением конечного продукта (10 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 1897,57

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.35.

Пример получения 38

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 34, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 12-мерный ненасыщенный олигосахарид гиалуронана (10 мг), с получением конечного продукта (8 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 2276,99

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.36.

Пример получения 39

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 34, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 20-мерный ненасыщенный олигосахарид гиалуронана (12 мг), с получением конечного продукта (10 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 3792,03

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.37.

Структуры конечных продуктов примеров получения с 34 по 39 представлены в таблице 5 ниже.

Пример получения 40

Гиалуронат натрия (Hyaluronic Acid FCH-SU, изготовленный FOOD CHEMIFA CO., LTD.) подвергали расщеплению гиалуронидазой, полученной из Streptomyces hyalurolyticus (Hyaluronidase "Amano" 1, изготовленная AmanoEnzyme Inc.), способом, описанным в Glycobiology, vol. 11, No. 1, pp. 47 to 64, 2001, с получением 4-мерного ненасыщенного олигосахарида гиалуронана. Ненасыщенный 4-мерный олигосахарид гиалуронана (20 мг) растворяли в боратном буфере (pH 9,18) (1 мл) и смесь перемешивали при 80°C в течение 1 часа. Температуру полученного продукта повышали до комнатной температуры и к смеси добавляли метанол (3 мл), а затем ее концентрировали при пониженном давлении. Осадок растворяли в воде (2 мл) и продукт фильтровали через дисковый фильтр (изготовленный Nihon Pall Ltd., 0,45 мкм). После этого для нанесения концентрата для гель-фильтрационной хроматографии (G-10, 16 мм × 600 мм, вода) для обессоливания использовали систему AKTA (изготовленную GE Healthcare Bioscience Bioprocess Corp.), а затем конечные фракции концентрировали с получением белого порошка.

После этого полученные порошки (6 мг) растворяли в метаноле (1 мл) и воде (0,5 мл) и к смеси добавляли боргидрид натрия (10 мг) при охлаждении льдом. Температуру полученного продукта повышали до комнатной температуры и смесь перемешивали в течение ночи. Завершение реакции подтверждали масс-спектрометрией. К продукту добавляли 10% раствор уксусной кислоты в метаноле (0,2 мл) при охлаждении льдом, а затем смесь концентрировали при пониженном давлении. Осадок растворяли в воде (2 мл) и продукт фильтровали через дисковый фильтр (изготовленный Nihon Pall Ltd., 0,45 мкм). После этого для нанесения концентрата для гель-фильтрационной хроматографии (G-10, 16 мм × 600 мм, вода) для обессоливания использовали систему AKTA (изготовленную GE Healthcare Bioscience Bioprocess Corp.), а затем конечные фракции подвергали сублимационной сушке с получением конечного продукта (4 мг, белый порошок).

MS [M-H] ^-: 556,77

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.38.

Пример получения 41

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 40, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 6-мерный ненасыщенный олигосахарид гиалуронана (10 мг), с получением конечного продукта (7 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 935,49

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.39.

Пример получения 42

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 40, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 8-мерный ненасыщенный олигосахарид гиалуронана (10 мг), с получением конечного продукта (6 мг, белый порошок).

MS [M-H] ^-: 1314,21

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.40.

Пример получения 43

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 40, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 10-мерный ненасыщенный олигосахарид гиалуронана (10 мг), с получением конечного продукта (7 мг, белый порошок).

MS [M-H]^-: 1693,58

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.41.

Пример получения 44

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 40, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 12-мерный ненасыщенный олигосахарид гиалуронана (10 мг), с получением конечного продукта (6 мг, белый порошок).

MS [M-H] ^-: 2073,41

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.42.

Структуры конечных продуктов примеров получения с 40 по 44 представлены в таблице 6 ниже.

Пример получения 45

К 4-мерному олигосахариду гиалуронана (10 мг) добавляли раствор, в котором бензиламин (24 мг), бороновая кислота (20 мг), ацетат натрия (40 мг) и цианотригидридоборат натрия (15 мг) были растворены в метаноле (0,5 мл) и воде (0,5 мл), а затем перемешивали при 50°C в течение 6 часов. Завершение реакции подтверждали масс-спектрометрией.

Полученный продукт концентрировали при пониженном давлении и осадок растворяли в воде (2 мл). Затем смесь фильтровали через дисковый фильтр (изготовленный Nihon Pall Ltd., 0,45 мкм). Фильтрат подвергали гель-фильтрационной хроматографии (G-10, 16 мм × 600 мм, вода) для очистки, а затем конечные фракции подвергали сублимационной сушке с получением конечного продукта (8 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.43.

Пример получения 46

К 4-мерному олигосахариду гиалуронана (10 мг) добавляли раствор, в котором фенилаланин (5 мг), уксусная кислота (10 мкл), ацетат натрия (10 мг) и цианотригидридоборат натрия (10 мг) были растворены в метаноле (0,2 мл) и воде (0,2 мл), а затем перемешивали при 60°C в течение 6 часов. Завершение реакции подтверждали масс-спектрометрией.

Полученный продукт концентрировали при пониженном давлении, после чего к осадку добавляли дихлорметан (5 мл) в воду (5 мл) для экстрагирования. После концентрирования водной фазы при пониженном давлении, конечный продукт растворяли в воде (2 мл). Затем смесь фильтровали через дисковый фильтр (изготовленный Nihon Pall Ltd., 0,45 мкм). Фильтрат подвергали гель-фильтрационной хроматографии (G-10, 16 мм × 600 мм, вода) для очистки, а затем конечные фракции подвергали сублимационной сушке с получением конечного продукта (11 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.44.

Пример получения 47

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 46, за исключением того, что вместо фенилаланина использовали пролин, с получением конечного продукта (8 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.45.

Пример получения 48

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 46, за исключением того, что вместо фенилаланина использовали триптофан, с получением конечного продукта (7 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.46.

Пример получения 49

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 46, за исключением того, что вместо фенилаланина использовали амид глицилфенилаланина, с получением конечного продукта (4 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.47.

Пример получения 50

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 46, за исключением того, что вместо фенилаланина использовали фенилаланилглицин, с получением конечного продукта (14 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.48.

Пример получения 51

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 45, за исключением того, что в качестве исходного вещества вместо 4-мерного олигосахарида гиалуронана (10 мг) использовали 10-мерный олигосахарид гиалуронана (20 мг), и за исключением того, что вместо бензиламина использовали 4-хлоранилин, с получением конечного продукта (10 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.49.

Пример получения 52

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 45, за исключением того, что вместо 4-мерного олигосахарида гиалуронана использовали 10-мерный олигосахарид гиалуронана, и за исключением того, что вместо бензиламина использовали 2-аминопиридин, с получением конечного продукта (12 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.50.

Пример получения 53

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 46, за исключением того, что вместо 4-мерного олигосахарида гиалуронана использовали 10-мерный олигосахарид гиалуронана, и за исключением того, что вместо фенилаланина использовали фенилаланилглицилглицин, с получением конечного продукта (5 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.51.

Пример получения 54

Проводили тот же реакционный процесс, что и в примере получения 46, за исключением того, что вместо 4-мерного олигосахарида гиалуронана использовали 10-мерный олигосахарид гиалуронана, с получением конечного продукта (5 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.52.

Структуры конечных продуктов примеров получения с 45 по 54 представлены в таблице 7 ниже.

Примеры 1-48: получение соединений по настоящему изобретению

Способы в примерах 1-48, упомянутых ниже, использовали для получения соединений по настоящему изобретению, представленных в таблицах 8-14. Масс-спектрометрию проводили с использованием QSTAR pulsari (Applied Biosystems Japan Ltd.).

Пример 1

Соединение, синтезированное согласно примеру получения 1 (12 мг), растворяли в воде (1 мл) и к смеси добавляли трибутиламин (100 мкл), а затем перемешивали. После этого смесь концентрировали при пониженном давлении. К концентрату добавляли N,N-диметилформамид (2 мл), а затем два раза проводили азеотропную перегонку. Осадок растворяли в N,N-диметилформамиде (1 мл) и к продукту добавляли пиридин-триоксид серы (150 мг), а затем перемешивали при 42°C в течение 3 часов в атмосфере азота.

После охлаждения полученного продукта до 4°C к нему добавляли воду (1 мл), а затем добавляли насыщенный раствор ацетата натрия в этаноле (30 мл) для обеспечения осаждения. Раствор перемешивали с помощью смесителя Voltex, а затем полученный продукт подвергали центрифугированию при охлаждении (при 4°C, при 3000 об/мин и в течение 15 минут) для сбора осажденного вещества. Затем супернатант удаляли, добавляли воду (1 мл) для растворения осадка, а затем добавляли насыщенный раствор ацетата натрия в этаноле (20 мл) для обеспечения осаждения. Раствор перемешивали с помощью смесителя Voltex, а затем полученный продукт подвергали центрифугированию при охлаждении (при 4°C, при 3000 об/мин и в течение 15 минут) для сбора осажденного вещества. Снова после удаления супернатанта добавляли воду (1 мл) для растворения осадка, а затем добавляли насыщенный раствор ацетата натрия в этаноле (20 мл) для обеспечения осаждения. Раствор перемешивали с помощью смесителя Voltex, а затем полученный продукт подвергали центрифугированию при охлаждении (при 4°C, при 3000 об/мин и в течение 15 минут) для сбора осажденного вещества. Затем супернатант удаляли и осадок растворяли в воде (2 мл), а затем концентрировали при пониженном давлении.

Осадок растворяли в воде (2 мл), а затем фильтровали через дисковый фильтр (изготовленный by Nihon Pall Ltd., 0,45 мкм). Для нанесения фильтрата для гель-фильтрационной хроматографии (G-10, 16 мм × 600 мм, вода) для обессоливания использовали систему AKTA (изготовленную GE Healthcare Bioscience Bioprocess Corp.), а затем конечные фракции подвергали сублимационной сушке с получением соединения 1 (24 мг, белый порошок).

[M+2Na]²⁺: 994,75

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.53.

Пример 2

Проводили тот же процесс, что и в примере 1, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 2 (47 мг), с получением соединения 2 (76 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.54.

Пример 3

Проводили тот же процесс, что и в примере 1, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 3 (51 мг), с получением соединения 3 (108 мг, белый порошок).

[M+3Na]³⁺: 1210,10

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.55.

Пример 4

Проводили тот же процесс, что и в примере 1, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 4 (48 мг), с получением соединения 4 (92 мг, белый порошок).

[M+3Na]³⁺: 1479,73

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.56.

Пример 5

Проводили тот же процесс, что и в примере 1, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 5 (60 мг), с получением соединения 5 (112 мг, белый порошок).

[M+4Na]⁴⁺: 1317,74

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.57.

Пример 6

Проводили тот же процесс, что и в примере 1, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 6 (20 мг), с получением соединения 6 (22 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.58.

Пример 7

Соединение, полученное согласно примеру получения 7 (10 мг), растворяли в ,N-диметилформамиде (1 мл) и к полученному продукту добавляли пиридин-триоксид серы (150 мг), а затем смесь перемешивали при 42°C в течение 3 часов в атмосфере азота.

Полученный продукт охлаждали до 4°С, затем к полученному продукту добавляли воду (1 мл) и насыщенный раствор ацетата натрия в этаноле (25 мл) для обеспечения осаждения. Раствор перемешивали с помощью смесителя Voltex, а затем полученный продукт подвергали центрифугированию при охлаждении (при 4°C, при 3000 об/мин и в течение 15 минут) для сбора осажденного вещества. После этого супернатант удаляли, добавляли воду (1 мл) для растворения осадка, а затем добавляли насыщенный раствор ацетата натрия в этаноле (20 мл) для обеспечения осаждения. Раствор перемешивали с помощью смесителя Voltex, а затем полученный продукт подвергали центрифугированию при охлаждении (при 4°C, при 3000 об/мин и в течение 15 минут) для сбора осажденного вещества. Вновь, после удаления супернатанта добавляли воду (1 мл) для растворения осадка, а затем добавляли насыщенный раствор ацетата натрия в этаноле (20 мл) для обеспечения осаждения. Раствор перемешивали с помощью смесителя Voltex, а затем полученный продукт подвергали центрифугированию при охлаждении (при 4°C, при 3000 об/мин и в течение 15 минут) для сбора осажденного вещества. Затем после удаления супернатанта осадок растворяли в воде (2 мл), а затем проводили концентрирование при пониженном давлении.

Осадок растворяли в воде (2 мл), а затем фильтровали через дисковый фильтр (изготовленный Nihon Pall Ltd., 0,45 мкм). Для нанесения фильтрата для гель-фильтрационной хроматографии (G-10, 16 мм × 600 мм, вода) для обессоливания использовали систему AKTA (изготовленную GE Healthcare Bioscience Bioprocess Corp.), а затем конечные фракции подвергали сублимационной сушке с получением соединения 7 (16 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.59.

Пример 8

Проводили тот же процесс, что и в примере 7, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 8 (20 мг), с получением соединения 8 (33 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.60.

Пример 9

Проводили тот же процесс, что и в примере 1, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 9 (39 мг), с получением соединения 9 (90 мг, белый порошок).

[M+5Na]⁵⁺ : 1707,07

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.61.

Пример 10

Проводили тот же процесс, что и в примере 1, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 10 (24 мг), с получением соединения 10 (48 мг, белый порошок).

[M+3Na]³⁺ : 1493,42

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.62.

Пример 11

Проводили тот же процесс, что и в примере 1, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 11 (17 мг), с получением соединения 11 (34 мг, белый порошок).

[M+3Na]³⁺ : 1505,11

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.63.

Пример 12

Проводили тот же процесс, что и в примере 1, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 12 (10 мг), с получением соединения 12 (10 мг, белый порошок).

Пример 13

Проводили тот же процесс, что и в примере 1, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 13 (10 мг), с получением соединения 13 (21 мг, белый порошок).

Структура соединений с 1 по 13 представлена в таблице 8 ниже.

Пример 14

Соединение, полученное согласно примеру получения 14 (18 мг), растворяли в N,N-диметилформамиде (2 мл) и к нему добавляли пиридин-триоксид серы (300 мг), а затем перемешивали при 42°C в течение 3 часов в атмосфере азота.

После охлаждения полученного продукта до 4°C к полученному продукту добавляли воду (1 мл), а затем добавляли насыщенный раствор ацетата натрия в этаноле (25 мл) для обеспечения осаждения. Раствор перемешивали с помощью смесителя Voltex, а затем полученный продукт подвергали центрифугированию при охлаждении (при 4°C, при 3000 об/мин и в течение 15 минут) для сбора осажденного вещества. После этого супернатант удаляли, добавляли воду (1 мл) для растворения осадка, а затем добавляли насыщенный раствор ацетата натрия в этаноле (20 мл) для обеспечения осаждения. Раствор перемешивали с помощью смесителя Voltex, а затем полученный продукт подвергали центрифугированию при охлаждении (при 4°C, при 3000 об/мин и в течение 15 минут) для сбора осажденного вещества. Вновь после удаления супернатанта добавляли воду (1 мл) для растворения осадка, а затем добавляли насыщенный раствор ацетата натрия в этаноле (25 мл) для обеспечения осаждения. Раствор перемешивали с помощью смесителя Voltex, а затем полученный продукт подвергали центрифугированию при охлаждении (при 4°C, при 3000 об/мин и в течение 15 минут) для сбора осажденного вещества. Затем после удаления супернатанта осадок растворяли в воде (2 мл), а затем фильтровали через дисковый фильтр (изготовленный Nihon Pall Ltd., 0,45 мкм). Для нанесения фильтрата для гель-фильтрационной хроматографии (G-10, 16 мм × 600 мм, вода) для обессоливания использовали систему AKTA (изготовленную GE Healthcare Bioscience Bioprocess Corp.), а затем конечные фракции подвергали сублимационной сушке с получением соединения 14 (30 мг, белый порошок).

[M+2Na] ²⁺: 791,30

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.64.

Пример 15

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 15 (34 мг), с получением соединения 15 (72 мг, белый порошок).

[M+3Na] ³⁺: 804,83

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.65.

Пример 16

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 16 (8 мг), с получением соединения 16 (11 мг, белый порошок).

[M+3Na] ³⁺: 1074,42

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.66.

Пример 17

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 17 (8 мг), с получением соединения 17 (14 мг, белый порошок).

[M+3Na] ³⁺: 1344,06

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.67.

Пример 18

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 18 (16 мг), с получением соединения 18 (23 мг, белый порошок).

[M+4Na] ⁴⁺: 1217,00

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.68.

Пример 19

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 19 (11 мг), с получением соединения 19 (9 мг, белый порошок).

¹ H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.69.

Пример 20

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 20 (5 мг), с получением соединения 20 (8 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.70.

Пример 21

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 21 (8 мг), с получением соединения 21 (11 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.71.

Пример 22

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 22 (13 мг), с получением соединения 22 (14 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.72.

Структура соединений с 14 по 22 представлена в таблице 8 ниже.

Пример 23

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 23 (8 мг), с получением соединения 23 (14 мг, белый порошок).

[M+2Na]²⁺ : 793,81

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.73.

Пример 24

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 24 (4 мг), с получением соединения 24 (7 мг, белый порошок).

[M+2Na]²⁺ : 1176,25

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.74.

Пример 25

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 25 (8 мг), с получением соединения 25 (11 мг, белый порошок).

[M+3Na]³⁺ : 1076,10

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.75.

Пример 26

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 26 (15 мг), с получением соединения 26 (26 мг, белый порошок).

[M+3Na]³⁺ : 1345,72

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.76.

Пример 27

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 27 (7 мг), с получением соединения 27 (11 мг, белый порошок).

[M+4Na]⁴⁺ : 1616,67

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.77.

Пример 28

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 28 (5 мг), с получением соединения 28 (7 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.78.

Структура соединений с 23 по 28 представлена в таблице 10 ниже.

Пример 29

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 29 (9 мг), с получением соединения 29 (16 мг, белый порошок).

[M+2Na]²⁺ : 972,77

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.79.

Пример 30

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 30 (7 мг), с получением соединения 30 (8 мг, белый порошок).

[M+2Na]²⁺ : 1377,20

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.80.

Пример 31

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 31 (15 мг), с получением соединения 31 (21 мг, белый порошок).

[M+3Na]³⁺ : 1210,07

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.81.

Пример 32

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 32 (8 мг), с получением соединения 32 (9 мг, белый порошок).

[M+3H]³⁺ : 1458,34

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.82.

Пример 33

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 33 (5 мг), с получением соединения 33 (7 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.83.

Структура соединений с 29 по 33 представлена в таблице 11 ниже.

Пример 34

Соединение, синтезированное согласно примеру получения 36 (7 мг), растворяли в N,N-диметилформамиде (0,7 мл) и к нему добавляли триэтиламин-триоксид серы (75 мг) и трифторметансульфоновую кислоту (12 мкл), а затем перемешивали при 0°C в течение 48 часов в атмосфере азота.

После охлаждения полученного продукта до 4°C к полученному продукту добавляли воду (1 мл), а затем добавляли насыщенный раствор ацетата натрия в этаноле (25 мл) для обеспечения осаждения. Раствор перемешивали с помощью смесителя Voltex, а затем полученный продукт подвергали центрифугированию при охлаждении (при 4°C, при 3000 об/мин и в течение 15 минут) для сбора осажденного вещества. После этого супернатант удаляли, добавляли воду (1 мл) для растворения осадка, а затем добавляли насыщенный раствор ацетата натрия в этаноле (25 мл) для обеспечения осаждения. Раствор перемешивали с помощью смесителя Voltex, а затем полученный продукт подвергали центрифугированию при охлаждении (при 4°C, при 3000 об/мин и в течение 15 минут) для сбора осажденного вещества. Вновь после удаления супернатанта добавляли воду (1 мл) для растворения осадка, а затем добавляли насыщенный раствор ацетата натрия в этаноле (25 мл) для обеспечения осаждения. Раствор перемешивали с помощью смесителя Voltex, а затем полученный продукт подвергали центрифугированию при охлаждении (при 4°C, при 3000 об/мин и в течение 15 минут) для сбора осажденного вещества. Затем после удаления супернатанта осадок растворяли в воде (2 мл), а затем фильтровали через дисковый фильтр (изготовленный Nihon Pall Ltd., 0,45 мкм). Для нанесения фильтрата для гель-фильтрационной хроматографии (G-10, 16 мм × 600 мм, вода) для обессоливания использовали систему AKTA (изготовленную GE Healthcare Bioscience Bioprocess Corp.), а затем конечные фракции подвергали сублимационной сушке с получением соединения 34 (9 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.84.

Пример 35

Проводили тот же процесс, что и в примере 34, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 37 (10 мг), с получением соединения 35 (14 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.85.

Пример 36

Проводили тот же процесс, что и в примере 34, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 38 (10 мг), с получением соединения 36 (15 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.86.

Структура соединений с 34 по 36 представлена в таблице 12 ниже.

Пример 37

Проводили тот же процесс, что и в примере 34, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 41 (9 мг), с получением соединения 37 (11 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.87.

Пример 38

Проводили тот же процесс, что и в примере 34, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 44 (12 мг), с получением соединения 38 (20 мг, желтый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.88.

Структура соединений 37 и 38 представлена в таблице 13 ниже.

Пример 39

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 45 (8 мг), с получением соединения 39 (12 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.89.

Пример 40

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 46 (10 мг), с получением соединения 40 (16 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.90.

Пример 41

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 47 (8 мг), с получением соединения 41 (14 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.91.

Пример 42

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 48 (7 мг), с получением соединения 42 (12 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.92.

Пример 43

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 49 (4 мг), с получением соединения 43 (9 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.93.

Пример 44

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 50 (10 мг), с получением соединения 44 (24 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.94.

Пример 45

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 51 (10 мг), с получением соединения 45 (21 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.95.

Пример 46

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 52 (12 мг), с получением соединения 46 (15 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.96.

Пример 47

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 53 (5 мг), с получением соединения 47 (9 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.97.

Пример 48

Проводили тот же процесс, что и в примере 14, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали соединение, полученное согласно примеру получения 54 (5 мг), с получением соединения 48 (9 мг, белый порошок).

¹H-ЯМР: диаграмма проиллюстрирована на ФИГ.98.

Структура соединений 37 и 38 представлена в таблице 14 ниже.

Справочные примеры с 1 по 7

Соединения (известные соединения) по настоящему изобретению, представленные в таблице 15, получали способом, описанным в документе, Glycobiology, vol. 11, No. 1, pp. 57 to 64, 2001.

Справочный пример 1

Гиалуронат натрия (BIO Sodium Hyaluronate HA9, изготовленный Shiseido Co., Ltd.) подвергали расщеплению полученной из семенников быка гиалуронидазой (Hyaluronidase Bovine 100KU, изготовлена Calbiochem Behring Corporation), способом, описанным в Glycobiology, vol. 12, No. 7, pp. 421 to 426, 2002, с получением 4-мерного олигосахарида гиалуронана. 4-мерный олигосахарид гиалуронана (20 мг) использовали в качестве исходного вещества для проведения получения согласно указанному выше документу Glycobiology, vol. 11, No. 1, pp. 57 to 64, 2001, с получением соединения 49 (21 мг, белый порошок).

Справочный пример 2

Проводили тот же реакционный процесс, что и в справочном примере 1, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 10-мерный олигосахарид гиалуронана (43 мг), с получением соединения 50 (86 мг, белый порошок).

Справочный пример 3

Проводили тот же реакционный процесс, что и в справочном примере 1, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 16-мерный олигосахарид гиалуронана (75 мг), с получением соединения 51 (80 мг, белый порошок).

Справочный пример 4

Проводили тот же реакционный процесс, что и в справочном примере 1, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 20-мерный олигосахарид гиалуронана (23 мг), с получением соединения 52 (42 мг, белый порошок).

Справочный пример 5

Проводили тот же реакционный процесс, что и в справочном примере 1, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 22-мерный олигосахарид гиалуронана (17 мг), с получением соединения 53 (25 мг, белый порошок).

Справочный пример 6

Проводили тот же реакционный процесс, что и в справочном примере 1, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 24-32-мерный олигосахарид гиалуронана (20 мг), с получением соединения 54 (18 мг, белый порошок).

Справочный пример 6

Проводили тот же реакционный процесс, что и в справочном примере 1, за исключением того, что в качестве исходного вещества использовали 34-46-мерный олигосахарид гиалуронана (24 мг), с получением соединения 55 (39 мг, белый порошок).

Структура соединений с 49 по 55 представлена в таблице 15 ниже.

Тестовый пример 1: Противоаллергическое действие; модель аллергического ринита у морских свинок (модель носовой обструкции)

В экспериментах использовали морских свинок Hartley (самцы, возраст 6 или 7 недель в момент первой сенсибилизации).

После получения животных их предварительно выдерживали в течение 7 суток или более для карантина и акклиматизации перед использованием в экспериментах.

В качестве первой сенсибилизации в спину каждого животного вводили физиологический раствор, содержащий овальбумин (OVA, 1 мг) и гель гидроксида алюминия (квасцы, 10 мг) в количестве 1 мл на животное. Затем в обе носовые полости животного с помощью микропипетки вводили физиологический раствор, содержащий 10 мг/мл OVA, в количестве 20 мкл каждого, один раз (т.е. одна неделя после первой сенсибилизации) или два раза (т.е. одна неделя и две недели после первой сенсибилизации), чтобы тем самым провести местную сенсибилизацию.

Разделение животных на группы проводили с использованием способа двумерной стратифицированной случайной выборки, на основе их массы тела в день завершения сенсибилизации и изменений массы тела со дня начала сенсибилизации до дня окончания сенсибилизации в качестве показателей.

Через одну неделю после последней сенсибилизации в обе носовые полости животного вводили физиологический раствор, содержащий 20 мг/мл OVA, в количестве 10 мкл, индуцируя реакцию антиген-антитело. Аналогично, в контрольной группе (группа без индуцирования) вводили физиологический раствор.

За 30 до начала индукции в обе носовые полости животного вводили 10 мкл каждого из тестируемых веществ. Каждое из тестируемых веществ растворяли в физиологическом растворе для применения в качестве раствора для введения, имеющего концентрацию 500 мкг/мл. Аналогично, в контрольной группе (группа без индуцирования) и в группе физиологического раствора (контрольная группа растворитель) вводили физиологический раствор. В качестве контрольного средства (не содержащего соединения) использовали "Flunase" (изготовленный GlaxoSmithKline K.K.).

Измерение резистентности носовых дыхательных путей проводили до индукции, через 10 минут, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов и 7 часов после индукции в день индукции. Резистентность носовых путей (nRaw) в течение 100 вдохов измеряли один раз в каждый период измерения и среднюю величину результатов определяли в качестве nRaw в каждый период измерения. Вычисляли скорость повышения nRaw для применения в качестве показателя резистентности носовых дыхательных путей.

Скорость повышения (%) резистентности носовых путей (nRaw) вычисляли, исходя из следующего уравнения.

Скорость повышения nRaw в каждый период измерения

R₀: nRaw до индукции

R_x: nRaw в каждый период измерения (на x часов позднее)

Оценку проводили, исходя из скорости повышения nRaw через 10 минут после индукции (резистентность носовых дыхательных путей немедленного типа) и площади под кривой скорости повышения nRaw от 3 до 7 часов после индукции (AUC _{3-7 ч}, замедленная резистентность носовых дыхательных путей)

I_{3-7 ч}: скорость повышения nRaw от 3 до 7 часов после индукции

Результаты представлены на ФИГ.99 и 100.

На ФИГ.99 и 100 показано, что соединения по настоящему изобретению проявляют эффект ингибирования на аллергический ответ немедленного типа и эффект ингибирования на замедленный аллергический ответ.

Тестовый пример 2: Эффект ингибирования пассивной кожной анафилаксии (PCA)

В экспериментах использовали морских свинок Hartley (самцы, 5 недель или старше).

Антисыворотку против OVA, полученную иммунизацией морской свинки посредством OVA, разбавляли в 500 раз физиологическим раствором (раствор A).

Каждое из тестируемых веществ, приведенных в таблице 16 ниже, разбавляли до 200 мкг/мл физиологическим раствором (раствор B).

Раствор B смешивали с раствором, полученным разбавлением антисыворотки морских свинок против OVA в 250 раз в эквивалентном количестве, и конечную концентрацию смеси доводили до 100 мкг/мл для тестируемого вещества и до 500-кратной для антисыворотки против OVA (раствор C).

После эфирного наркоза морской свинке внутрикожно инъецировали 100 мкл физиологического раствора, раствора A или раствора C в область на спине, где была сбрита шерсть.

Приблизительно через 3 часа морской свинке внутривенно вводили физиологический раствор с 0,5% Evans blue, содержащий от 0,2 до 0,4% OVA в количестве от 0,8 до 1 мл/организм.

Не позднее 30 минут проводили кровопускание и у морской свинки снимали кожу. Затем определяли количество пигмента в каждом пятне посредством обработки изображений. При обработке изображений количество пигмента на пятне, где вводили только антисыворотку против OVA, определяли как 100% и, исходя из определения, оценивали степень подавления, вызванную тестируемым веществом. Результаты представлены в таблице 16 (N=3 или 6).

Случай, когда просачивание пигмента составляло 80% или более, указывая на отсутствие ингибирующего эффекта на PCA, обозначен как "D"; случай, когда просачивание пигмента составляет от 60 до 80%, обозначен как "C" (процент подавления: от 20 до 40%); случай, когда просачивание пигмента составляет от 30 до 60% (процент подавления: от 40 до 70%), обозначен как "B"; и случай, когда просачивание пигмента составляет менее 30%, обозначен как "A".

Таблица 16 выше показывает, что соединения по настоящему изобретению демонстрируют эффект подавления PCA.

Тестовый пример 3: Тест активности повышения проницаемости сосудов

В экспериментах использовали морских свинок Hartley (самцы, 5 недель или старше).

Тестируемое вещество разбавляли физиологическим раствором до 100 мкг/мл.

Далее в качестве контроля использовали сульфатированную гиалуроновую кислоту (смесь тетрасахарида с почти гептаконтасахаридом, синтезированным согласно примеру (пример получения 1) JP-A-1999-147901, или сходным с ним).

После эфирного наркоза морской свинке внутрикожно инъецировали 100 мкл физиологического раствора или физиологического раствора, содержащего тестируемое вещество, в область на спине, где была сбрита шерсть.

Морской свинке внутривенно вводили физиологический раствор с 0,5% Evans blue в количестве от 0,8 до 1 мл/организм.

Не позднее 30 минут проводили кровопускание и у морской свинки снимали кожу. Затем определяли количество пигмента в каждом пятне посредством обработки изображений.

Количество пигмента в области, где вводили декстрансульфат 10000, определили как 100%, и, исходя из этого определения, результаты обработки представлены в качестве скорости проницаемости сосудов тестируемого вещества на ФИГ.101-103.

На ФИГ.101-103 показано, что соединения по настоящему изобретению, в отличие от известной полимерной полисульфатированной гиалуроновой кислоты, не обладают активностью в отношении повышения проницаемости сосудов и не проявляют стимулирующего действия, которое само по себе является побочным эффектом.

Тестовый пример 4: Длительная стабильность (в водном растворе)

Водные растворы, содержавшие соединение 4 и соединение 50 в количестве 1 мг/мл, подготавливали для проведения анализа ВЭЖХ.

Каждый из этих растворов хранили в холодном месте (от 2 до 8°C) и при комнатной температуре и подвергали зависимому от времени анализу ВЭЖХ вплоть до 4 месяцев для проверки изменения паттерна пиков каждого раствора.

Условия ВЭЖХ:

Колонка: Mightysil RP-18 GP (3 мкм, 4,6 мм × 50 мм)

Температура колонки: 40°C

Подвижная фаза A: 20 мМ KH₂PO₄/MeCN (70:30), содержащая 2 мМ TBAP

Подвижная фаза : 20 мМ KH₂PO₄ (80:20), содержащая MeCN/2 мМ TBAP

Условия градиента: Начальный; A: 100%, B: 0%, от 0 до 20 минут; A: от 100 до 95%, B: от 0 до 5%, линейный

Скорость потока: 1 мл/мин

Детекция: УФ (210 нм)

Инъецированное количество: приблизительно 5 мкг/5 мкл (TBAP: фосфат тетрабутиламмония)

Результаты представлены в таблице 17.

Таблица 17
Условия хранения и период хранения	Соединение 4		Соединение 50
В начале теста	Наблюдали один главный пик и плечевые пики, и соотношение площадей основного пика и плечевых пиков составляло приблизительно 5 к 1		Наблюдали главным образом три пика, и соотношение площадей второго пика и третьего пика составило приблизительно 1 к 4
В холодном месте в течение 4 месяцев	Не было изменения в паттерне пиков по сравнению с паттерном в начале теста	Соотношение площадей второго пика и третьего пика составило приблизительно 1 к 1
При комнатной температуре в течение 10 суток	-*	Соотношение площадей второго пика и третьего пика составило приблизительно 3 к 2
При комнатной температуре в течение 4 месяцев	Не было изменения в паттерне пиков по сравнению с паттерном в начале теста	-**
-: Тест не проводили. *: Не было изменения в паттерне пиков по сравнению с паттерном в начале теста, когда раствор хранили при комнатной температуре в течение 7 суток. **: Когда раствор хранили при комнатной температуре в течение 10 суток, было выявлено, что раствор был, очевидно, нестабильным, и, таким образом, тест сразу завершили.

Представленная выше таблица 17 показывает, что не наблюдали изменения в паттерне пиков для соединения 4 после хранения при комнатной температуре в течение 4 месяцев, и таким образом, соединение 4 является стабильным в водном растворе, в то время наблюдали зависимое от времени повышение площади второго пика и зависимое от времени снижение площади третьего пика среди трех основных пиков соединения 50, даже несмотря на то, что его хранили в холодном месте, и, таким образом, соединение 50 является нестабильным в водном растворе.

Среди низкомолекулярных полисульфатированных производных гиалуроновой кислоты группа соединений, соответствующая общей формуле (IA)а, где Y соответствует формуле (d) или (e), или группа соединений, соответствующая общей формуле (IB), особенно пригодна в качестве соединения, являющегося стабильным в водном растворе.

Промышленная применимость

Низкомолекулярное полисульфатированное производное гиалуроновой кислоты или его фармацевтически приемлемая соль по настоящему изобретению демонстрирует слабую активность в отношении повышения проницаемости сосудов (обеспечивающего воспалительное побочное действие в небольшой степени), и, таким образом, его можно использовать в качестве в значительной степени безопасного средства для профилактики и/или лечения аллергического заболевания.